Summary
Denne artikel viser, hvordan musen embryonale baghjernen kan bruges som model for at studere udviklingsmæssige neurogenese i både hele orgel og væv afsnit præparater.
Abstract
Musen embryo forhjernen er den hyppigst ansat system for at studere pattedyr neurogenese under udvikling. Dog er stærkt foldede forhjernen neuroepithelium ikke indstillet til wholemount analyse for at undersøge organ-dækkende neurogenese mønstre. Derudover er definerer mekanismerne af forhjernen neurogenese ikke nødvendigvis prædiktive af neurogenese i andre dele af hjernen; for eksempel på grund af tilstedeværelsen af forhjernen-specifikke stamfader undertyper. Musen baghjernen giver en alternativ model for at studere embryonale neurogenese, der er modtagelig for wholemount analyse, samt væv sektioner til at observere spatiotemporelle distribution og opførsel af neurale stamceller. Desuden er det let dissekeret til andre downstream applikationer, såsom celle isolation eller Molekylærbiologi analyse. Da musen baghjernen kan let analyseres i utal af celle lineage reporter og mutant musen stammer, der er blevet ledige, giver det en kraftfuld model til at studere de cellulære og molekylære mekanismer af udviklingsmæssige neurogenese i et pattedyr organisme. Her præsenterer vi en enkel og hurtig metode for at bruge musen embryo baghjernen til at analysere pattedyr neurale stamceller celle (NPC) adfærd i wholemount præparater og væv sektioner.
Introduction
Under pattedyr fosterudviklingen opdele NPCs i ventrikel (VZ) og subventricular (SVZ) zoner af den ekspanderende neuroepithelium til at generere nye neuroner i en proces, der kaldes 'neurogenese'. Generation af nye neuroner og deres prækursorer for NPC er blevet undersøgt udførligt i forhjernen1, mens mindre vides om denne proces i andre regioner.
Forebrain er en kompleks og kringlet foldede struktur, der er i vid udstrækning studerede med histologiske metoder efter væv skæring, og som gør forståelse neurogenese mønstre på tværs af hele orglet udfordrende. Desuden, er undersøgelser af forhjernen neurogenese ikke nødvendigvis prædiktive neurogen adfærd i andre områder af hjernen eller rygmarven. For eksempel, signalering stikord kan fremkalde forskellige svar på tværs af forskellige CNS regioner, som observerede ciliaere neurotrope faktor og leukæmi hæmmende faktor, som fremmer selvfornyelse af NPCs i laterale ganglionære eminence, men drev differentiering af rygmarven stamfaderen2. Derudover en underklasse af NPC'ere, der befolker udvikle forebrain og bidrage væsentligt til udvidelse af hjernebarken1 er fraværende fra baghjernen og rygmarven3. Omvendt, er det tænkeligt, at rygmarven og baghjernen indeholder alternative NPC undertyper ikke til stede i cortex.
Musen embryo baghjernen er den evolutionære ældste region af hjernen, pattedyr og genererer lillehjernen og hjernestammen. På trods af dens bevaring på tværs af arter, er relativt lidt kendt om baghjernen neurogenese, herunder NPC undertyper eller deres regulering. Fleste af baghjernen forskning i musen har fokuseret på processen med væv segmentering, drevet af Hox gener4og mønstret af post mitotiske neuroner5. Derudover har baghjernen været brugt som en model til at studere mekanismerne af udviklingsmæssige angiogenese6.
I modsætning til musen baghjernen, er zebrafisk baghjernen blevet brugt flittigt til at følge NPC differentiering og afstamning progression i en hvirveldyr model organisme (fx,7,8). Chick baghjernen har også været ansat til at studere neurogenese under hvirveldyr udvikling (f.eks.,9,10). Lig zebrafisk baghjernen11, chick baghjernen kan være levende afbildet for at studere NPC adfærd og forordning over tid12. Analoge langsgående observation af live imaging er ikke i øjeblikket muligt i pattedyr organismer, fordi de udvikler in utero. Derudover målrettet manipulation gennem teknikker såsom elektroporation let kan anvendes til fritlevende zebrafisk embryoner eller chick embryoner i ovo (f.eks.,13), men disse teknikker er også mere udfordrende i utero.
Ikke desto mindre er mus embryo baghjernen udsøgt egnet til at definere de molekylære og cellulære mekanismer, der styrer neurogenese. Analyse af musen baghjernen vil for det første, i mange tilfælde give oplysninger, der er mere relevant for mennesker udvikling end der opnås via studier af lavere hvirveldyr. Desuden et utal af genmodificerede mus stammer er tilgængelige, kan enten anvendes til skæbne kortlægning murine NPCs eller at ændre reguleringsmekanismer med konstitutiv eller betinget mutante alleler af relevante gener. Endelig, det har for nylig vist sig at mikroinjektion af ventrikulær baghjernen stamfaderen ex vivo giver mulighed for i det mindste en kort gennemgang af baghjernen NPC kinetik14. Endnu i dag, meget lidt er kendt om spatiotemporelle organisation og opførsel af baghjernen NPCs i forbindelse med hele orgel.
Her viser vi en enkel og hurtig metode til at bruge baghjernen som en kraftfuld model til at analysere pattedyr NPC adfærd i wholemount præparater og væv sektioner. Vi leverer yderligere protokoller for at bruge immunolabeling til at studere forskellige neurogenese parametre og at processen baghjernen prøver yderligere til downstream molekylære applikationer såsom kvantitative reverse transkriptase (qRT)-PCR.
Protocol
Alle dyr arbejde blev udført i overensstemmelse med britiske Home Office og lokale etiske retningslinjer.
1. Resumé af trin og Timing
- Udføre timet parringer af voksen mus fra en stamme egnet til at besvare den biologiske spørgsmål under undersøgelsen at opnå embryonale dag (e) 9,5-e13.5 graviditeter; kræver 12-15 dage.
- Eventuelt forberede 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) / 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) løsning og udføre injektion (protokollen afsnit 2); kræver ~ 1 h dagen før eller på dagen for embryo isolation, afhængigt af den ønskede længde af EdU/BrdU mærkning.
- Udføre embryo isolation og baghjernen dissektion (protokollen afsnit 3); kræver ~ 10 min/embryoner.
- Udføre wholemount immunofluorescens mærkning (protokollen afsnit 4); kræver 3 dage.
- Afsnit ved hjælp af en vibratome og udføre flydende afsnit immunofluorescens mærkning (protokollen afsnit 4): kræver 2 dage.
- Afsnit ved hjælp af en kryostaten og udføre immunofluorescens mærkning af snit frosset organmateriale (protokollens punkt 5); kræver 2 dage.
2. injicere gravid kvinde mus med BrdU eller EdU (valgfri)
- Opløse BrdU eller EdU i sterile fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til koncentrationer af 10 mg/mL og 1 mg/mL, henholdsvis.
Forsigtig: BrdU og EdU er giftige; bær passende beskyttelse. - Vejer den gravide mus og beregne mængden af BrdU eller EdU løsning, der skal gives for at nå 100 mg/kg BrdU eller 5 mg/kg EdU.
- Injicere BrdU eller EdU løsning gennem ruten intraperitoneal enten 1 h eller 1 dag før indsamling af embryoner, afhængigt af den ønskede længde af mærkning.
Bemærk: Mærkning for 1 h visualiserer baghjernen celler i S-fase. Mærkning i 1 dag visualiserer afkommet af baghjernen NPCs.
3. dissektion af Hindbrains fra e9.5 - e13.5 musen embryoner
- Aflive en tidsindstillet-gravid kvinde mus ved hjælp af en etisk godkendt procedure i den krævede svangerskabsuge fase (fx, cervikal dislokation). Ved hjælp af skarpe saks, skåret åben bughulen og punktafgifter omhyggeligt livmoderen. Placer fjernet livmoderen indeholdende embryoner i en 60 mm plastik skål indeholdende 20 mL iskold PBS.
Bemærk: Aseptisk teknik er ikke påkrævet. - Udføre alle yderligere dissektion ved hjælp af en dissekere mikroskop. Ved hjælp af urmager pincet nummer 5, rive uterin musklen væggen for at afsløre embryonerne, frigive hver embryo ved at bryde navlestrengen og fjerne blommesækken.
- Ved hjælp af en steril Pasteur pipette med en wide-boring åbning, overføre hver embryo i en ren plastik skål med iskoldt PBS.
- Ved hjælp af urmager pincet nummer 55 sever hoved (figur 1E).
- Du kan eventuelt beholde et lille stykke væv (f.eks, ¼ af en blommesækken eller ca 2 mm halespids) for genomisk DNA isolation og efterfølgende genotypebestemmelse.
- Ved hjælp af urmager pincet nummer 55, punktafgifter væv indeholdende baghjernen parallel til og straks nedenfor baghjernen neuroepithelium til at adskille det fra ansigtet og forhjernen væv (figur 1F).
- Placer baghjernen og caudale hoved væv dorsale side op og identificere den 4th ventrikel, som er dækket af en tynd væv lag (topplade). Omhyggeligt gennembore topplade ved hjælp af urmager pincet nummer 55 (figur 1 g) og skræl væk overskydende væv med pincet, flytte rostrally langs midterlinjen over midthjernen, og derefter caudally over den bageste baghjernen og rygmarven (figur 1 g ); baghjernen skal nu udsættes i en åben bog forberedelse (figur 1 H).
- Forberede hindbrains for wholemount immunolabeling (mulighed 1).
- Ved hjælp af urmager pincet nummer 55, omhyggeligt drille lager resterende hoved udkom og enhver meninges knyttet til pial side af baghjernen bruge pincet (figur 1I). Fjerne midthjernen og rygmarv væv (figur 1J) for at forlade kun baghjernen væv (figur 1 K).
Bemærk: Dette trin af proceduren ikke følges på e9.5 eller e10.5, fordi du forsøger at gøre det ville sandsynligvis skade baghjernen neuroepithelium; Desuden er fjerner meninges ikke afgørende, fordi baghjernen neuroepithelium er tilstrækkelig tynd på nuværende tidspunkt at tillade effektiv penetration af antistoffer til immunolabeling. Dette skridt bør imidlertid, følges fra e11.5 og fremefter, når de meningeal væv konsoliderer, for at styrke antistof indtrængen i baghjernen neuroepithelium. Dissektion er nemmest, når de udføres i iskold PBS (brug ren PBS for hver baghjernen).
- Ved hjælp af urmager pincet nummer 55, omhyggeligt drille lager resterende hoved udkom og enhver meninges knyttet til pial side af baghjernen bruge pincet (figur 1I). Fjerne midthjernen og rygmarv væv (figur 1J) for at forlade kun baghjernen væv (figur 1 K).
- Forberede hindbrains for vibratome og cryosectioning (mulighed 2)
- Ved hjælp af urmager pincet nummer 55, fjerne midthjernen og rygmarv væv (figur 1J).
Bemærk: Det er ikke nødvendigt at fjerne udkom og meninges af hindbrains beregnet til skæring (som vist i figur 1I).
- Ved hjælp af urmager pincet nummer 55, fjerne midthjernen og rygmarv væv (figur 1J).
- Overføre hindbrains fra plast skålen til rundbundet 2 mL rør ved hjælp af Pasteurs pipette, Aspirér alle PBS og fix i 2 timer ved 4° C med blid-agitation i frisk optøede 4% w/v formaldehyd opløst i PBS.
Forsigtig: Formaldehyd er giftige; bær passende beskyttelse. - Skyl hindbrains 3 x gange med PBS. Opbevares ved 4 ° C i PBS, hvis immunolabeling vil begynde indenfor 2-3 dage eller erstatte PBS med 50% methanol/50% PBS for 5 min før du overfører til 100% methanol til længere opbevaring ved-20° C.
4. Wholemount immunfluorescens
- Hvis det er påkrævet, Rehydrér hindbrains i seriefremstillede faldende fortyndinger af methanol i PBS (f.eks.75% methanol, 50% methanol, 25% methanol) ved stuetemperatur (RT) for 5 min og derefter overføre til PBS.
Bemærk: En gradueret serie af methanol er forpligtet til at forsigtigt Rehydrér hindbrains og sikre ordentlig væv bevarelse. - Permeabilize hindbrains for 30 min. ved 4 ° C i PBS, som indeholder 0,1% Triton X-100 (PBT) med blid agitation.
- Inkubér hindbrains 1 h ved 4 ° C i PBT indeholdende 10% varme-inaktiverede ged serum med blid agitation.
Bemærk: Brug serum fra værten arter, som de sekundære antistoffer er blevet rejst i. For primære antistoffer rejst i ged, inkuberes i serumfrit protein blokere for eksempel 5% bovint serumalbumin i PBS eller en egnet kommerciel alternativ (Se Tabel af materialer). Dette vil reducere uspecifik farvning ofte observeret ved brug af primære antistoffer rejst i ged. - Inkubér hindbrains natten over ved 4 ° C i PBT indeholdende 1% varme-inaktiverede serum og primære antistoffer med blid agitation (fx, kanin anti-phospho Histon H3 [pHH3] fortyndet 1: 400).
Bemærk: For primære antistoffer rejst i ged, bruge PBT uden serum. - Vask af hindbrains ved 4 ° C 5 x med PBT for 1 h.
- Inkubér hindbrains natten over ved 4 ° C i PBT indeholdende relevante fluorophore-konjugeret sekundære antistoffer (f.eks., ged anti-kanin Alexa Fluor 488) på 1:200 i PBT rettet mod de primære antistoffer bruges. Holde hindbrains i mørke herfra at beskytte fluorophores mod photobleaching.
Bemærk: For primære antistoffer rejst i ged, bruge anti-ged Fab fragmenter af sekundære antistoffer til at reducere uspecifik farvning. - Vask af hindbrains ved 4 ° C 5 x med PBT for 1 h.
- Postfix hindbrains i 4% formaldehyd i PBS for 15 min på RT for langsigtet præservering af antistof bindende. Kort skylles to gange i PBS.
- Dække et glas objektglas med to lag af sort elektrisk tape og punktafgifter en lille firkant fra lagdelt båndet til at skabe en lomme stor nok til at holde en baghjernen.
- Overføre hver baghjernen ind i en lomme med Pasteur pipette, fjerne overskydende væske og tilføje en passende antifade reagens til lommen før dækker det langsomt med et glas coverslip at undgå fældefangst luftbobler under coverslip. Forsegle coverslip og anbringer det til dias med et tyndt lag af neglelak. Gem dias ved 4 ° C i mørke indtil billede erhvervelse (protokollen afsnit 7).
5. Vibratome skæring og flydende afsnit immunfluorescens
- Hvis det er påkrævet, Rehydrér hindbrains fra methanol som beskrevet i trin 4.1.
- Integrere hindbrains i smeltet 3% w/v Agarosen forberedt i destilleret vand.
Bemærk: Tillad smeltet Agarosen afkøles til ca. 55° C kort før indlejring for at undgå varmeskader baghjernen. - Skær tværgående baghjernen sektioner til en tykkelse på 70 µm ved hjælp af en vibratome. Overføre hver frisk snit sektion med en pensel i en brønd på en 24-godt plade der indeholder iskold PBS.
- Mærke de flydende sektioner, som beskrevet i trin 4.2-4.7, men ændre fremgangsmåden som følger: vask den flydende sektioner ved 4 ° C 3 x med PBT for 15 min. hver, mindske inkubationstiden for sekundære antistoffer til 2 h, og der inkuberes i sekundær antistof på RT.
- Du kan eventuelt efter mærkning med antistoffer for andre epitoper, som beskrevet i trin 5.4, opdage EdU+ kerner ved hjælp af en EdU mærkning kit ifølge producentens anvisninger. Inkuber de flydende sektioner i reaktionen cocktail i 30 minutter ved 37 ° C i mørke. Vask baghjernen sektioner ved 4 ° C 3 x med PBT i 15 min.
- Du kan eventuelt efter mærkning for andre epitoper, som beskrevet i trin 5.4, opdage kerner BrdU+ som følger.
- Inkuber flydende sektioner i 2 N saltsyre ved 37 ° C i 30 min. i mørke.
- Inkuber flydende sektioner i 0,1 M natriumborat buffer pH 8,5 to gange for 5 min hver på RT i mørke til at neutralisere saltsyre.
- Vask flydende afsnit 3 x kort i PBS ved 4 ° C.
- Udføre immunofluorescens mærkning for BrdU som beskrevet i trin 5.4.
- Inkuber de flydende sektioner for 2 min på RT i 10 µg/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid (DAPI) i PBS til kontrastfarve cellekerner.
- Postfix flydende sektionerne i 4% formaldehyd for 15 min på RT.
- Vask flydende sektioner kort i PBS. Omhyggeligt overføre flydende sektioner til et glas objektglas ved hjælp af et paintbrush. Moppe op overskydende PBS omkring afsnittet Brug af trækpapir eller væv.
- Montere sektioner ved hjælp af 80% glycerol i PBS og dække langsomt med et glas coverslip for at undgå fældefangst luftbobler. Gem dias ved 4 ° C i mørke indtil billede erhvervelse (trin 7).
6. kryostater skæring og Cryosection immunofluorescens mærkning
- Hvis det er påkrævet, Rehydrér hindbrains fra methanol som beskrevet i trin 4.1.
- Inkubér hindbrains i 30% w/v saccharose i PBS cryoprotect hindbrains før frysning.
Bemærk: Hindbrains er klar til frysning når de er sunket til bunden af røret, hvilket typisk tager ≤ 2 h til e9.5-10.5 hindbrains og 3-6 h til e11.5-13,5 hindbrains. - Dykke hindbrains i optiske skære temperatur sammensatte (OCT) og fryse hurtigt ved at overføre forme indeholdende hindbrains i OLT til isopentane nedkøles til mellem 40 ° C og -50 ° C på tøris.
Bemærk: Frosne, integrerede hindbrains kan opbevares ved-20 ° C kort sigt og-80 ° C lang sigt indtil skæring. - Skær tværgående baghjernen sektioner til en tykkelse på 10 µm ved hjælp af en kryostaten og overførsel til elektrostatisk klæbende objektglas.
Bemærk: Baghjernen snit frosset organmateriale kan opbevares ved-20 ° C kort sigt og-80 ° C lang sigt indtil mærkning. - Inkuber dias på RT for 15 min tørre sektioner til dias. Vaske snit frosset organmateriale med PBS til at opløse OCT og mark en hydrofobe barriere omkring snit frosset organmateriale ved hjælp af en PAP pen. Gentag trin 5.4-5.8.
- Gentag trin 5.10 bruge en polyvinyl alkohol-baserede montering medium i stedet for glycerol.
7. billede erhvervelse
- Billede prøver ved hjælp af en epifluorescerende eller Konfokal laser-scanning mikroskop udstyret med linser egnet til vandige medier monterede dias og optiske filtre egnet til fluorophores anvendes til immunolabeling.
- For at billed den hele baghjernen eller en baghjernen sektion, bruge en linse til 10 x forstørrelse (f.eks. figur 2B); for at visualisere hindbrains områder for kvantificering, bruge en 40 X forstørrelse (f.eks. figur 2D) og at visualisere individuelle celler, bruge en linse med 63 x forstørrelse (f.eks. figur 2 c).
8. alternative metoder
- Efter trin 3.8, homogeniseres ikke optagne hindbrains til at producere en enkelt cellesuspension til flowcytometri programmer15.
- Efter trin 3.8, homogeniseres ikke optagne hindbrains at udvinde RNA fra enkelt celle suspensioner for RT-qPCR (f.eks., 16).
Bemærk: Sikre alle reagenser og udstyr holdes sterilt og RNase-fri i hele at forhindre nedbrydning af RNA. - Efter trin 3.8, homogeniseres ikke optagne hindbrains for at isolere NPCs og udbrede dem i vitro som neurospheres for analyse af baghjernen NPC adfærd17.
Bemærk: Sikre alle reagenser og udstyr holdes sterilt at forhindre bakteriel/svampe forurening af neurosphere kulturer.
Representative Results
Dette afsnit illustrerer eksempler på resultater, der kan opnås ved at studere neurogenese i mus embryonale baghjernen gennem wholemount og væv afsnit analyse.
Vi viser at wholemount immunolabeling af microdissected baghjernen med et antistof for mitotiske markør pHH3 visualiserer dividere NPCs i VZ (figur 2B - D). Vi viser pHH3+ NPCs på en høj forstørrelse at fremhæve forskellige faser i mitosen (figur 2 c). Vi har vist, at denne mærkning metode er egnet til at blive udført på tværs af flere på hinanden følgende faser af baghjernen udvikling at observere tidsforløb i NPC mitosen i dette organ (figur 2D).
Vi viser, at imaging tværgående immunolabeled vibratome sektioner af baghjernen 1 h efter EdU injektion, visualiserer kavalergang orientering af mitotiske NPCs (figur 3B), pseudostratified, interkinetic nukleare migration mønster af cykling ophavene18 (figur 3B, D), og den overordnede VZ struktur (figur 3B - D). Bemærk at mitotiske pHH3+ NPCs findes kun på den ventrikulære overflade og ikke mere basalt (figur 3 c), som står i kontrast basal division mønster af mere engagerede NPCs i forhjernen19.
Vi har også illustrere, hvordan cykling NPCs og deres differentieret afkom kan være mærket med BrdU eller EdU at vurdere NPC lineage progression (figur 4). Immunolabeling af tværgående snit af musen baghjernen 1 dag efter BrdU injektion for BrdU og Ki67 frosset organmaterialeviser antallet og placeringen af cykling NPCs i neuroepithelium (figur 4A, B), hvorved antallet af selvstændig fornyelse NPCs kan defineres ved at beregne procentdelen af Ki67+ BrdU+ celler blandt alle BrdU+ celler (figur 4A, C).
Endelig viser vi et eksempel på immunolabeling i baghjernen vibratome sektioner for RC2, en antigen i neurale-specifikke mellemliggende glødetråden nestin, for at visualisere NPC endfeet (figur 5B) og processer (figur 5 c). Vibratome sektioner, snarere end tynde snit frosset organmateriale, tillade forbedret observation af de stærkt forgrenet NPCs og også samlede neuroepithelial struktur.
Figur 1 : Nøglen skridt i dissektion af en baghjernen fra embryonet e11.5 mus. (En - D) Skematisk visning af baghjernen microdissection. (A) den caudale hoved væv fjernes ved overskæring langs de røde stiplede linier. (B) topplade er gennemboret og derefter revet væk i rostralt og caudale retninger langs midterlinjen (lodret rød linje) og derefter lateralt til at afsløre baghjernen neuroepithelium. (C) neuroepithelium er pried fra meninges efter indsættelse pincet mellem begge strukturer, og midthjernen og rygmarv væv fjernes ved at bryde væv med pincet langs de røde stiplede linier. (D) denne fremgangsmåde giver en flad baghjernen. (E-K) Billedoptagelse af centrale faser i proceduren baghjernen microdissection. (E) embryoet er halshugget af severing langs den stiplede linje. (F) baghjernen 4th ventrikel, omsluttet af topplade, skåret ud og er adskilt fra lederen af severing langs de prikkede linjer. (G) 4th ventriklen, er orienteret opad før et lille hul er gennemboret i topplade (stjerne). Hullet udvides ved at skrælle væv omhyggeligt både rostrally og caudally langs midterlinjen (pile) at udsætte baghjernen. Baghjernen er placeret pial side ned og venstre til at folde ud i en åben bog forberedelse (H, sort pilespids angiver baghjernen neurale væv). Hvis baghjernen er påkrævet for wholemount immunolabeling, fjernet pial membranen af forsigtigt nysgerrige baghjernen neuroepithelium fra omkringliggende meningeal membraner med pincet, (jeg). Overskydende midthjernen (mb) og rygmarven (sc) væv er fjernet (stiplede linjer i J) til at isolere baghjernen (K). Skalalinjen: 500 µm til (E), 300 µm (F - K). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Wholemount immunolabeling kan bruges til at kvantificere NPC mitoses på tværs af baghjernen. (A) skematiske illustrerer en ansigt billeddannelse af mitotiske NPCs i baghjernen ventrikulær lag. V, ventrikulær baghjernen side; Pedersen, pial baghjernen side. (B) Konfokal flise scan z stakken af e10.5 baghjernen efter wholemount immunolabeling for mitotiske markør pHH3 (rød). Den hvide boks angiver det område vises på højere forstørrelse i det andet panel i (D). (C) før anaphase (hvid pilespids) og anaphase (sort pilespids) mitotiske tal som adskiller sig indenfor den samlede kohorte af mitotiske NPCs. (D) gang kursus af wholemount pHH3 mærkning fra e9.5-13,5. Skalere barer: 500 µm i (B); 20 µm i (C); 100 µm i (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Cykling NPCs i deres germinal zone i den rostralt baghjernen. (A) skematisk skildrer holdning af mitotiske (grøn) og S-fase (rød) NPCs i baghjernen ventrikulær overflade og i området periventricular henholdsvis. En virtuel tværsnit gennem baghjernen vises på højere forstørrelse til højre. Den sorte pil angiver retningen af migration af NPC afkom, der har forladt cellecyklus mod zonen differentiering. (B) Konfokal z stak af en flydende e11.0 baghjernen sektion fra et foster, der fik en 1 h EdU puls; immunolabeling for pHH3 og EdU blev brugt til at visualisere mitotiske (grøn) og S-fase (rød) NPCs, henholdsvis. Baghjernen overflader er angivet med stiplede linjer; V, ventrikulær baghjernen side; Pedersen, pial baghjernen side. Området angivet med en hvid boks er vist på højere forstørrelse i indsatser; pilene angiver kavalergang flyet af en NPC i anaphase, i forhold til den ventrikulære overflade. (C) Single channel viser pHH3 immunolabeling kun. Mitotiske NPCs angives af cyan pilespidser; manglen på basal divisioner er angivet med Δ. (D) Single channel viser EdU mærkning kun. EdU+ NPCs vedtage en pseudostratified distribution på grund af deres interkinetic nukleare migration. Den afstand, NPCs migrere fra ventrikulær overfladen kan måles, som angivet med en repræsentativ orange linje. Skalere barer: 100 µm i (B -D); 10 µm i indsatser i (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Kombinere BrdU med Ki67 mærkning til at bestemme baghjernen NPC selvfornyelse kapacitet. (A) Konfokal z stak en e10.5 baghjernen cryosection efter mærkning for Ki67 (grøn) og BrdU (rød) efter en 1 dag BrdU puls. Dobbelt-positive celler i den ventrikulære zone er NPC'ere, der har indarbejdet BrdU og stadig bevæger sig gennem cellecyklus, som angivet ved Ki67 mærkning. Andelen af dobbelt-mærket celler BrdU+ -befolkningen samlede repræsenterer procentdelen af selvstændig fornyelse NPCs. (B, C) enkelt kanaler viser Ki67 (B) og BrdU (C) immunolabeling kun. En BrdU+ celle, der mangler Ki67 og derfor sandsynligvis har forladt cellecyklus er angivet med en cyan pilespids i (A,C). Baghjernen overflader er angivet med stiplede linjer; V, ventrikulær baghjernen side; Pedersen, pial baghjernen side. Skalalinjen: 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Nestin immunolabeling visualiserer NPC processer og endfeet. (En - C) Immunfluorescens for RC2, som anerkender en epitop på neurale mellemliggende glødetråden nestin, illustrerer NPC morfologi over baghjernen neuroepithelium. (A) Konfokal z stak en flydende del fra en e11.5 baghjernen efter RC2 immunolabeling; boxed områder er vist på højere forstørrelse i (B, B', apikale/ventrikulær region) og (C, C'; basal region). Baghjernen overflader er angivet med stiplede linjer; V, ventrikulær baghjernen side; Pedersen, pial baghjernen side. (B, C) Konfokal z stakke af boxed områder i (A); enkelt optisk sektioner er vist i (B', C'), henholdsvis. En NPC apikale endfoot forankret på den ventrikulære overflade er angivet med en pil i (B'). Enkelt og fasciculated NPC processer angives med hvide og sorte pilespidser i (C'), henholdsvis. Skalere barer: 100 µm, (A); 25 µm (B, C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol beskriver, hvordan du bruger musen embryonale baghjernen som en model til at studere mekanismerne af udviklingsmæssige neurogenese. Hjælp af en række forskellige immunolabeling metoder, baghjernen NPCs kan visualiseres og deres antal kvantificerede i væv sektioner eller på tværs af organ wholemounts. Lethed af dissektion og flad anatomi sikrer, at baghjernen kan være afbildet i en 'åben bog' forberedelse til at indsamle oplysninger om organ-dækkende neurogenese mønstre.
Vi viser yderligere, at NPC morfologi og cellecyklus-relaterede NPC positionering kan være let visualiseres i flydende- eller snit af baghjernen frosset organmateriale. Begge adfærd kan udnyttes til at definere nye stamfader populationer, som tidligere er blevet udført i pattedyr telencephalon20. For eksempel, tidlig dannet Sox2+ neuroepithelia og Pax6+ apikale radial glia er til stede i baghjernen21,22, men baghjernen mangler Tbr2+ basal stamfaderen3 .
Protokollen beskrevet her kan også tilpasses observere opførslen af specifikke NPC delpopulationer af fluorescerende mærkning for live imaging og/eller afstamning sporingen i faste væv. Dette kan opnås, for eksempel ved at studere hindbrains fra mus transporterer tamoxifen-inducerbar Sox1-iCreERT2 transgenet og Rosa26tdTomato reporter23.
Ud over at øge viden om murine neurogenese, kan studerer baghjernen belyse bredt relevante neurogen mekanismer, der deles på tværs af arter, fordi baghjernen er en yderst velbevarede hjernen region, der forventes at blive mere lignende mellem vertebrater end forebrain.
Baghjernen neurogenese finder sted over en forholdsvis kortere tidsvindue end forhjernen neurogenese23, er det vigtigt at overveje behovet for at sammenligne tilstrækkeligt iscenesat embryoner. I overensstemmelse hermed, eksperimentelle partiskhed undgås ved at tælle og registrere antallet af somite par i embryonet inden isolere sine baghjernen. Baghjernen væv, selv er skrøbelige og pincet skal derfor håndteres forsigtigt når adskille baghjernen væv fra hoved udkom og meninges; et par af 'praksis kører' kan derfor være tilrådeligt, før dissektion af værdifulde embryoner er forsøgt. Derudover skal hindbrains overføres fra et rør til et andet ved hjælp af wide-bore Pasteur pipette og ikke med pincet til at undgå skader (pipette's åbning kan være udvidet ved at skære i spidsen med en ren saks). Endelig, selvom ualmindeligt, omfanget af EdU/BrdU iblanding i S-fase NPCs kan være variabel, navnlig under korte (dvs., 1 h) pulser. For at forbedre mærkning, sikre, at EdU/BrdU opløses ordentligt før pålæsning løsningen ind i sprøjten og sprøjt omhyggeligt ind i bughulen. Dårlig injektioner, såsom dem, der foretages subkutant ved et uheld, vil resultere i at miste eller diffusering EdU/BrdU løsning og forhindre det i at komme ind omsætning.
Disclosures
Ingen af forfatterne har konkurrerende interesser eller modstridende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Vasiliki Chantzara udføre timet parringer og ansatte i den biologiske ressourceenhed ved UCL Institute of Ophthalmology for musen dyrehold. Denne undersøgelse blev støttet af en Wellcome Trust Investigator Award 095623/Z/11/Z til CR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
| Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
| Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
| Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
| Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
| Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
| 29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
| Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
| Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
| Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
| Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
| 5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
| Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
| Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
| Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
| Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
| Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
| Mowiol | Millipore | 475904 | |
| OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
| Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
| Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
| Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
| Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
| Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Thermometer | VWR | 620-0858 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |
References
- Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).
- Gregg, C., Weiss, S. CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain. Development. 132 (3), 565-578 (2005).
- Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).
- Krumlauf, R. Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments. Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).
- Guthrie, S. Patterning and axon guidance of cranial motor neurons. Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).
- Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis. Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).
- Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis. Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).
- Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors. Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).
- Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS. Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).
- Jacob, J., et al. Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1. Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
- Peretz, Y., et al. A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2. BMC Biol. 14, 57 (2016).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. J Vis Exp. (26), (2009).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hutton, S. R., Pevny, L. H. SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon. Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Sauer, F.
- Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex. Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nat Commun. 4, 2125 (2013).
- Fantin, A., et al. Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction. Blood. 116 (5), 829-840 (2010).
- Kayam, G., et al. A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain. Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).
- Tata, M., et al. Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).
