يوضح هذا المقال كيفية hindbrain الجنينية الماوس يمكن استخدامها كنموذج لدراسة الخلايا التنموية في كل من الجهاز كله واستعدادات قسم الأنسجة.
Forebrain الجنين الماوس هو نظام العاملين الأكثر شيوعاً لدراسة الخلايا الثديية أثناء التطوير. ومع ذلك، نيوروبيثيليوم forebrain مطوية عالية غير قابلة لتحليل ووليماونت دراسة أنماط الخلايا على مستوى الجهاز. وعلاوة على ذلك، تحديد آليات الخلايا forebrain ليست بالضرورة التنبؤية للخلايا في أجزاء أخرى من الدماغ؛ على سبيل المثال، بسبب وجود أنواع فرعية محددة forebrain السلف. هيندبرين الماوس يوفر نموذج بديل لدراسة الخلايا الجنينية التي قابلة للتحليل ووليماونت، فضلا عن أقسام الأنسجة لمراقبة توزيع الزمانية المكانية وسلوك موروث العصبية. وعلاوة على ذلك، هو تشريح بسهولة للتطبيقات المتلقين للمعلومات الأخرى، مثل تحليل العزلة أو البيولوجيا الجزيئية في خلية. كما يمكن تحليل hindbrain الماوس سهولة في عدد كبير من خلية نسب مراسل وسلالات متحولة الماوس التي أصبحت متاحة، ويقدم نموذجا قويا لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية للخلايا التنموية في الثدييات الكائن الحي. نقدم هنا، طريقة بسيطة وسريعة لاستخدام hindbrain الجنين الماوس لتحليل سلوك الخلية (مجلس الشعب) السلف العصبية الثدييات في أقسام الأنسجة والاستعدادات ووليماونت.
أثناء تطوير الثدييات الجنينية، تقسيم الشخصيات في البطين (VZ) ومناطق (SVZ) سوبفينتريكولار نيوروبيثيليوم الآخذة في التوسع لتوليد الخلايا العصبية الجديدة في عملية تسمى ‘الخلايا’. جيل جديد من الخلايا العصبية وسلائفها نواب تم التحقيق على نطاق واسع في forebrain1، بينما يعرف عن هذه العملية في مناطق أخرى.
Forebrain هو بنية معقدة ومعقد مطوية التي يتم دراستها إلى حد كبير مع أساليب نسيجية بعد تقطيع الأنسجة، مما يجعل فهم أنماط الخلايا عبر الجهاز كله تحديا. وبالإضافة إلى ذلك، دراسات للخلايا forebrain ليست التنبؤية بالضرورة سلوك العصبية في مناطق أخرى في الدماغ أو في الحبل الشوكي. على سبيل المثال، إشارات العظة قد الحصول على ردود متباينة عبر مناطق متميزة في الجهاز العصبي المركزي، كما لوحظ في حالة عامل نيوروتروفيك الهدبية واللوكيميا المثبطة، التي تشجع التجديد الذاتي للشخصيات في الأفقي ganglionic فضيلة، ولكن محرك الأقراص التفريق بين النخاع الشوكي المتكفل2. وعلاوة على ذلك، توجد فئة فرعية من الشخصيات التي ملء forebrain النامية ويسهم إلى حد كبير إلى التوسع في قشرة الدماغ1 من3هيندبرين والحبل الشوكي. عكسيا، فمن المتصور أن الحبل الشوكي و hindbrain تحتوي على أنواع فرعية للمجلس الوطني البديلة ليست موجودة في القشرة.
Hindbrain الجنين الماوس هو منطقة أقدم التطوري الدماغ الثدييات وينشئ المخيخ وجذع الدماغ. وعلى الرغم من المحافظة عليه عبر الأنواع، المعروف قليل نسبيا حول الخلايا هيندبراين، بما في ذلك الأنواع الفرعية لمجلس الشعب أو تنظيمها. معظم البحوث هيندبرين في الماوس ركز على عملية تجزئة الأنسجة، يقودها Hox الجينات4، والزخرفة من الخلايا العصبية الانقسامية بعد5. وبالإضافة إلى ذلك، قد استخدمت في هيندبرين كنموذج لدراسة آليات إنمائية تولد الأوعية6.
على النقيض من hindbrain الماوس، استخدمت على نطاق واسع hindbrain الزرد متابعة نواب التمايز والنسب التدرج في كائن نموذج فقاريات (مثلاً،،من78). كما استخدمت hindbrain الفرخ لدراسة الخلايا أثناء تطوير الفقارية (مثلاً،،من910). مماثلة إلى hindbrain الزرد11، hindbrain فرخ يمكن أن يعيش تصويرها لدراسة سلوك نواب واللائحة على مدى الساعة12. المراقبة طولية شبيهة بتصوير مباشر من غير الممكن حاليا في الكائنات الثديية، نظراً لأنها تضع في الرحم. وعلاوة على ذلك، تستهدف التلاعب من خلال تقنيات مثل يمكن تطبيقها انهانسر سهولة الزرد الشرانق الأجنة أو الفرخ الأجنة في ovo (مثلاً،13)، ولكن هذه التقنيات أيضا أكثر صعوبة في الرحم.
ومع ذلك، هيندبراين الجنين الماوس رائع مناسبة لتحديد الآليات الجزيئية والخلوية التي تنظم الخلايا. أولاً، تحليل hindbrain الماوس سيتم، في كثير من الحالات، توفر معلومات أكثر صلة بتطورات البشر من التي تم الحصول عليها من خلال دراسة الفقاريات أقل. وعلاوة على ذلك، تتوفر عدد ضخم من السلالات المعدلة وراثيا الماوس أنه يمكن أما استخدام لمصير تعيين مورين الشخصيات أو لتغيير آليات تنظيمية مع الآليلات الطور التأسيسي أو الشرطي الجينات ذات الصلة. وأخيراً، مؤخرا وقد ثبت أن microinjection hindbrain البطين موروث السابقين فيفو يسمح على الأقل دراسة موجزة ل hindbrain نواب حركية14. ومع ذلك، في الوقت الحاضر، هو يعرف إلا القليل جداً عن المنظمة الزمانية المكانية والسلوك من الشخصيات هيندبرين في سياق جهاز كله.
هنا، علينا أن نظهر طريقة بسيطة وسريعة لاستخدام في هيندبرين كنموذج قوية لتحليل سلوك نواب الثدييات في أقسام الأنسجة والاستعدادات ووليماونت. نقدم كذلك البروتوكولات ﻻستخدام إيمونولابيلينج لدراسة معلمات مختلفة من الخلايا وعملية hindbrain عينات أخرى للتطبيقات الجزيئية المصب مثل الكمية عكس المنتسخة (قرة)-بكر.
هذا البروتوكول يصف كيفية استخدام hindbrain الجنينية الماوس كنموذج لدراسة آليات الخلايا التنموية. استخدام مجموعة متنوعة من أساليب إيمونولابيلينج مختلفة، يمكن تصور hindbrain الشخصيات وعددها كمياً في أقسام الأنسجة أو عبر جهاز ووليمونتس. ويضمن سهولة التشريح والتشريح شقة أن يمكن تصويرها في هيندبرين في إعداد ‘كتاب مفتوح’ لجمع المعلومات عن أنماط الخلايا على مستوى الجهاز.
نعرض كذلك أن مورفولوجيا المجلس الوطني والمتصلة بدوره الخلية لمجلس الشعب لتحديد المواقع يمكن تصور على سهولة في العائمة-أو كريوسيكشنز هيندبرين. يمكن أن تستغل كل السلوكيات لتعريف السكان الجدد السلف، كما قد أجريت سابقا في الثدييات تيلينسيفالون20. على سبيل المثال، أوائل تشكيل نيوروبيثيليا Sox2+ وإطلاق شعاعي قمي Pax6+ موجودة في21،هيندبرين22، ولكن hindbrain يفتقر إلى فروعه القاعدية Tbr2+ 3 .
البروتوكول هو موضح هنا أيضا يمكن تكييفها لمراقبة سلوك الفئات السكانية الفرعية للمجلس الوطني محددة بوصفها الفلورسنت للتصوير الحي و/أو تتبع النسب في الأنسجة الثابتة. يمكن أن يتحقق هذا، على سبيل المثال، بدراسة هيندبراينس من الفئران تحمل التحوير Sox1-iCreERT2 تاموكسيفين إيندوسيبلي و مراسل Rosa26تدتوماتو 23.
بالإضافة إلى تعزيز المعرفة بالخلايا مورين، الذين يدرسون في هيندبرين قد توضيح الآليات العصبية ذات الصلة على نطاق واسع التي تمت مشاركتها عبر الأنواع، لأنه هيندبرين وهي منطقة الدماغ العالية مصانة التي من المتوقع أن يكون أكثر مماثلة بين الأنواع الفقارية مما forebrain.
كما hindbrain الخلايا يحدث خلال إطار زمني أقصر نسبيا من الخلايا فوريبرين23، من المهم النظر في الحاجة إلى مقارنة كافية نظموا الأجنة. تبعاً لذلك، هو تجنب التحيز التجريبية عد وتسجيل عدد أزواج سميط في جنين قبل عزل به هيندبرين. الأنسجة هيندبراين نفسها لا يزال هشا وينبغي لذلك أن تعالج الملقط بعناية عند فصل الأنسجة هيندبراين عن ميسينتشيمي الرأس والسحايا؛ زوجين من ‘تشغيل الممارسة’ قد يكون ولذا من المستصوب قبل محاولة تشريح الأجنة قيمة. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تنقل هيندبرينس من أنبوب واحد إلى آخر باستخدام ماصة باستور تحمل على نطاق بدلاً من الملقط لتجنب الأضرار (يمكن توسيع فتح ماصة بقطع رأس مع مقص نظيف). وأخيراً، على الرغم من غير المألوف، مدى إدماج إيدو/بردو الشخصيات S-المرحلة قد يكون المتغير، خاصة خلال نبضات قصيرة (أي، ح 1). لتحسين وضع العلامات، ضمان أن إيدو/بردو هو حل بشكل صحيح قبل تحميل الحل في المحاقن وحقن بعناية في التجويف الصفاقى. سوف يؤدي إلى فقدان أو محاصرة الحل إيدو/بردو حقن الفقراء، مثل تلك التي تحت الجلد عن طريق الصدفة، ومنعه من الدخول إلى الدورة الدموية.
The authors have nothing to disclose.
ونشكر تشانتزارا فاسيليكي للاضطلاع بتوقيت ماتينجس وموظفي “وحدة الموارد البيولوجية” في “معهد UCL لطب العيون” لتربية الماوس. وأيد هذه الدراسة “ويلكوم ترست المحقق جائزة” 095623/Z/11/Z إلى الجمهورية التشيكية.
Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
Mowiol | Millipore | 475904 | |
OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
Thermometer | VWR | 620-0858 | |
Cover glass | VWR | 631-0137 | |
Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |