Summary
Denne artikkelen viser hvordan mus embryonale hindbrain kan brukes som modell for å studere utviklingsmessige neurogenesis både hele orgel og vev delen forberedelser.
Abstract
Musen embryoet forebrain er vanligvis ansatt system for å studere pattedyr neurogenesis under utvikling. Men er svært foldet forebrain neuroepithelium ikke mottakelig for wholemount analyse undersøke orgel hele neurogenesis mønstre. Videre er definere mekanismer for forebrain neurogenesis ikke nødvendigvis prediktive for neurogenesis i andre deler av hjernen; for eksempel på grunn av tilstedeværelsen av forebrain-spesifikke stamfar undergrupper. Mus-hindbrain gir en alternativ modell for å studere embryonale neurogenesis som passer til wholemount analyse, samt vev deler å observere spatiotemporal distribusjon og oppførsel av nevrale progenitors. Dessuten er det enkelt dissekert for andre nedstrøms programmer, for eksempel celle isolasjon eller molekylærbiologi analyse. Som musen hindbrain kan lett bli analysert i stort antall celle avstamning reporter og mutant musa stammer som har blitt tilgjengelig, tilbyr det en kraftig modell for å studere cellulære og molekylære mekanismer av utviklingsmessige neurogenesis i et pattedyr organisme. Her presenterer vi en enkel og rask metode for å bruke musen fosteret hindbrain for å analysere pattedyr nevrale celle (NPC) atferd i wholemount forberedelser og vev.
Introduction
Under embryonale utviklingen av pattedyr dele NPCer i ventrikkel (VZ) og subventricular (SVZ) soner av den voksende neuroepithelium å generere nye nerveceller i en prosess kalt 'neurogenesis'. Generering av nye nerveceller og NPC forgjengere har blitt undersøkt grundig i forebrain1, mens mindre er kjent om denne prosessen i andre regioner.
Forebrain er en kompleks og intrikat foldet struktur som er i stor grad studerte histologiske metoder etter vev snitting som gjør forstå neurogenesis mønstre over hele orgel utfordrende. I tillegg er studier av forebrain neurogenesis ikke nødvendigvis prediktiv neurogenic atferd i andre områder av hjernen eller ryggmargen. For eksempel signalnettverk signaler kan framprovosere ulike reaksjoner på tvers av atskilte CNS områder, som observert ciliary nevrotropisk faktor og leukemi hemmende faktor, som fremmer selvtillit fornyelse av NPCer i laterale ganglionic anseelse, men stasjonen differensiering av ryggmargen progenitors2. Videre en underklasse av NPCer som fyller utvikle forebrain og bidra vesentlig til utvidelse av hjernebarken1 er fraværende fra de hindbrain og ryggmargen3. Omvendt, er det tenkelig at ryggmargen og hindbrain inneholder alternative NPC subtyper finnes ikke i cortex.
Musen fosteret hindbrain er evolusjonære eldste regionen pattedyr hjernen og genererer lillehjernen og hjernestammen. Til tross for sin bevaring tvers av arter, er relativt lite kjent om hindbrain neurogenesis, inkludert NPC subtyper eller deres regulering. Fleste av hindbrain forskningen musen har fokusert på prosessen med vev segmentering, drevet av Hox gener4og mønster etter mitotisk neurons5. I tillegg har til hindbrain blitt brukt som modell for å studere mekanismer av utviklingsmessige angiogenese6.
I motsetning til musen hindbrain, har sebrafisk-hindbrain vært brukt mye NPC differensiering og avstamning progresjon i en virveldyr modell organisme (f.eks,7,8). Den dama hindbrain har også vært ansatt å studere neurogenesis under virveldyrenes utvikling (f.eks,9,10). Ligner på sebrafisk hindbrain11, chick-hindbrain kan være live fotografert for å studere NPC atferd og regulering over tid12. Analoge langsgående observasjon av live bildebehandling er ikke tiden mulig i pattedyr organismer, ettersom de utvikler i utero. Videre målrettet manipulasjon gjennom teknikker som electroporation kan lett brukes på frittlevende sebrafisk embryo eller kylling embryoer i ovo (f.eks,13), men slike teknikker er også mer utfordrende i Utero.
Likevel er musen fosteret hindbrain utsøkt egnet til å definere molekylære og cellulære mekanismer som styrer neurogenesis. For det første vil analyse av musen hindbrain i mange tilfeller gir informasjon som er mer relevante for mennesker utvikling enn fra studere lavere virveldyr. Videre et stort antall genmodifiserte musen stammer er tilgjengelig som enten kan bli brukt for skjebne kartlegging murine NPCer eller endre regulatoriske mekanismer med grunnleggende eller betinget mutant alleler av relevante gener. Til slutt, har nylig vist at microinjection av ventrikkel hindbrain progenitors ex vivo tillater minst en kort undersøkelse av hindbrain NPC kinetics14. Likevel, i dag svært lite er kjent om spatiotemporal organisasjon og atferd av hindbrain NPCer i hele organ sammenheng.
Her viser vi en enkel og rask metode for å bruke hindbrain som kraftig modell for å analysere pattedyr NPC oppførsel i wholemount forberedelser og vev. Vi gir ytterligere for å bruke immunolabeling for å studere ulike neurogenesis parametere og prosess hindbrain prøver videre for nedstrøms molekylær programmer som kvantitative revers transkriptase (qRT)-PCR.
Protocol
Alle dyr arbeid ble utført i henhold til UK Home Office og lokale etiske retningslinjer.
1. oversikt over trinnene og tidsbruken
- Utføre tidsbestemt parring voksen mus fra en belastninger egnet til biologiske svar under etterforskning hente embryonale dag (e) 9.5-e13.5 svangerskap; krever 12-15 dager.
- Eventuelt forberede 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) / 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) løsning og utføre injeksjon (Protocol inndeling 2); krever ~ 1 h på dagen før eller dagen av embryoet isolasjon, avhengig av ønsket lengden av EdU/BrdU merking.
- Utføre embryoet isolasjon og hindbrain disseksjon (Protocol avsnitt 3); krever ~ 10 min/fosteret.
- Utføre wholemount immunofluorescence merking (Protocol seksjon 4); krever 3 dager.
- Delen med en vibratome og utføre flytende delen immunofluorescence merking (Protocol seksjon 4): krever 2 dager.
- Delen bruker en kryostaten og utføre immunofluorescence merking av cryosections (Protocol seksjon 5); krever 2 dager.
2. injisere gravid kvinne musen med BrdU eller EdU (valgfritt)
- Oppløse BrdU eller EdU i sterilt fosfat bufret saltvann (PBS) til konsentrasjoner av 10 mg/mL og 1 mg/mL, henholdsvis.
Forsiktig: BrdU og EdU er giftig; Bruk passende beskyttelse. - Veie gravid musen og beregne volumet av BrdU eller EdU løsning som skal administreres for å nå 100 mg/kg BrdU eller 5 mg/kg EdU.
- Sette inn BrdU eller EdU løsning gjennom intraperitoneal ruten enten 1 h eller 1 dag før samle embryoer, avhengig av den påkrevde lengden for merking.
Merk: Merking 1t visualiserer hindbrain celler i S-fase. Merking for 1 dag visualiserer avkommet fra hindbrain NPCer.
3. Disseksjon av Hindbrains fra e9.5 - e13.5 mus embryo
- Euthanize tidsbestemte-gravide kvinner musen bruker en etisk godkjent prosedyre på nødvendige svangerskapsdiabetes scenen (f.eks, cervical forvridning). Bruke skarp saks, klippes bukhulen og nøye avgiftsdirektoratet livmoren. Plass forbrukeravgift livmoren som inneholder embryoene til en 60 mm plast rett som inneholder 20 mL iskald PBS.
Merk: Steril teknikk er ikke nødvendig. - Utføre alle ytterligere disseksjon bruker dissecting mikroskop. Bruker urmaker tang nummer 5, rive livmor muskler veggen for å vise embryoene, frigi hver fosteret ved severing navlestrengen og fjerne plommesekken.
- Med en bred-fødte åpne en steril Pasteur pipette, Overfør hver embryoet til en ren plast parabolen med iskald PBS.
- Bruker urmaker tang nummer 55, bryte hodet (figur 1E).
- Du kan også beholde et lite stykke vev (f.ekslag ¼ av en eggeplomme sac eller ca 2 mm halen tips) for genomisk DNA isolasjon og påfølgende genotyperingteknologi.
- Bruker urmaker tang nummer 55, avgiftsdirektoratet vev som inneholder hindbrain parallell til og umiddelbart under hindbrain neuroepithelium til å skille den fra ansikts- og forebrain vev (figur 1F).
- Plassere hindbrain og caudal hodet vev dorsal side opp og identifisere 4th ventrikkel, som er dekket av en tynn vev (takplate). Nøye pierce takplate med urmaker tang nummer 55 (figur 1G) og skrelle bort overflødig vev med tang, flytte rostrally langs midtlinjen over mellomhjernen, og deretter caudally over bakre hindbrain og ryggmargen (figur 1G ); hindbrain skal nå være eksponert i en åpen bok forberedelse (figur 1 H).
- Forberede hindbrains wholemount immunolabeling (alternativ 1).
- Bruker urmaker tang nummer 55, nøye erte bort gjenværende hodet mesenchyme og noen meninges knyttet til pial siden av hindbrain ved hjelp av pinsett (figur 1I). Fjern mellomhjernen og ryggmargen vev (figur 1J) å forlate bare hindbrain vev (figur 1 K).
Merk: Dette trinnet i prosedyren skal ikke følges på e9.5 eller e10.5, fordi forsøk vil sannsynligvis skade hindbrain neuroepithelium; Videre er fjerne meninges ikke nødvendig fordi den hindbrain neuroepithelium er tilstrekkelig tynn å tillate effektiv gjennomtrengning av antistoffer for immunolabeling. Dette trinnet bør imidlertid, følges fra e11.5, når meningeal vevet konsoliderer, for å forbedre antistoff gjennomtrengning i hindbrain neuroepithelium. Disseksjon er lettest når utført i iskalde PBS (bruk ren PBS for hver hindbrain).
- Bruker urmaker tang nummer 55, nøye erte bort gjenværende hodet mesenchyme og noen meninges knyttet til pial siden av hindbrain ved hjelp av pinsett (figur 1I). Fjern mellomhjernen og ryggmargen vev (figur 1J) å forlate bare hindbrain vev (figur 1 K).
- Forberede hindbrains for vibratome og og kryosnitt (alternativ 2)
- Bruker urmaker tang nummer 55, Fjern mellomhjernen og ryggmargen vev (figur 1J).
Merk: Det er ikke nødvendig å fjerne mesenchyme og meninges av hindbrains beregnet for snitting (som vist i figur 1I).
- Bruker urmaker tang nummer 55, Fjern mellomhjernen og ryggmargen vev (figur 1J).
- Overføre hindbrains fra plast retten til rund bunn 2 mL rør med en Pasteur pipette, Sug opp alle PBS og fastsette for 2t 4° c med mild-agitasjon fersk tinte 4% w/v formaldehyd oppløst i PBS.
Forsiktig: Formaldehyd er giftig; Bruk passende beskyttelse. - Skyll hindbrains 3 x ganger med PBS. Lagre på 4 ° C i PBS hvis immunolabeling vil begynne innen 2-3 dager eller erstatte PBS med 50% methanol/50% PBS i 5 minutter før du overfører til 100% metanol for lengre lagring på-20° C.
4. Wholemount Immunofluorescence
- Eventuelt rehydrate hindbrains i å redusere serielt fortynninger av metanol i PBS (f.eks, 75% metanol, 50% metanol, 25% metanol) ved romtemperatur (RT) for 5 min og deretter overføre til PBS.
Merk: En gradert serie av metanol er nødvendig å forsiktig rehydrate hindbrains og sikre riktig vev bevaring. - Permeabilize hindbrains i 30 min på 4 ° C i PBS 0,1 prosent Triton X-100 (PBT) med mild agitasjon.
- Inkuber hindbrains 1t på 4 ° C i PBT inneholder 10% inaktivert geit serum med mild agitasjon.
Merk: Bruk serum fra verten arter som sekundær antistoffer ble reist i. For primære antistoffer i geit, ruge i serum-free protein blokkere, for eksempel 5% bovin serum albumin i PBS eller et egnet kommersielle alternativ (se Tabell for materiale). Dette vil redusere ikke-spesifikk flekker ofte observert ved primære antistoffer i geit. - Inkuber hindbrains overnatting på 4 ° C i PBT som inneholder 1% inaktivert serum og primære antistoffer med mild agitasjon (f.eks, kanin anti-phospho histone H3 [pHH3] fortynnet 1:400).
Merk: For primære antistoffer i geit, bruke PBT uten serum. - Vask hindbrains på 4 ° C 5 x med PBT 1t hver.
- Inkuber hindbrains overnatting på 4 ° C i PBT inneholder riktig fluorophore-konjugerte sekundære antistoffer (f.eks, geit anti-kanin Alexa Fluor 488) i 1:200 i PBT rettet mot primære antistoffer brukes. Hold hindbrains i mørket her på å beskytte fluorophores fra photobleaching.
Merk: For primære antistoffer i geit, bruke anti-geit Fab fragmenter av sekundær antistoffer for å redusere ikke-spesifikk farging. - Vask hindbrains på 4 ° C 5 x med PBT 1t hver.
- Postfix hindbrains i 4% formaldehyd i PBS i 15 min på RT for langsiktig bevaring av antistoff binding. Skyll kort to ganger på PBS.
- Dekker en barometer microscope skyve med to lag med svart elektrisk tape og avgiftsdirektoratet en liten firkant fra lag tape å danne en lomme som er stor nok til en hindbrain.
- Overføre hver hindbrain i en lomme med en Pasteur pipette, fjerne overflødig væske og legge til en passende antifade reagensen i lommen før dekker den sakte med et glass dekkglassvæske å unngå overtrykk luftbobler under dekkglassvæske. Seal dekkglassvæske og fester den til lysbildet med et tynt lag av neglelakk. Lagre lysbilde 4 ° C i mørket til bildeopptak (Protocol del 7).
5. Vibratome snitting og flytende delen Immunofluorescence
- Eventuelt rehydrate hindbrains fra metanol som beskrevet i trinn 4.1.
- Bygge inn hindbrains i smeltet 3% w/v agarose i destillert vann.
Merk: Tillat smeltet agarose å kjøle ca 55° c kort før innebygging for å hindre varmeskade hindbrain. - Kuttet tverrgående hindbrain deler til en tykkelse på 70 µm ved hjelp av en vibratome. Overføre avsnittene fersk kuttet med en pensel i en brønn av en 24-vel plate som inneholder iskald PBS.
- Merk avsnittene flytende som beskrevet i trinn 4.2-4.7, men endre trinnene som følger: vask flytende seksjoner på 4 ° C 3 x med PBT 15 minutter hver, redusere inkubasjon tid for sekundær antistoffer mot 2t og ruge i sekundære antistoff på RT.
- Eventuelt etter merking med antistoffer for andre epitoper som beskrevet i trinn 5.4, oppdage EdU+ kjerner bruker en EdU merking kit i henhold til produsentens instruksjoner. Inkuber avsnittene flytende i reaksjonen cocktail i 30 min på 37 ° C i mørket. Vask hindbrain seksjoner på 4 ° C 3 x med PBT i 15 min.
- Eventuelt etter merking for andre epitoper som beskrevet i trinn 5.4, oppdage BrdU+ kjerner som følger.
- Inkuber flytende inndelinger i 2 N saltsyre på 37 ° C i 30 min i mørket.
- Inkuber flytende deler i 0.1 M natriumborat buffer pH 8.5 to ganger i 5 min hver på RT i mørket for å nøytralisere saltsyre.
- Vask flytende deler 3 x kort i PBS 4 ° C.
- Utføre immunofluorescence merkingsteknikker for BrdU som beskrevet i trinn 5.4.
- Inkuber delene flytende i 2 minutter på RT i 10 µg/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) i PBS skal counterstain celle kjerner.
- Postfix avsnittene flytende i 4% formaldehyd i 15 min på RT.
- Vask flytende deler kort i PBS. Nøye overføre flytende deler til en barometer microscope skyve ved hjelp av en pensel. Tørke opp overflødig PBS rundt delen blotting papir eller vev.
- Montere delene med 80% glyserol i PBS og dekk sakte med et glass dekkglassvæske for å unngå overtrykk luftbobler. Lagre lysbilde 4 ° C i mørket til bildeopptak (trinn 7).
6. kryostaten snitting og Cryosection Immunofluorescence merking
- Eventuelt rehydrate hindbrains fra metanol som beskrevet i trinn 4.1.
- Inkuber hindbrains i 30% w/v sukrose i PBS til cryoprotect hindbrains før frysing.
Merk: Hindbrains er klar for frysing når de har sunket til bunnen av røret, noe som vanligvis skjer ≤ 2t for e9.5-10.5 hindbrains og 3-6t for e11.5-13,5 hindbrains. - Senk hindbrains i optisk kutte temperatur sammensatte (OCT) og fryse raskt ved å overføre formene inneholder hindbrains i OCT til isopentane kjølt ned til mellom 40 ° C og-50 ° C på tørris.
Merk: Frosne, innebygde hindbrains kan lagres på 20 ° C kortsiktige og langsiktige-80 ° C før snitting. - Kuttet tverrgående hindbrain deler til en tykkelse på 10 µm bruker kryostaten og overføring til elektrostatisk selvklebende objektglass.
Merk: Hindbrain cryosections kan lagres på 20 ° C kortsiktige og langsiktige-80 ° C før merking. - Inkuber lysbilder på RT i 15 min tørke deler på lysbildene. Vask cryosections med PBS å oppløse OCT og merke en hydrofobe barriere rundt cryosections bruke PAP penn. Gjenta 5.4-5.8.
- Gjenta trinn 5.10 bruke en polyvinylacetat alkohol-basert montering middels i stedet for glyserol.
7. bildeopptak
- Bilde prøver ved å bruke en epifluorescent eller AC confocal laserskanning mikroskopet utstyrt med linser egnet for vandige media-montert lysbilder og optiske filtre egnet for fluorophores brukes for immunolabeling.
- For å bilde på hele hindbrain eller en hindbrain del, bruke en linse for 10 x forstørrelse (f.eks figur 2B); for å visualisere hindbrains områder for kvantifisering, bruk en 40 X forstørrelse (f.eks figur 2D) og for å visualisere enkeltceller, bruke en linse med en 63 x forstørrelse (f.eks figur 2C).
8. alternative metoder
- Følgende trinn 3.8, homogenize unfixed hindbrains å produsere en enkeltcelle suspensjon for flowcytometri programmer15.
- Følgende trinn 3.8, homogenize unfixed hindbrains å ekstra RNA fra enkelt celle suspensjoner for RT-qPCR (f.eks, 16).
Merk: Kontroller at alle reagenser og utstyr holdes sterile og RNase-gratis gjennom å hindre nedbrytning av RNA. - Følgende trinn 3.8, homogenize unfixed hindbrains å isolere NPCer og spre dem i vitro som neurospheres for analyse av hindbrain NPC atferd17.
Merk: Kontroller at alle reagenser og utstyr holdes sterilt å hindre bakteriell/fungal smitte av neurosphere kulturer.
Representative Results
Denne delen viser eksempler på resultatene som kan oppnås når studere neurogenesis i mus embryonale hindbrain gjennom wholemount og vev delen analyse.
Vi viser at wholemount immunolabeling av microdissected hindbrain med et antistoff for mitotisk markør pHH3 visualiserer dele NPCer i VZ (figur 2B - D). Vi viser pHH3+ NPCer på en høy forstørrelse til å markere ulike stadier av mitose (figur 2C). Vi har illustrert som denne merking metoden er egnet skal utføres på tvers av flere etapper av hindbrain utvikling å observere time course of NPC mitose i dette organ (figur 2D).
Vi viser at imaging tverrgående immunolabeled vibratome deler av hindbrain 1t etter EdU injeksjon, visualiserer cleavage retningen av mitotisk NPCer (figur 3B), pseudostratified, interkinetic kjernefysiske migrasjon mønster av sykling progenitors18 (figur 3B, D), og den overordnede VZ strukturen (figur 3B - D). Merk at mitotisk pHH3+ NPCer finnes bare på ventrikkel overflaten og ikke mer basally (Figur 3 c), som kontrastene basale divisjon mønster av mer forpliktende NPCer i forebrain19.
Vi viser også hvordan sykling NPCer og deres differensiert avkom kan merkes med BrdU eller EdU å vurdere NPC avstamning progresjon (Figur 4). Immunolabeling av tverrgående cryosections av musen hindbrain 1 dag etter BrdU injeksjon for BrdU og Ki67viser nummeret og plasseringen av sykling NPCer i neuroepithelium (figur 4A, B) der antall selv fornye NPCer kan defineres ved å beregne prosentandelen av Ki67+ BrdU+ celler blant alle BrdU+ celler (figur 4A, C).
Endelig viser vi et eksempel på immunolabeling av hindbrain vibratome for RC2, et antigen i nevrale-spesifikke intermediære nestin, for å visualisere NPC endfeet (figur 5B) og prosesser (figur 5C). Vibratome deler, i stedet for tynne cryosections, gir forbedret observasjon av svært forgrenet NPCer og også samlet neuroepithelial struktur.
Figur 1 : Nøkkel trinn i Disseksjon av en hindbrain fra et e11.5 musen embryo. (En - D) Skjematisk fremstilling av hindbrain microdissection. (A) caudal hodet vevet fjernes ved severing langs de røde prikkede linjene. (B) tak platen er gjennomboret og deretter revet bort i både rostral og caudal retninger langs midtlinjen (loddrett rød linje) og deretter til siden for å avsløre hindbrain neuroepithelium. (C) i neuroepithelium er pried fra meninges CDROM tang mellom begge strukturer, og mellomhjernen og ryggmargen vev fjernes ved severing vevet med tang langs de røde prikkede linjene. (D) denne prosedyren gir en flat hindbrain. (E-K) Image fange av viktige stadier i hindbrain microdissection prosedyren. (E) embryoet er decapitated ved severing langs den prikkede linjen. (F) av hindbrain og 4th ventrikkel, omsluttet av taket plate, er forbrukeravgift og atskilt fra hodet ved severing langs prikkete. (G) 4th ventrikkel er orientert oppover før et lite hull er gjennomboret inn i taket plate (stjerne). Hullet er utvidet av peeling vevet nøye både rostrally og caudally langs midtlinjen (piler) å avsløre hindbrain. Hindbrain er plassert pial side ned og venstre til å kaste ut i en åpen bok forberedelse (H; svart pilspiss angir hindbrain nevrale vev). Hvis hindbrain kreves for wholemount immunolabeling, fjernes pial membranen av forsiktig lirke den hindbrain neuroepithelium fra omkringliggende meningeal membraner ved hjelp av pinsett (jeg). Overflødig mellomhjernen (mb) og ryggmargen (sc) vev er fjernet (prikkede linjer i J) å isolere hindbrain (K). Skala bar: 500 µm (E), 300 µm (F - K). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Wholemount immunolabeling kan brukes å kvantifisere NPC mitoses over hindbrain. (A) skjematisk illustrerer en møte avbilding av mitotisk NPCer i hindbrain ventrikkel laget. V, ventrikulær hindbrain siden; P, pial hindbrain side. (B) AC Confocal flis skanning z stabel av e10.5 hindbrain etter wholemount immunolabeling for mitotisk markør pHH3 (rød). Den hvite boksen angir området som vises på høyere forstørrelsesnivået i det andre panelet i (D). (C) pre anaphase (hvitt pilhode) og anaphase (svart pilspiss) mitotisk tall er gjenkjennelig i vil total kohort for mitotisk NPCer. (D) gang løpet av wholemount pHH3 merking fra e9.5-13,5. Skalere barer: 500 µm i (B); 20 µm i (C); 100 µm i (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Sykling NPCer innen germinal sonen i den rostral hindbrain. (A) skjematisk som viser plasseringen av mitotisk (grønn) og S-fase (rød) NPCer hindbrain ventrikkel overflaten og i periventricular området, henholdsvis. En virtuell Tversnitt av hindbrain vises i høyere forstørrelse til høyre. Svarte pilen viser retningen på overføring av NPC avkom som har gått ut celle syklus mot sonen differensiering. (B) AC Confocal z stabel med en flytende e11.0 hindbrain delen fra et embryo som fikk en 1t EdU puls; immunolabeling for pHH3 og EdU ble brukt til å visualisere mitotisk (grønn) og S-fase (rød) NPCer, henholdsvis. Hindbrain overflater er merket som stiplede linjer; V, ventrikulær hindbrain siden; P, pial hindbrain side. Området angitt av en hvit boks vises på høyere forstørrelsesnivået i rammemarg; pilene angir cleavage flyet en NPC i anaphase, i forhold til ventrikkel overflaten. (C) enkeltkanals viser pHH3 immunolabeling bare. Mitotisk NPCer angis med cyan pilspisser; mangel på basale divisjoner angis med Δ. (D) enkeltkanals vise EdU merking bare. EdU+ NPCer vedta en pseudostratified distribusjon på grunn av deres interkinetic kjernefysiske migrasjon. Avstanden som NPCer migrere fra ventrikkel overflaten kan måles, som indikeres med en representant oransje linje. Skalere barer: 100 µm i (B -D); 10 µm i rammemarg i (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Kombinere BrdU med Ki67 merking til hindbrain NPC selvtillit fornyelse kapasitet. (A) AC Confocal z stabel med en e10.5 hindbrain cryosection etter merking for Ki67 (grønn) og BrdU (rød) etter en 1 dag BrdU puls. Dobbel-positive celler i sonen ventrikkel er NPCer som har tatt BrdU og fortsatt går gjennom cellen syklusen, som angitt av Ki67 merking. Andelen av dobbel-merket cellene blant BrdU+ befolkningen representerer prosentdelen av selv fornyende NPCer. (B, C) enkelt kanaler viser Ki67 (B) og BrdU (C) immunolabeling bare. En BrdU+ celle som mangler Ki67 og derfor har trolig gått ut celle syklus angis av en cyan pilspissen i (A,C). Hindbrain overflater er merket som stiplede linjer; V, ventrikulær hindbrain siden; P, pial hindbrain side. Skala bar: 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Nestin immunolabeling visualiserer NPC prosesser og endfeet. (En - C) Immunofluorescence for RC2, som gjenkjenner en epitope på den nevrale intermediære nestin, illustrerer NPC morfologi over hindbrain-neuroepithelium. (A) AC Confocal z stabel med en flytende delen fra en e11.5 hindbrain etter RC2 immunolabeling; boksområdene vises på høyere forstørrelsesnivået i (B, B', apikale/ventrikkel regionen) og (C, C'; basale regionen). Hindbrain overflater er merket som stiplede linjer; V, ventrikulær hindbrain siden; P, pial hindbrain side. (B, C) AC confocal z stabler av boksområdene i (A); enkelt optisk delene vises i (B', C'), henholdsvis. En NPC apikale endfoot ved ventrikkel overflaten er angitt med en pil i (B'). Enkelt og fasciculated NPC prosesser er angitt med hvite og sorte pilspisser i (C'), henholdsvis. Skalere barer: 100 µm, (A); 25 µm (B, C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Denne protokollen beskriver hvordan du bruker mus embryonale hindbrain som modell for å studere mekanismer for utviklingsmessige neurogenesis. Bruker en rekke forskjellige immunolabeling metoder, hindbrain NPCer kan visualiseres og deres kvantifisert i vev deler eller hele orgel wholemounts. Enkel disseksjon og flat anatomi sikrer at hindbrain kan avbildes i en "åpen bok" å samle informasjon om orgel hele neurogenesis mønstre.
Vi videre vise at NPC morfologi og celle syklus-relaterte NPC plassering kan enkelt visualiseres i flytende- eller cryosections for hindbrain. Begge atferd kan utnyttes for å definere nye stamfar befolkninger, som er tidligere utført i pattedyr telencephalon20. For eksempel tidlig dannet Sox2+ neuroepithelia og Pax6+ apikale radial glia finnes i hindbrain21,22, men hindbrain mangler Tbr2+ basale progenitors3 .
Protokollen beskrevet her kan også tilpasses til å observere atferden til bestemte NPC subpopulasjoner av fluorescerende merkingsteknikker for live bildebehandling og/eller avstamning sporing i fast vev. Dette kan oppnås, for eksempel ved å studere hindbrains fra mus bærer den tamoxifen-induserbart transgene Sox1-iCreERT2 og Rosa26tdTomato reporter23.
I tillegg til styrke kunnskap om murine neurogenesis, kan studere hindbrain belyse bredt relevante neurogenic mekanismer som deles på tvers av arter, fordi hindbrain er en høyt konservert hjernen regionen som forventes å bli mer lik mellom virveldyr arter enn forebrain.
Som hindbrain neurogenesis foregår over et relativt kortere tidsvindu enn forebrain neurogenesis23, er det viktig å vurdere behovet for å sammenligne tilstrekkelig iscenesatt embryoer. Følgelig unngås eksperimentelle bias ved å telle og registrere antall somite par i et embryo før isolere sin hindbrain. Hindbrain vevet seg er skjøre og tang derfor bør håndteres forsiktig når skille hindbrain vev fra hodet mesenchyme og meninges; et par 'praksis kjører' kan derfor være lurt før Disseksjon av verdifulle embryo blir forsøkt. Videre skal hindbrains overføres fra en tube til en annen bruker en bred-fødte Pasteur pipette ikke med tang for å unngå skade (den pipette åpning kan utvides ved å kutte tips med ren saks). Til slutt, selv om det er uvanlig, omfanget av EdU/BrdU inkorporering S-fase NPCer kan være variabel, spesielt under kort (dvs., 1 h) pulser. For å forbedre merking, sikre at EdU/BrdU er oppløst riktig før du legger løsningen i sprøyten og injisere nøye i bukhulen. Dårlig injeksjoner, slik som de gjorde subcutaneously ved et uhell, vil føre til å miste eller overlapping EdU/BrdU løsningen og hindre den fra å komme inn sirkulasjon.
Disclosures
Ingen av forfatterne har konkurrerende interesser eller motstridende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Vasiliki Chantzara for å utføre tidsbestemt parring og ansatte på biologiske ressursenheten på UCL Institute of Ophthalmology for musen dyrehold. Denne studien ble støttet av en Wellcome Trust etterforsker Award 095623/Z/11/Z CR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
| Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
| Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
| Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
| Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
| Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
| 29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
| Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
| Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
| Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
| Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
| 5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
| Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
| Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
| Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
| Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
| Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
| Mowiol | Millipore | 475904 | |
| OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
| Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
| Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
| Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
| Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
| Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Thermometer | VWR | 620-0858 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |
References
- Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).
- Gregg, C., Weiss, S. CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain. Development. 132 (3), 565-578 (2005).
- Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).
- Krumlauf, R. Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments. Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).
- Guthrie, S. Patterning and axon guidance of cranial motor neurons. Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).
- Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis. Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).
- Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis. Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).
- Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors. Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).
- Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS. Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).
- Jacob, J., et al. Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1. Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
- Peretz, Y., et al. A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2. BMC Biol. 14, 57 (2016).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. J Vis Exp. (26), (2009).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hutton, S. R., Pevny, L. H. SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon. Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Sauer, F.
- Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex. Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nat Commun. 4, 2125 (2013).
- Fantin, A., et al. Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction. Blood. 116 (5), 829-840 (2010).
- Kayam, G., et al. A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain. Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).
- Tata, M., et al. Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).
