Denne artikel viser, hvordan musen embryonale baghjernen kan bruges som model for at studere udviklingsmæssige neurogenese i både hele orgel og væv afsnit præparater.
Musen embryo forhjernen er den hyppigst ansat system for at studere pattedyr neurogenese under udvikling. Dog er stærkt foldede forhjernen neuroepithelium ikke indstillet til wholemount analyse for at undersøge organ-dækkende neurogenese mønstre. Derudover er definerer mekanismerne af forhjernen neurogenese ikke nødvendigvis prædiktive af neurogenese i andre dele af hjernen; for eksempel på grund af tilstedeværelsen af forhjernen-specifikke stamfader undertyper. Musen baghjernen giver en alternativ model for at studere embryonale neurogenese, der er modtagelig for wholemount analyse, samt væv sektioner til at observere spatiotemporelle distribution og opførsel af neurale stamceller. Desuden er det let dissekeret til andre downstream applikationer, såsom celle isolation eller Molekylærbiologi analyse. Da musen baghjernen kan let analyseres i utal af celle lineage reporter og mutant musen stammer, der er blevet ledige, giver det en kraftfuld model til at studere de cellulære og molekylære mekanismer af udviklingsmæssige neurogenese i et pattedyr organisme. Her præsenterer vi en enkel og hurtig metode for at bruge musen embryo baghjernen til at analysere pattedyr neurale stamceller celle (NPC) adfærd i wholemount præparater og væv sektioner.
Under pattedyr fosterudviklingen opdele NPCs i ventrikel (VZ) og subventricular (SVZ) zoner af den ekspanderende neuroepithelium til at generere nye neuroner i en proces, der kaldes ‘neurogenese’. Generation af nye neuroner og deres prækursorer for NPC er blevet undersøgt udførligt i forhjernen1, mens mindre vides om denne proces i andre regioner.
Forebrain er en kompleks og kringlet foldede struktur, der er i vid udstrækning studerede med histologiske metoder efter væv skæring, og som gør forståelse neurogenese mønstre på tværs af hele orglet udfordrende. Desuden, er undersøgelser af forhjernen neurogenese ikke nødvendigvis prædiktive neurogen adfærd i andre områder af hjernen eller rygmarven. For eksempel, signalering stikord kan fremkalde forskellige svar på tværs af forskellige CNS regioner, som observerede ciliaere neurotrope faktor og leukæmi hæmmende faktor, som fremmer selvfornyelse af NPCs i laterale ganglionære eminence, men drev differentiering af rygmarven stamfaderen2. Derudover en underklasse af NPC’ere, der befolker udvikle forebrain og bidrage væsentligt til udvidelse af hjernebarken1 er fraværende fra baghjernen og rygmarven3. Omvendt, er det tænkeligt, at rygmarven og baghjernen indeholder alternative NPC undertyper ikke til stede i cortex.
Musen embryo baghjernen er den evolutionære ældste region af hjernen, pattedyr og genererer lillehjernen og hjernestammen. På trods af dens bevaring på tværs af arter, er relativt lidt kendt om baghjernen neurogenese, herunder NPC undertyper eller deres regulering. Fleste af baghjernen forskning i musen har fokuseret på processen med væv segmentering, drevet af Hox gener4og mønstret af post mitotiske neuroner5. Derudover har baghjernen været brugt som en model til at studere mekanismerne af udviklingsmæssige angiogenese6.
I modsætning til musen baghjernen, er zebrafisk baghjernen blevet brugt flittigt til at følge NPC differentiering og afstamning progression i en hvirveldyr model organisme (fx,7,8). Chick baghjernen har også været ansat til at studere neurogenese under hvirveldyr udvikling (f.eks.,9,10). Lig zebrafisk baghjernen11, chick baghjernen kan være levende afbildet for at studere NPC adfærd og forordning over tid12. Analoge langsgående observation af live imaging er ikke i øjeblikket muligt i pattedyr organismer, fordi de udvikler in utero. Derudover målrettet manipulation gennem teknikker såsom elektroporation let kan anvendes til fritlevende zebrafisk embryoner eller chick embryoner i ovo (f.eks.,13), men disse teknikker er også mere udfordrende i utero.
Ikke desto mindre er mus embryo baghjernen udsøgt egnet til at definere de molekylære og cellulære mekanismer, der styrer neurogenese. Analyse af musen baghjernen vil for det første, i mange tilfælde give oplysninger, der er mere relevant for mennesker udvikling end der opnås via studier af lavere hvirveldyr. Desuden et utal af genmodificerede mus stammer er tilgængelige, kan enten anvendes til skæbne kortlægning murine NPCs eller at ændre reguleringsmekanismer med konstitutiv eller betinget mutante alleler af relevante gener. Endelig, det har for nylig vist sig at mikroinjektion af ventrikulær baghjernen stamfaderen ex vivo giver mulighed for i det mindste en kort gennemgang af baghjernen NPC kinetik14. Endnu i dag, meget lidt er kendt om spatiotemporelle organisation og opførsel af baghjernen NPCs i forbindelse med hele orgel.
Her viser vi en enkel og hurtig metode til at bruge baghjernen som en kraftfuld model til at analysere pattedyr NPC adfærd i wholemount præparater og væv sektioner. Vi leverer yderligere protokoller for at bruge immunolabeling til at studere forskellige neurogenese parametre og at processen baghjernen prøver yderligere til downstream molekylære applikationer såsom kvantitative reverse transkriptase (qRT)-PCR.
Denne protokol beskriver, hvordan du bruger musen embryonale baghjernen som en model til at studere mekanismerne af udviklingsmæssige neurogenese. Hjælp af en række forskellige immunolabeling metoder, baghjernen NPCs kan visualiseres og deres antal kvantificerede i væv sektioner eller på tværs af organ wholemounts. Lethed af dissektion og flad anatomi sikrer, at baghjernen kan være afbildet i en ‘åben bog’ forberedelse til at indsamle oplysninger om organ-dækkende neurogenese mønstre.
Vi viser yderligere, at NPC morfologi og cellecyklus-relaterede NPC positionering kan være let visualiseres i flydende- eller snit af baghjernen frosset organmateriale. Begge adfærd kan udnyttes til at definere nye stamfader populationer, som tidligere er blevet udført i pattedyr telencephalon20. For eksempel, tidlig dannet Sox2+ neuroepithelia og Pax6+ apikale radial glia er til stede i baghjernen21,22, men baghjernen mangler Tbr2+ basal stamfaderen3 .
Protokollen beskrevet her kan også tilpasses observere opførslen af specifikke NPC delpopulationer af fluorescerende mærkning for live imaging og/eller afstamning sporingen i faste væv. Dette kan opnås, for eksempel ved at studere hindbrains fra mus transporterer tamoxifen-inducerbar Sox1-iCreERT2 transgenet og Rosa26tdTomato reporter23.
Ud over at øge viden om murine neurogenese, kan studerer baghjernen belyse bredt relevante neurogen mekanismer, der deles på tværs af arter, fordi baghjernen er en yderst velbevarede hjernen region, der forventes at blive mere lignende mellem vertebrater end forebrain.
Baghjernen neurogenese finder sted over en forholdsvis kortere tidsvindue end forhjernen neurogenese23, er det vigtigt at overveje behovet for at sammenligne tilstrækkeligt iscenesat embryoner. I overensstemmelse hermed, eksperimentelle partiskhed undgås ved at tælle og registrere antallet af somite par i embryonet inden isolere sine baghjernen. Baghjernen væv, selv er skrøbelige og pincet skal derfor håndteres forsigtigt når adskille baghjernen væv fra hoved udkom og meninges; et par af ‘praksis kører’ kan derfor være tilrådeligt, før dissektion af værdifulde embryoner er forsøgt. Derudover skal hindbrains overføres fra et rør til et andet ved hjælp af wide-bore Pasteur pipette og ikke med pincet til at undgå skader (pipette’s åbning kan være udvidet ved at skære i spidsen med en ren saks). Endelig, selvom ualmindeligt, omfanget af EdU/BrdU iblanding i S-fase NPCs kan være variabel, navnlig under korte (dvs., 1 h) pulser. For at forbedre mærkning, sikre, at EdU/BrdU opløses ordentligt før pålæsning løsningen ind i sprøjten og sprøjt omhyggeligt ind i bughulen. Dårlig injektioner, såsom dem, der foretages subkutant ved et uheld, vil resultere i at miste eller diffusering EdU/BrdU løsning og forhindre det i at komme ind omsætning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Vasiliki Chantzara udføre timet parringer og ansatte i den biologiske ressourceenhed ved UCL Institute of Ophthalmology for musen dyrehold. Denne undersøgelse blev støttet af en Wellcome Trust Investigator Award 095623/Z/11/Z til CR.
Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
Mowiol | Millipore | 475904 | |
OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
Thermometer | VWR | 620-0858 | |
Cover glass | VWR | 631-0137 | |
Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |