Denna artikel visar hur mus embryonala hindbrain kan användas som en modell för att studera utvecklingsmässiga neurogenes i både hela organ och vävnad avsnitt preparat.
Mus embryo framhjärnan är oftast anställda system för att studera däggdjur neurogenes under utveckling. Den mycket vikta framhjärnan neuroepithelium är dock inte mottaglig för wholemount analys för att undersöka organ-wide neurogenes mönster. Definiera mekanismerna av framhjärnan neurogenes är dessutom inte nödvändigtvis prediktiva för neurogenes i andra delar av hjärnan; exempelvis på grund av närvaron av framhjärnan-specifika stamceller undertyper. Mus hindbrain ger en alternativ modell för att studera embryonala neurogenes som är mottaglig för wholemount analys, liksom vävnadssnitt att iaktta spatiotemporal distribution och beteendet hos neurala stamfäder. Dessutom är det enkelt dissekeras för andra nedströms applikationer, såsom cell isolering eller molekylärbiologi analys. Som mus hindbrain kan lätt analyseras i det stora antalet cell härstamning reporter och muterade mus stammar som har blivit tillgängliga, erbjuder det en kraftfull modell för att studera de cellulära och molekylära mekanismerna av utvecklingstoxicitet neurogenes i ett däggdjur organismen. Här presenterar vi en enkel och snabb metod för att använda musen embryo hindbrain för att analysera däggdjur neurala stamceller cell (NPC) beteende i wholemount preparat och vävnadssnitt.
Under embryonalutvecklingen hos däggdjur dela NPCs i ventrikulära (VZ) och subventrikulära (SVZ) zonplanerar av den expanderande neuroepithelium att generera nya nervceller i en process som kallas ‘neurogenes’. Generering av nya nervceller och deras NPC prekursorer har undersökts utförligt i framhjärnan1, medan mindre är känt om denna process i andra regioner.
Framhjärnan är en komplex och sinnrikt vikta struktur som studeras i hög grad med histologiska metoder efter vävnad snittning, vilket gör förståelse neurogenes mönster över hela orgeln utmanande. Studier av framhjärnan neurogenes är dessutom inte nödvändigtvis prediktiva för neurogen beteende i andra regioner i hjärnan eller i ryggmärgen. Till exempel signalering ledtrådar kan framkalla olika svar i olika CNS regioner, som observerats vid ciliär neurotrofisk faktor och leukemi hämmande faktor, som främjar självförnyelse av NPC i laterala ganglieblockerande eminens, men enheten differentiering av ryggmärgen föräldraparets2. Dessutom en underklass av NPC som befolkar utveckla framhjärnan och bidrar väsentligt till expansion av hjärnbarken1 är frånvarande från hindbrain och ryggmärgen3. Omvänt, är det tänkbart att ryggmärgen och hindbrain innehåller alternativa NPC subtyper inte är närvarande i cortex.
Mus embryo hindbrain är evolutionärt äldsta regionen av däggdjur hjärnan och genererar lillhjärnan och hjärnstammen. Trots dess bevarande mellan arter, är relativt lite känt om hindbrain neurogenes, inklusive NPC undertyper eller deras reglering. Majoriteten av hindbrain forskning i musen har fokuserat på processen för vävnad segmentering, driven av Hox gener4och mönstringen av efter mitotiska nervceller5. Bakhjärnan har dessutom använts som modell för att studera mekanismerna för utvecklingstoxicitet angiogenes6.
I motsats till mus hindbrain, har zebrafisk bakhjärnan använts i stor utsträckning att följa NPC differentiering och härstamning progression i ryggradsdjur modellorganism (t.ex.,7,8). Chick hindbrain har också använts för att studera neurogenes under ryggradsdjur utveckling (t.ex.,9,10). Liknar zebrafisk bakhjärnan11, chick hindbrain kan vara levande avbildas för att studera NPC beteende och förordning över tid12. Likartade längsgående observation av levande imaging inte är för närvarande möjligt i däggdjur organismer, eftersom de utvecklas i livmodern. Dessutom riktade manipulation genom tekniker såsom elektroporation kan lätt appliceras på frilevande zebrafiskar embryon eller chick embryon i ovo (t.ex.13), men sådana tekniker är också mer utmanande i Utero.
Mus embryo hindbrain lämpar sig dock utsökt att definiera de molekylära och cellulära mekanismer som styr neurogenes. Analys av mus hindbrain kommer för det första, i många fall ge information som är mer relevant för människor utvecklingen än som erhålls genom att studera lägre ryggradsdjur. Dessutom, det finns ett stort antal genetiskt modifierade mus stammar att kan antingen användas för öde mappning murina NPC eller ändra reglerande mekanismer med konstituerande eller villkorlig muterade alleler av relevanta gener. Slutligen har det nyligen visats att Mikroskop av ventrikulära hindbrain föräldraparets ex vivo tillåter minst en kort genomgång av hindbrain NPC kinetik14. Ännu, i dagsläget, mycket lite är känt om spatiotemporal organisation och funktionssätt hindbrain NPCs i hela orgel sammanhang.
Här visar vi en enkel och snabb metod att använda bakhjärnan som en kraftfull modell för att analysera däggdjur NPC beteende i wholemount preparat och vävnadssnitt. Vi tillhandahåller ytterligare protokoll för att använda immunolabeling för att studera olika neurogenes parametrar och att processen hindbrain prover ytterligare för nedströms molekylär applikationer såsom kvantitativ omvänt transkriptas (qRT)-PCR.
Det här protokollet beskriver hur du använder mus embryonala bakhjärnan som en modell för att studera mekanismerna för utvecklingstoxicitet neurogenes. Använda en mängd olika immunolabeling metoder, hindbrain NPC kan visualiseras och deras antal kvantifieras i vävnadssnitt eller över organ wholemounts. Förenklar dissektion och platt anatomi säkerställer att hindbrain kan avbildas i en ‘öppen bok’ förberedelse att samla information om orgel-wide neurogenes mönster.
Vi visar vidare att NPC morfologi och cellcykeln-relaterade NPC positionering enkelt kan visualiseras i flytande- eller kryosnitt av bakhjärnan. Båda beteenden kan utnyttjas för att definiera nya stamceller populationer, som tidigare har fullgjorts i däggdjur telencephalon20. Till exempel tidig-bildade Sox2+ neuroepithelia och Pax6+ apikala radiella glia är närvarande i hindbrain21,22, men hindbrain saknar Tbr2+ basala föräldraparets3 .
Protokollet beskrivs här kan också anpassas till observera beteendet hos specifika NPC subpopulations av fluorescerande märkning för levande imaging eller lineage tracing i fasta vävnader. Detta kan uppnås, till exempel genom att studera hindbrains från möss bära den tamoxifen-inducerbara Sox1-iCreERT2 -transgenens och den Rosa26tdTomato reporter23.
Förutom att förbättra kunskapen om murina neurogenes, kan studera hindbrain belysa i huvudsak relevanta neurogena mekanismer som delas av alla arter, eftersom hindbrain är en mycket hjärnregionen som förväntas vara mer lik mellan ryggradsdjur än framhjärnan.
Som hindbrain neurogenes äger rum över en jämförelsevis kortare tidsfönster än framhjärnan neurogenes23, är det viktigt att överväga behovet av att jämföra tillräckligt iscensatt embryon. Således undviks experimentellt partiskhet genom att räkna och registrera antalet somite par i ett embryo före isolera dess hindbrain. Hindbrain vävnaden själv är bräcklig och pincett ska därför hanteras noggrant när separera hindbrain vävnaden från huvudet mesenchyme och hjärnhinnorna; ett par av ‘praktiken körningar’ kan därför vara lämpligt innan dissektion av värdefulla embryon är försök. Dessutom bör hindbrains överföras från en tub till en annan med en wide-bore Pasteur-pipett i stället för med pincett för att undvika skador (pipettens öppning kan utvidgas genom att skära av spetsen med ren sax). Slutligen, även om det är ovanligt, omfattningen av EdU/BrdU införlivande i S-fas NPC kan vara variabel, i synnerhet under kort (dvs, 1 h) pulser. För att förbättra märkning, säkerställa att EdU/BrdU löses upp ordentligt innan du laddar lösningen i sprutan och injicera försiktigt in i bukhålan. Fattiga injektioner, som de subkutant från olycka, kommer att resultera i att förlora eller svällning EdU/BrdU lösningen och förhindra att det kommer in i cirkulationen.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Vasiliki Chantzara för att utföra tidsstyrd parningar och personalen i de biologiska resursenhet på den UCL Institute of Ophthalmology för mus djurhållning. Denna studie stöddes av en Wellcome Trust Investigator Award 095623/Z/11/Z till CR.
Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
Mowiol | Millipore | 475904 | |
OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
Thermometer | VWR | 620-0858 | |
Cover glass | VWR | 631-0137 | |
Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |