Este artigo demonstra como o rombencéfalo embrionário do mouse pode ser usado como um modelo para o estudo do desenvolvimento neurogênese em todo órgão e preparações em tecido.
O prosencéfalo de embrião de rato é o sistema mais comumente empregado para estudar mamíferos neurogênese durante o desenvolvimento. No entanto, o prosencéfalo altamente dobrado neuroepithelium não é passível de análise de wholemount para examinar os padrões de todo o órgão neurogênese. Além disso, definir os mecanismos da neurogênese prosencéfalo não é necessariamente preditivo da neurogênese em outras partes do cérebro; por exemplo, devido à presença de subtipos específicos do prosencéfalo progenitoras. O rombencéfalo rato fornece um modelo alternativo para estudar neurogênese embrionário que é passível de análise wholemount, bem como cortes de tecido para observar a spatiotemporal distribuição e comportamento de progenitores neurais. Além disso, ele é facilmente dissecado para outras aplicações a jusante, tais como análise de isolamento ou biologia molecular de células. Como o rombencéfalo do mouse pode ser prontamente analisado no vasto número de repórter de linhagem de células e cepas de rato mutante que se tornaram disponíveis, oferece um poderoso modelo para o estudo dos mecanismos celulares e moleculares da neurogênese no desenvolvimento em um mamífero organismo. Aqui, apresentamos um método simples e rápido para usar o rombencéfalo de embrião de rato para analisar o comportamento de célula (NPC) mamíferos progenitoras neurais em preparações wholemount e cortes de tecido.
Durante o desenvolvimento embrionário dos mamíferos, NPCs dividem o ventricular (VZ) e subventricular zonas (SVZ) do neuroepithelium em expansão para gerar novos neurônios em um processo denominado ‘neurogênese’. A geração de novos neurônios e seus precursores do NPC foi investigada extensivamente no prosencéfalo1, embora menos é sabido sobre este processo em outras regiões.
O prosencéfalo é uma estrutura complexa e intricada dobrada que é largamente estudada com métodos histológicos após corte de tecido, que faz os padrões de neurogênese compreensão horizontal o órgão inteiro desafiador. Além disso, estudos de neurogênese prosencéfalo não são necessariamente preditivos de comportamento neurogênico em outras regiões do cérebro ou na medula espinhal. Por exemplo, sinalização de pistas podem eliciar respostas diferentes em regiões distintas do CNS, como observado no caso do fator neurotrófico ciliar e fator inibitório de leucemia, que promovem a auto-renovação de NPCs na eminência ganglionar lateral, mas de carro diferenciação da medula espinhal progenitores2. Além disso, uma subclasse dos NPCs que preencher o prosencéfalo em desenvolvimento e contribuir significativamente para a expansão do córtex cerebral1 estão ausentes do rombencéfalo e a medula espinhal3. Inversamente, é concebível que a medula espinhal e o rombencéfalo contenham subtipos NPC alternativos não está presentes no córtex.
O rombencéfalo de embrião de rato é a região mais antiga evolutiva dos cérebros dos mamíferos e gera o cerebelo e o tronco cerebral. Apesar de sua conservação em toda a espécie, relativamente pouco é conhecido sobre a neurogênese rombencéfalo, incluindo subtipos NPC ou seu regulamento. A maioria das pesquisas rombencéfalo no mouse centrou-se sobre o processo de segmentação de tecido, guiado por Hox genes4e a padronização dos neurônios pós mitóticas5. Além disso, o rombencéfalo tem sido usado como um modelo para estudar os mecanismos da angiogênese no desenvolvimento6.
Em contraste com o rombencéfalo de rato, o zebrafish rombencéfalo tem sido amplamente utilizado para seguir a diferenciação do NPC e progressão da linhagem de um organismo modelo vertebrados (por exemplo,7,8). O rombencéfalo miúda também tem sido empregado para estudar a neurogênese durante o desenvolvimento de vertebrados (por exemplo,9,,10). Semelhante do zebrafish rombencéfalo11, o rombencéfalo garota pode ser ao vivo fotografada para estudar o comportamento do NPC e o Regulamento sobre tempo12. Análoga observação longitudinal de imagem ao vivo não é atualmente possível em organismos mamíferos, porque eles desenvolvem no útero. Além disso, alvo de manipulação através de técnicas como electroporation pode ser facilmente aplicado a vida livre do zebrafish embriões ou garota embriões no ovo (por exemplo,13), mas tais técnicas são também mais desafiador em utero.
Não obstante, o rombencéfalo de embrião de rato é requintadamente adequado para definir os mecanismos moleculares e celulares que governam a neurogênese. Em primeiro lugar, análise do rombencéfalo rato, em muitos casos, fornecerá informações mais relevantes à evolução de seres humanos do que o obtido através do estudo de vertebrados inferiores. Além disso, dispomos de um vasto número de estirpes de rato geneticamente modificado que pode também ser usado para mapeamento murino NPCs de destino ou alterar mecanismos reguladores com alelos mutantes constitutivos ou condicionais de genes relevantes. Finalmente, recentemente tem sido demonstrado que microinjeção de ventricular rombencéfalo progenitores ex vivo permite que pelo menos um breve exame do rombencéfalo NPC cinética14. No entanto, actualmente, muito pouco é conhecido sobre a spatiotemporal organização e comportamento do rombencéfalo NPCs em um contexto de órgão inteiro.
Aqui, vamos demonstrar um método simples e rápido para usar o rombencéfalo como um poderoso modelo para analisar o comportamento dos mamíferos de NPC em preparações wholemount e cortes de tecido. Nós fornecemos mais protocolos para usar immunolabeling para estudar parâmetros diferentes neurogênese e processo rombencéfalo amostras adicionais para aplicações moleculares a jusante como transcriptase reversa quantitativa (qRT)-PCR.
Este protocolo descreve como usar o rombencéfalo embrionárias de rato como modelo para estudar os mecanismos da neurogênese no desenvolvimento. Usando uma variedade de métodos diferentes immunolabeling, rombencéfalo NPCs pode ser visualizado e o número deles quantificado em cortes de tecido ou órgão wholemounts. A facilidade de dissecção e anatomia plana garante que o rombencéfalo pode ser fotografado em uma preparação de ‘livro aberto’ para reunir informações sobre os padrões de todo o órgão neurogênese.
Ainda mais, mostramos que NPC morfologia e posicionamento de NPC relacionados ao ciclo celular podem ser facilmente visualizados em flutuante- ou cryosections do rombencéfalo. Ambos os comportamentos podem ser explorados para definir novas populações de progenitor, como anteriormente foi realizado no telencéfalo mamíferos20. Por exemplo, cedo formado Sox2+ neuroepithelia e Pax6+ apical glia radial estão presentes no rombencéfalo21,22, mas o rombencéfalo carece de progenitores basais de Tbr2+ 3 .
O protocolo descrito aqui também pode ser adaptado para observar o comportamento de subpopulações de NPC específicos através da marcação fluorescente para geração de imagens ao vivo e/ou rastreamento de linhagem em tecidos fixos. Isto pode ser conseguido, por exemplo, através do estudo hindbrains de ratos carregando o tamoxifeno-inducible do transgene Sox1-iCreERT2 e o Rosa26tdTomato repórter23.
Além de melhorar o conhecimento da neurogênese murino, estudar o rombencéfalo pode elucidar mecanismos neurogênicos amplamente relevantes que são compartilhados entre espécies, porque o rombencéfalo é uma região do cérebro altamente conservadas que é esperada para ser o mais semelhante entre espécies de vertebrados do prosencéfalo.
Neurogênese rombencéfalo se exerce sobre uma janela de tempo comparativamente mais curta que prosencéfalo neurogênese23, é importante considerar a necessidade de comparar adequadamente encenado embriões. Por conseguinte, viés experimental é evitada contando e registrando o número de pares de somite em um embrião antes de isolar seu rombencéfalo. O próprio tecido do rombencéfalo é frágil e fórceps deve portanto ser manuseado com cuidado quando separa o tecido rombencéfalo o mesênquima cabeça e meninges; um par de ‘prática pistas’, portanto, seria aconselhável antes de dissecação de embriões valiosos é tentada. Além disso, hindbrains devem ser transferidos de um tubo para outro usando uma pipeta Pasteur de largo diâmetro, em vez de com a pinça para evitar danos (abertura da pipeta pode ser alargada por corte da ponta com uma tesoura limpa). Finalmente, apesar de incomum, a extensão da incorporação de EdU/BrdU na fase S NPCs pode ser variável, em especial durante pulsos curtos (ou seja, 1 h). Para melhorar a rotulagem, certifique-se de que o EdU/BrdU é dissolvido corretamente antes de carregar a solução para a seringa e injete cuidadosamente na cavidade peritoneal. Injeções de pobres, como aqueles feitos por via subcutânea, por acidente, irão resultar em perda ou prendendo a solução EdU/BrdU e impedi-lo de entrar em circulação.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Vasiliki Chantzara para a realização de acasalamentos cronometrados e o pessoal da unidade de recursos biológicos no Instituto de oftalmologia a UCL para criação de rato. Este estudo foi suportado por um Wellcome Trust Investigator Award 095623/Z/11/Z para CR.
Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
Mowiol | Millipore | 475904 | |
OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
Thermometer | VWR | 620-0858 | |
Cover glass | VWR | 631-0137 | |
Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |