Denne artikkelen viser hvordan mus embryonale hindbrain kan brukes som modell for å studere utviklingsmessige neurogenesis både hele orgel og vev delen forberedelser.
Musen embryoet forebrain er vanligvis ansatt system for å studere pattedyr neurogenesis under utvikling. Men er svært foldet forebrain neuroepithelium ikke mottakelig for wholemount analyse undersøke orgel hele neurogenesis mønstre. Videre er definere mekanismer for forebrain neurogenesis ikke nødvendigvis prediktive for neurogenesis i andre deler av hjernen; for eksempel på grunn av tilstedeværelsen av forebrain-spesifikke stamfar undergrupper. Mus-hindbrain gir en alternativ modell for å studere embryonale neurogenesis som passer til wholemount analyse, samt vev deler å observere spatiotemporal distribusjon og oppførsel av nevrale progenitors. Dessuten er det enkelt dissekert for andre nedstrøms programmer, for eksempel celle isolasjon eller molekylærbiologi analyse. Som musen hindbrain kan lett bli analysert i stort antall celle avstamning reporter og mutant musa stammer som har blitt tilgjengelig, tilbyr det en kraftig modell for å studere cellulære og molekylære mekanismer av utviklingsmessige neurogenesis i et pattedyr organisme. Her presenterer vi en enkel og rask metode for å bruke musen fosteret hindbrain for å analysere pattedyr nevrale celle (NPC) atferd i wholemount forberedelser og vev.
Under embryonale utviklingen av pattedyr dele NPCer i ventrikkel (VZ) og subventricular (SVZ) soner av den voksende neuroepithelium å generere nye nerveceller i en prosess kalt ‘neurogenesis’. Generering av nye nerveceller og NPC forgjengere har blitt undersøkt grundig i forebrain1, mens mindre er kjent om denne prosessen i andre regioner.
Forebrain er en kompleks og intrikat foldet struktur som er i stor grad studerte histologiske metoder etter vev snitting som gjør forstå neurogenesis mønstre over hele orgel utfordrende. I tillegg er studier av forebrain neurogenesis ikke nødvendigvis prediktiv neurogenic atferd i andre områder av hjernen eller ryggmargen. For eksempel signalnettverk signaler kan framprovosere ulike reaksjoner på tvers av atskilte CNS områder, som observert ciliary nevrotropisk faktor og leukemi hemmende faktor, som fremmer selvtillit fornyelse av NPCer i laterale ganglionic anseelse, men stasjonen differensiering av ryggmargen progenitors2. Videre en underklasse av NPCer som fyller utvikle forebrain og bidra vesentlig til utvidelse av hjernebarken1 er fraværende fra de hindbrain og ryggmargen3. Omvendt, er det tenkelig at ryggmargen og hindbrain inneholder alternative NPC subtyper finnes ikke i cortex.
Musen fosteret hindbrain er evolusjonære eldste regionen pattedyr hjernen og genererer lillehjernen og hjernestammen. Til tross for sin bevaring tvers av arter, er relativt lite kjent om hindbrain neurogenesis, inkludert NPC subtyper eller deres regulering. Fleste av hindbrain forskningen musen har fokusert på prosessen med vev segmentering, drevet av Hox gener4og mønster etter mitotisk neurons5. I tillegg har til hindbrain blitt brukt som modell for å studere mekanismer av utviklingsmessige angiogenese6.
I motsetning til musen hindbrain, har sebrafisk-hindbrain vært brukt mye NPC differensiering og avstamning progresjon i en virveldyr modell organisme (f.eks,7,8). Den dama hindbrain har også vært ansatt å studere neurogenesis under virveldyrenes utvikling (f.eks,9,10). Ligner på sebrafisk hindbrain11, chick-hindbrain kan være live fotografert for å studere NPC atferd og regulering over tid12. Analoge langsgående observasjon av live bildebehandling er ikke tiden mulig i pattedyr organismer, ettersom de utvikler i utero. Videre målrettet manipulasjon gjennom teknikker som electroporation kan lett brukes på frittlevende sebrafisk embryo eller kylling embryoer i ovo (f.eks,13), men slike teknikker er også mer utfordrende i Utero.
Likevel er musen fosteret hindbrain utsøkt egnet til å definere molekylære og cellulære mekanismer som styrer neurogenesis. For det første vil analyse av musen hindbrain i mange tilfeller gir informasjon som er mer relevante for mennesker utvikling enn fra studere lavere virveldyr. Videre et stort antall genmodifiserte musen stammer er tilgjengelig som enten kan bli brukt for skjebne kartlegging murine NPCer eller endre regulatoriske mekanismer med grunnleggende eller betinget mutant alleler av relevante gener. Til slutt, har nylig vist at microinjection av ventrikkel hindbrain progenitors ex vivo tillater minst en kort undersøkelse av hindbrain NPC kinetics14. Likevel, i dag svært lite er kjent om spatiotemporal organisasjon og atferd av hindbrain NPCer i hele organ sammenheng.
Her viser vi en enkel og rask metode for å bruke hindbrain som kraftig modell for å analysere pattedyr NPC oppførsel i wholemount forberedelser og vev. Vi gir ytterligere for å bruke immunolabeling for å studere ulike neurogenesis parametere og prosess hindbrain prøver videre for nedstrøms molekylær programmer som kvantitative revers transkriptase (qRT)-PCR.
Denne protokollen beskriver hvordan du bruker mus embryonale hindbrain som modell for å studere mekanismer for utviklingsmessige neurogenesis. Bruker en rekke forskjellige immunolabeling metoder, hindbrain NPCer kan visualiseres og deres kvantifisert i vev deler eller hele orgel wholemounts. Enkel disseksjon og flat anatomi sikrer at hindbrain kan avbildes i en “åpen bok” å samle informasjon om orgel hele neurogenesis mønstre.
Vi videre vise at NPC morfologi og celle syklus-relaterte NPC plassering kan enkelt visualiseres i flytende- eller cryosections for hindbrain. Begge atferd kan utnyttes for å definere nye stamfar befolkninger, som er tidligere utført i pattedyr telencephalon20. For eksempel tidlig dannet Sox2+ neuroepithelia og Pax6+ apikale radial glia finnes i hindbrain21,22, men hindbrain mangler Tbr2+ basale progenitors3 .
Protokollen beskrevet her kan også tilpasses til å observere atferden til bestemte NPC subpopulasjoner av fluorescerende merkingsteknikker for live bildebehandling og/eller avstamning sporing i fast vev. Dette kan oppnås, for eksempel ved å studere hindbrains fra mus bærer den tamoxifen-induserbart transgene Sox1-iCreERT2 og Rosa26tdTomato reporter23.
I tillegg til styrke kunnskap om murine neurogenesis, kan studere hindbrain belyse bredt relevante neurogenic mekanismer som deles på tvers av arter, fordi hindbrain er en høyt konservert hjernen regionen som forventes å bli mer lik mellom virveldyr arter enn forebrain.
Som hindbrain neurogenesis foregår over et relativt kortere tidsvindu enn forebrain neurogenesis23, er det viktig å vurdere behovet for å sammenligne tilstrekkelig iscenesatt embryoer. Følgelig unngås eksperimentelle bias ved å telle og registrere antall somite par i et embryo før isolere sin hindbrain. Hindbrain vevet seg er skjøre og tang derfor bør håndteres forsiktig når skille hindbrain vev fra hodet mesenchyme og meninges; et par ‘praksis kjører’ kan derfor være lurt før Disseksjon av verdifulle embryo blir forsøkt. Videre skal hindbrains overføres fra en tube til en annen bruker en bred-fødte Pasteur pipette ikke med tang for å unngå skade (den pipette åpning kan utvides ved å kutte tips med ren saks). Til slutt, selv om det er uvanlig, omfanget av EdU/BrdU inkorporering S-fase NPCer kan være variabel, spesielt under kort (dvs., 1 h) pulser. For å forbedre merking, sikre at EdU/BrdU er oppløst riktig før du legger løsningen i sprøyten og injisere nøye i bukhulen. Dårlig injeksjoner, slik som de gjorde subcutaneously ved et uhell, vil føre til å miste eller overlapping EdU/BrdU løsningen og hindre den fra å komme inn sirkulasjon.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Vasiliki Chantzara for å utføre tidsbestemt parring og ansatte på biologiske ressursenheten på UCL Institute of Ophthalmology for musen dyrehold. Denne studien ble støttet av en Wellcome Trust etterforsker Award 095623/Z/11/Z CR.
Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
Mowiol | Millipore | 475904 | |
OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
Thermometer | VWR | 620-0858 | |
Cover glass | VWR | 631-0137 | |
Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |