यह आलेख प्रदर्शित करता है कि कैसे माउस भ्रूण hindbrain पूरे अंग और ऊतक अनुभाग तैयारियों में विकासात्मक neurogenesis का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
माउस भ्रूण forebrain विकास के दौरान स्तनधारी neurogenesis के अध्ययन के लिए सबसे अधिक कार्यरत प्रणाली है । तथापि, उच्च तह forebrain neuroepithelium wholemount विश्लेषण करने के लिए उत्तरदाई नहीं है अंग चौड़ा neurogenesis पैटर्न की जांच । इसके अलावा, forebrain neurogenesis के तंत्र को परिभाषित मस्तिष्क के अंय भागों में neurogenesis के जरूरी पूर्वानुमान नहीं है; उदाहरण के लिए, forebrain-विशिष्ट जनक उपप्रकारों की उपस्थिति के कारण । माउस hindbrain भ्रूण neurogenesis है कि wholemount विश्लेषण के लिए उत्तरदायी है के अध्ययन के लिए एक वैकल्पिक मॉडल प्रदान करता है, साथ ही ऊतक वर्गों spatiotemporal वितरण और तंत्रिका progenitors के व्यवहार का पालन करने के लिए. इसके अलावा, यह आसानी से ऐसे सेल अलगाव या आणविक जीवविज्ञान विश्लेषण के रूप में अंय बहाव अनुप्रयोगों, के लिए विच्छेदित है । माउस hindbrain के रूप में आसानी से सेल वंश रिपोर्टर और उत्परिवर्ती माउस उपभेदों कि उपलब्ध हो गए है की विशाल संख्या में विश्लेषण किया जा सकता है, यह एक स्तनधारी में सेलुलर और विकासात्मक neurogenesis के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रदान करता है जीव. यहां, हम एक सरल और त्वरित विधि वर्तमान wholemount की तैयारी और ऊतक वर्गों में स्तनधारी तंत्रिका जनक सेल (एनपीसी) के व्यवहार के विश्लेषण के लिए माउस भ्रूण hindbrain का उपयोग करने के लिए प्रस्तुत करते हैं ।
भ्रूण स्तनधारी विकास के दौरान, NPCs में विभाजित वेंट्रिकुलर (VZ) और subventricular (SVZ) क्षेत्रों के विस्तार के लिए एक प्रक्रिया में नए ंयूरॉंस उत्पंन neuroepithelium ‘ neurogenesis ‘ । नए ंयूरॉंस और उनके एनपीसी के अग्रदूतों की पीढ़ी forebrain1में बड़े पैमाने पर जांच की गई है, whilst कम अंय क्षेत्रों में इस प्रक्रिया के बारे में जाना जाता है ।
forebrain एक जटिल और जटिल जोड़ संरचना है कि काफी हद तक ऊतक अनुभाग के बाद ऊतकीय तरीकों के साथ अध्ययन किया है, जो पूरे अंग चुनौतीपूर्ण भर में neurogenesis पैटर्न समझ में आता है । इसके अलावा, forebrain neurogenesis के अध्ययन के अंय मस्तिष्क क्षेत्रों में या रीढ़ की हड्डी में तंत्रिकाजन्य व्यवहार के जरूरी पूर्वानुमान नहीं हैं । उदाहरण के लिए, संकेतन cues अलग सीएनएस क्षेत्रों भर में प्रतिक्रियाओं भिन्न हो सकता है, के रूप में सिलिअरी neurotrophic फैक्टर और ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक है, जो पार्श्व ganglionic उभार में NPCs के स्व-नवीकरण को बढ़ावा देने के मामले में मनाया, लेकिन ड्राइव रीढ़ की हड्डी के भेदभाव progenitors2। इसके अलावा, NPCs के एक उप वर्ग है कि विकासशील forebrain आबाद और मस्तिष्क प्रांतस्था1 के विस्तार के लिए महत्वपूर्ण योगदान hindbrain और रीढ़ की हड्डी3से अनुपस्थित रहे हैं । व्युत्क्रम, यह कल्पना है कि रीढ़ की हड्डी और hindbrain शामिल वैकल्पिक एनपीसी उपप्रांतस्था में मौजूद नहीं है ।
माउस भ्रूण hindbrain स्तनधारी मस्तिष्क के विकासवादी प्राचीनतम क्षेत्र है और सेरिबैलम और brainstem उत्पंन करता है । प्रजातियों के पार अपने संरक्षण के बावजूद, अपेक्षाकृत कम hindbrain neurogenesis के बारे में जाना जाता है, एनपीसी ने उपप्रकार या उनके विनियमन सहित । माउस में hindbrain अनुसंधान के बहुमत ऊतक विभाजन की प्रक्रिया पर ध्यान केंद्रित किया है, Hox जीन4द्वारा संचालित है, और बाद के पैटर्न-mitotic न्यूरॉन्स5. इसके अलावा, hindbrain विकास angiogenesis के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है6।
माउस hindbrain के विपरीत, zebrafish hindbrain बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है एक हड्डीवाला मॉडल जीव में एनपीसी भेदभाव और वंश प्रगति का पालन करें (जैसे,7,8) । चिकी hindbrain भी हड्डीवाला विकास के दौरान neurogenesis अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है (जैसे,9,10) । zebrafish hindbrain11के लिए इसी तरह, चिकी hindbrain के लिए समय12पर एनपीसी व्यवहार और विनियमन अध्ययन करने के लिए छवि जीना हो सकता है । लाइव इमेजिंग द्वारा अनुरूप अनुदैर्ध्य अवलोकन वर्तमान में स्तनधारी जीवों में संभव नहीं है, क्योंकि वे utero में विकसित. इसके अलावा, ऐसी electroporation के रूप में तकनीक के माध्यम से हेरफेर लक्षित आसानी से मुक्त रहने zebrafish भ्रूण या लड़की भ्रूण ovo में (उदा,13) पर लागू किया जा सकता है, लेकिन ऐसी तकनीक में भी अधिक चुनौतीपूर्ण है utero।
फिर भी, माउस भ्रूण hindbrain अति सुंदर आणविक और सेलुलर तंत्र है कि neurogenesis शासन को परिभाषित करने के लिए अनुकूल है । सबसे पहले, माउस hindbrain के विश्लेषण, कई उदाहरणों में, जानकारी है कि और अधिक मानव विकास के लिए प्रासंगिक है कि कम रीढ़ अध्ययन के माध्यम से प्राप्त प्रदान करेगा । इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस उपभेदों की एक विशाल संख्या में उपलब्ध है कि या तो भाग्य मानचित्रण murine NPCs के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या प्रासंगिक जीन के गठन या सशर्त उत्परिवर्ती alleles के साथ विनियामक तंत्र में परिवर्तन । अंत में, यह हाल ही में दिखाया गया है कि microinjection वेंट्रिकुलर hindbrain progenitors पूर्व vivo की अनुमति देता है कम से hindbrain के एक संक्षिप्त परीक्षा एनपीसी ने कैनेटीक्स14। फिर भी, वर्तमान में, बहुत कम spatiotemporal संगठन और hindbrain NPCs के व्यवहार के बारे में एक पूरे अंग संदर्भ में जाना जाता है ।
यहां, हम एक सरल और त्वरित विधि प्रदर्शन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल के रूप में hindbrain का उपयोग स्तनधारी wholemount तैयारी और ऊतक वर्गों में एनपीसी व्यवहार का विश्लेषण । हम आगे प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए विभिंन neurogenesis मानकों का अध्ययन करने के लिए immunolabeling का उपयोग करें और hindbrain नमूनों की प्रक्रिया के लिए आगे बहाव आणविक अनुप्रयोगों जैसे मात्रात्मक रिवर्स transcriptase (qRT)-पीसीआर ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक मॉडल के रूप में माउस भ्रूण hindbrain का उपयोग करने के लिए विकास neurogenesis के तंत्र का अध्ययन । विभिन्न immunolabeling तरीकों की एक किस्म का उपयोग करना, hindbrain NPCs कल्पना की जा सकती है और ऊतक वर्गों में उनकी संख्या मात्रा या अंग wholemounts के पार. विच्छेदन और फ्लैट शरीर रचना विज्ञान की आसानी सुनिश्चित करता है कि hindbrain एक ‘ खुली किताब ‘ तैयारी में छवि को अंग चौड़ा neurogenesis पैटर्न के बारे में जानकारी इकट्ठा किया जा सकता है ।
हम आगे कि एनपीसी आकृति विज्ञान और सेल चक्र से संबंधित एनपीसी ने स्थिति को आसानी से तैरते में visualized किया जा सकता है या hindbrain के cryosections दिखाते हैं । दोनों व्यवहार के लिए नई जनक आबादी को परिभाषित शोषण किया जा सकता है, के रूप में पहले स्तनधारी telencephalon20में प्रदर्शन किया गया है । उदाहरण के लिए, अर्ली-गठित Sox2+ neuroepithelia और Pax6+ शिखर रेडियल glia hindbrain21,22में मौजूद हैं, लेकिन hindbrain का अभाव Tbr2+ बेसल progenitors3 .
प्रोटोकॉल यहां भी वर्णित रहने इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट लेबलिंग द्वारा विशिष्ट एनपीसी ने उपजनसंख्या के व्यवहार का पालन अनुकूलित किया जा सकता है और/ इस उदाहरण के लिए, tamoxifen-inducible Sox1-iCreERT2 transgene और Rosa26tdTomato रिपोर्टर23ले जाने चूहों से hindbrains अध्ययन करके प्राप्त किया जा सकता है ।
murine neurogenesis के ज्ञान को बढ़ाने के अलावा, hindbrain अध्ययन मोटे तौर पर प्रासंगिक तंत्रिकाजन्य तंत्र है कि प्रजातियों के पार साझा कर रहे है स्पष्ट सकता है, क्योंकि hindbrain एक अत्यधिक संरक्षित मस्तिष्क क्षेत्र है कि अधिक समान होने की उंमीद है forebrain से हड्डीवाला प्रजातियों के बीच ।
के रूप में hindbrain neurogenesis forebrain neurogenesis23से एक अपेक्षाकृत कम समय खिड़की पर जगह लेता है, यह पर्याप्त रूप से भ्रूण मंचन की तुलना के लिए आवश्यकता पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है । तदनुसार, प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह गिनती और अपने hindbrain को अलग करने से पहले एक भ्रूण में somite जोड़े की संख्या रिकॉर्डिंग से बचा है । hindbrain ऊतक ही नाजुक है और संदंश इसलिए ध्यान से संभाला जाना चाहिए जब सिर mesenchyme और मेनिन्जेस से hindbrain ऊतक अलग; अभ्यास ‘ चलाता है इसलिए मूल्यवान भ्रूण के विच्छेदन से पहले उचित हो सकता है की एक जोड़ी का प्रयास किया है । इसके अलावा, hindbrains एक ट्यूब से दूसरे के लिए एक व्यापक बोर पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के बजाय संदंश के साथ नुकसान से बचने के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए (पिपेट खोलने साफ कैंची के साथ टिप के काटने से चौड़ा किया जा सकता है) । अंत में, हालांकि असामान्य, एस-चरण NPCs में EdU/BrdU निगमन की सीमा चर हो सकता है, विशेष रूप से कम के दौरान (यानी, 1 ज) दालों. लेबलिंग में सुधार करने के लिए, सुनिश्चित करें कि EdU/BrdU में समाधान लोड करने से पहले ठीक से भंग किया गया है सिरिंज और पेरिटोनियल गुहा में ध्यान से इंजेक्ट । खराब इंजेक्शन, जैसे दुर्घटना के द्वारा बनाए गए लोगों के रूप में, खोने या EdU/BrdU समाधान फँसाने और यह प्रचलन में प्रवेश करने से रोकने में परिणाम होगा ।
The authors have nothing to disclose.
हम Vasiliki Chantzara के बाहर ले जाने के लिए समय पर संभोग और जैविक संसाधन इकाई के UCL संस्थान में माउस पशुपालन के लिए नेत्र विज्ञान के कर्मचारियों को धंयवाद । यह अध्ययन एक वेलकम ट्रस्ट जांचकर्ता पुरस्कार 095623/z/11/जेड के लिए सीआर द्वारा समर्थित किया गया था ।
Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
Mowiol | Millipore | 475904 | |
OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
Thermometer | VWR | 620-0858 | |
Cover glass | VWR | 631-0137 | |
Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |