Cet article explique comment le cerveau postérieur embryonnaires de souris peut servir comme modèle pour étudier la neurogenèse du développement dans les organes entiers et préparations de section de tissu.
Le cerveau d’embryons de souris est le système le plus couramment utilisé pour étudier la neurogenèse chez les mammifères au cours du développement. Toutefois, le neuroépithélium prosencéphale fortement pliée n’est pas prête à l’analyse wholemount pour examiner les modèles de la neurogenèse de l’orgue à l’échelle. Par ailleurs, définir les mécanismes de la neurogenèse du cerveau antérieur n’est pas forcément prédictif de la neurogenèse dans d’autres parties du cerveau ; par exemple, en raison de la présence des sous-types spécifiques du prosencéphale progénitrices. Le rhombencéphale souris propose un modèle alternatif pour l’étude de la neurogenèse embryonnaire qui se prête à l’analyse de wholemount, ainsi que des sections de tissu d’observer la distribution spatio-temporelle et le comportement des cellules souches neurales. En outre, il est disséqué facilement pour d’autres applications en aval, telles que l’analyse isolément ou en biologie moléculaire de cellules. Comme le cerveau postérieur de souris peut être facilement analysé dans la multitude de journaliste de lignée cellulaire et des lignées de souris mutantes qui sont apparues, il offre un modèle puissant pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement neurogenèse chez un mammifère organisme. Nous présentons ici une méthode simple et rapide pour utiliser le rhombencéphale d’embryon de souris pour analyser le comportement cellulaire (NPC) mammifères progénitrices neurales dans les préparations de wholemount et de coupes de tissus.
Au cours du développement embryonnaire chez les mammifères, PNJs divisent sous-ventriculaire (SVZ) zones du neuroépithélium en expansion et ventriculaire (VZ) pour générer de nouveaux neurones dans un processus appelé « neurogenèse ». La génération de nouveaux neurones et de leurs précurseurs NPC a étudié intensivement dans le prosencéphale1, alors qu’on connaît moins ce processus dans d’autres régions.
Le cerveau antérieur est une structure complexe et finement plissée qui est largement étudiée avec des méthodes histologiques après découpe de tissu, qui rend compréhension neurogenèse modèles à travers l’organe entier difficiles. En outre, les études de la neurogenèse du cerveau ne sont pas forcément prédictifs du comportement neurogène dans d’autres régions du cerveau ou la moelle épinière. Par exemple, signalisation repères peuvent provoquer des réponses différentes régions distinctes du CNS, tel qu’observé dans le cas du facteur neurotrophique ciliaire et facteur inhibiteur de leucémie, qui favorisent l’auto-renouvellement de PNJ dans l’éminence ganglionnaire latéral, mais le lecteur différenciation des cellules souches de la moelle épinière2. En outre, une sous-classe de PNJs qui peuplent le cerveau en développement et contribuent largement à l’expansion du cortex cérébral1 sont absents du cerveau postérieur et la moelle épinière3. Inversement, il est concevable que la moelle épinière et le cerveau postérieur contiennent les autres sous-types NPC non présents dans le cortex.
Le rhombencéphale d’embryon de souris est la plus ancienne région évolutive du cerveau chez les mammifères et génère le cervelet et le tronc cérébral. En dépit de sa conservation à travers les espèces, relativement est méconnu la neurogenèse du cerveau postérieur, y compris les sous-types de PNJ ou de leur règlement. La plupart des recherches de cerveau postérieur chez la souris a mis l’accent sur le processus de segmentation des tissus, pilotée par Hox gènes4et la structuration des neurones post-mitotiques5. En outre, le cerveau postérieur a servi comme modèle pour étudier les mécanismes d’angiogenèse développementale6.
Contraste avec le postérieur de la souris, le poisson-zèbre hindbrain a été largement utilisé pour suivre la différenciation NPC et la progression de la lignée dans un organisme modèle vertébrés (p. ex.,7,8). Le rhombencéphale poussin a aussi été employé pour étudier la neurogenèse au cours du développement des vertébrés (p. ex.,9,10). Comme pour le poisson-zèbre hindbrain11, le rhombencéphale poussin peut être direct imagés pour étudier le comportement NPC et la réglementation au fil du temps,12. Analogue observation longitudinale par imagerie live n’est pas actuellement possible chez les organismes mammifères, parce qu’ils se développent in utero. En outre, ciblées manipulation au moyen de techniques telles qu’électroporation peut s’appliquer facilement à des embryons de poisson-zèbre libres ou poussin embryons dans ovo (p. ex.,13), mais ces techniques sont également plus difficiles dans utero.
Néanmoins, le rhombencéphale d’embryon de souris est extraordinairement adapté pour définir les mécanismes moléculaires et cellulaires qui gouvernent la neurogenèse. Tout d’abord, analyse du rhombencéphale de souris, dans bien des cas, fournira des informations plus pertinentes à l’évolution de l’être humain que celle obtenue grâce à l’étude des vertébrés inférieurs. En outre, il existe un grand nombre de lignées de souris génétiquement modifiées que peuvent être utilisés pour sort PNJs murins de cartographie ou d’altérer les mécanismes de régulation avec des allèles mutants constitutives ou conditionnelles des gènes concernés. Enfin, il a récemment été démontré que la microinjection de ventriculaire postérieur progéniteurs ex vivo permet au moins un bref examen du rhombencéphale NPC cinétique14. Pourtant, à l’heure actuelle, très peu est connu sur l’organisation spatio-temporelle et le comportement du cerveau postérieur PNJs dans un contexte d’organes entiers.
Ici, nous démontrons une méthode simple et rapide pour utiliser le cerveau postérieur comme un puissant modèle pour analyser le comportement NPC mammifères dans les préparations de wholemount et de coupes de tissus. Nous fournissons également des protocoles pour utiliser immunomarquage pour l’étude des paramètres différents de la neurogenèse et processus postérieur des échantillons supplémentaires pour des applications moléculaires en aval comme la transcriptase inverse quantitative (qRT)-PCR.
Ce protocole décrit comment utiliser le rhombencéphale embryonnaires de souris comme modèle pour étudier les mécanismes de la neurogenèse du développement. En utilisant une variété de méthodes différentes immunomarquage, rhombencéphale PNJ peut être visualisée et leur nombre quantifié dans des sections de tissu ou organe wholemounts. La facilité de dissection et anatomie plat fait en sorte que le cerveau postérieur peut être photographiée dans une préparation de « livre ouvert » pour recueillir des informations sur les habitudes de la neurogenèse de l’orgue à l’échelle.
De plus, nous montrons que morphologie NPC et axés sur le cycle cellulaire NPC positionnement peuvent être facilement visualisées en flottant- ou cryosections du rhombencéphale. Les deux comportements peuvent être exploitées pour définir de nouvelles populations de souches, a précédemment été interprété dans le télencéphale mammifères20. Par exemple, formé début Sox2+ neuroepithelia et la glie radiale apicale de Pax6+ sont présents dans le cerveau postérieur21,22, mais le cerveau postérieur manque progéniteurs basales Tbr2+ 3 .
Le protocole décrit ici peut être adapté pour observer le comportement de certaines sous-populations de NPC par marquage fluorescent pour imagerie live et/ou suivi de lignée en tissus fixés. Cela est possible, par exemple, par l’étude hindbrains des souris portant le transgène tamoxifène-induisible de Sox1-iCreERT2 et le journaliste de Rosa26tdTomato 23.
En plus d’améliorer la connaissance de la neurogenèse murine, étudier le cerveau postérieur peut élucider les mécanismes de neurogènes largement pertinentes qui sont partagés par toutes les espèces, car le cerveau postérieur est une région du cerveau hautement conservée qui est censée être plus proche entre espèces de vertébrés que le prosencéphale.
Comme la neurogenèse du cerveau postérieur se déroule sur une fenêtre de temps relativement plus courte que le prosencéphale neurogenèse23, il est important de tenir compte de la nécessité de comparer adéquatement mis en scène des embryons. En conséquence, les biais expérimentaux sont évité en comptant et en enregistrant le nombre de paires de segments dans un embryon avant d’isoler son cerveau postérieur. Le tissu de cerveau postérieur lui-même est fragile et pinces doit donc être manipulé avec soin en séparant le tissu de cerveau postérieur de la tête mésenchyme et des méninges ; un couple de « pistes de pratique » pourrait donc être souhaitable avant une dissection des embryons précieux. En outre, hindbrains doivent être transférés d’un tube à l’autre à l’aide d’une pipette Pasteur-échelle plutôt qu’avec une pince pour éviter tout dommage (ouverture de la pipette peut être élargi par le découpage de la pointe avec des ciseaux propre). Enfin, bien que rare, la mesure d’EdU/BrdU incorporation, phase S PNJ peut être variable, en particulier pendant les impulsions courtes (c.-à-d., 1 h). Pour améliorer l’étiquetage, veiller à ce que les EdU/BrdU est dissous correctement avant le chargement de la solution dans la seringue et injecter prudemment dans la cavité péritonéale. Injections de pauvres, comme ceux fabriqués par voie sous-cutanée par accident, provoquera en perdre ou en piégeant la solution EdU/BrdU et empêchez-le de pénétrer dans la circulation.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Vasiliki Chantzara pour mener à bien les accouplements chronométré et le personnel de l’unité de ressources biologiques à l’Institut d’ophtalmologie de l’UCL pour élevage de souris. Cette étude a été financée par une bourse de chercheur de Wellcome Trust 095623/Z/11/Z à CR.
Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
Mowiol | Millipore | 475904 | |
OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
Thermometer | VWR | 620-0858 | |
Cover glass | VWR | 631-0137 | |
Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |