Summary
Intracavernosal 压力记录 (ICP) 是评价实验动物勃起功能的重要方法。在这里, 通过置管下肢的小弟弟, 然后电刺激大鼠的海绵神经, 证明了比较 ICP 的记录过程的详细协议。
Abstract
勃起功能障碍 (ED) 被定义为不能达到或保持勃起的小弟弟, 这已经成为一个普遍的男性性障碍。啮齿类动物被许多研究用来研究勃起功能的生理学/病理学。通过测量 intracavernosal 压力 (ICP) 可以评价啮齿动物的勃起功能。在实际应用中, 可以通过电刺激海绵神经 (CNs) 来监测 ICP。应用颈动脉压 (平均动脉压) 作为 ICP 的参考。利用 icp 记录协议, 可以从 icp 反应曲线测量勃起功能的许多关键参数。ICP 测量比阿扑吗啡诱导的勃起试验提供更多的信息, 而且比海绵的人的小弟弟的遥测监测更便宜, 这使得这种方法最受欢迎的一个评价阳痿的功能。然而, 与易于执行的蛋白能诱导勃起功能测试相比, 成功的 ICP 记录需要注意细节, 实践和坚持的操作方法。在这项工作中, 介绍了在大鼠的 ICP 记录, 以有效补充程序。
Introduction
ED 被定义为无法达到或保持勃起, 并已成为常见的男性性障碍1。实验动物被使用并且提供可再生的模型调查勃起功能2。长期以来, 一些较大的动物模型被用于调查勃起功能3,4,5。虽然啮齿动物比其他动物相对较小, 但它们也被用来研究男性勃起功能障碍, 因为它表现出了几个优点6。首先, 人类的形态和功能性特征在啮齿类动物中概括。第二, 与 ED 研究中使用的大型动物相比, 啮齿动物更经济的购买, 房子和维护。第三, 转基因啮齿动物模型在重现性和后续行为以及神经研究中提供了优势。因此, 啮齿类动物很快就成为了研究男性勃起功能障碍的主要方法。
啮齿动物模型得益于纯遗传背景和一致的文化条件, 提供了一致的可重现数据5,6,7,8。在许多与勃起功能相关的研究中, 阿扑吗啡的勃起反应试验和电刺激诱发的 ICP 反应试验是最广泛使用的方法, 可以可靠地反映勃起函数9,10,11,12。由希顿et 等开发的蛋白诱导的勃起功能测试。13是一种生物检测方法, 它利用阿扑吗啡对大鼠进行勃起和打呵欠的现象。作为一种简便、无创、稳定的生物检测方法, 对勃起功能进行评价, 在许多研究中广泛应用了该蛋白诱导的勃起功能检测。然而, 这项化验并不能充分反映勃起的质量或血液流量的动态变化, 与阳痿的反应14。ICP 测量最初是由昆兰et 等人开发的。15. 在该方法中, 将导管放入颈动脉以测量全身血压, 另一导管插入小腿语料库海绵以记录 ICP。在 ICP 记录之前或期间, 主要骨盆神经节 (加仑) 或 CN 的血管活性剂和/或电场刺激经常被给予老鼠14。这种检测方法是评估 ED 治疗和药物的可靠工具, 在未来的6中很有可能被用作重要的评估手段。
与易于执行的蛋白能诱发的勃起功能测试相比, 成功的 ICP 记录需要注意细节、练习和坚持操作方法。因此, 在这里, 我们提供了如何执行 ICP 记录的详细说明。
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Protocol
本研究采用三月大、18月大的大鼠。所有动物都是按照 NIH 的护理和使用实验动物的指导方针处理的。涉及动物问题的程序得到当地机构动物照料和道德委员会的批准, 努力尽量减少动物的痛苦。这些议定书是由南京理工大学 (中国南京) 机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 批准的。
在 ICP 记录前, 根据其年龄和早期表现, 将大鼠分为两组: 青年正常组 (YN 组) 和老年勃起功能障碍组 (AE 组)10。
1. 手术前准备
- 手动为 ICP 记录制作一对双极性电极 (图 1)。稍微弯曲电极的两端, 并将两个电极之间的距离调整为1-2 毫米宽, 如图 1A所示。
- 使用两个鳄鱼钳 (图 1A, B) 将电极连接到刺激器。
- 装配导管系统:首先, 将皮下注射的23G 针连接到带有油管的3路旋塞阀, 然后将旋塞阀连接到压力传感器。接下来, 在旋塞阀的第三端附上一个10毫升的注射器, 以提供肝素生理盐水。
- 在用肝素盐 (200 U/毫升) 填充整个系统后, 仔细检查是否有渗漏。然后将3路旋塞阀关闭注射器通道或压力传感器通道(图 1C)。
- 提起针20厘米的木垫水平。然后将压力记录系统校准到20厘米 H2O。之后, 移动针的高度, 以验证记录系统的准确性。重复校准, 直到确认准确性。
- 将老鼠从动物设施转移到手术室, 让他们习惯于手术室至少30分钟。
- 在手术前用70% 乙醇喷洒蒸压设备
2. 手术程序
- 麻醉大鼠腹腔注射戊巴比妥钠, 剂量为45毫克/千克体重, 并等待5-10 分钟. 捏脚趾以确认适当的麻醉。
- 用电动剃须刀剃去腹部和颈部的皮毛, 然后把老鼠放在暖气垫上。
- 用10% 聚维酮碘溶液浸泡棉球, 然后用70% 只乙醇浸泡棉球擦拭手术区。同时, 应用眼科软膏防止眼部干燥。
- Catheterize 左颈动脉。
- 用镊子抓住颈部的皮肤, 在颈部中部做水平切口。切开肌肉, 仔细暴露左颈动脉, 并隔离血管的5毫米部分。
- 用镊子仔细地将颈动脉与迷走神经分开, 在颈动脉下画一条丝缝线, 并在血管的尾端放一条松散的领带, 然后在血管的颅骨末端再做一个紧的结。
- Caudally 钳夹在缝合线上方的牛头犬钳, 以阻止血液流动。
- 用显微外科剪刀在血管上做切口, 在微解剖钩和镊子的协助下, 将动脉导管插入心脏。
- 把松动的尾鳍绑在导管上以确保它的安全。取出牛头犬钳以恢复血液流动。
-
隔离 CN 并放置电极
- 用钳子抬起腹部的皮肤和肌肉。用解剖剪刀, 切开下腹部到小弟弟做中线切开。
- 用拭子轻轻地将肠道推入腹腔上部。
- 用一副镊子抓住膀胱, 从腹腔取出膀胱。暴露前列腺的腹叶, 位于尿道的腹部。
- 拔出前列腺、精囊和输精管的腹叶, 露出前列腺的背叶。找出输精管和前列腺的粘连点。
- 分离前列腺和输精管之间的空间。仔细暴露的纤维胶囊, 这是位于后到连接点的前列腺和输精管。然后找到主要的骨盆神经节 (图 2)。
注: 在前列腺表面可以看到主要的盆腔神经节和海绵状神经。 - 小心干燥 CN 区域与无菌拭子。用两极电极仔细隔离并钩住右海绵状神经。
-
Catheterize 左下肢
- 用解剖剪刀在小弟弟的皮肤上切开一个小切口, 然后仔细掀的小弟弟的皮肤。
- 解剖纹状的小弟弟肌组织。找到耻骨骨的上部分支。
- 暴露 bulbospongiosus 的肌肉, 包括 spongious 灯泡。
- 用弯钳将 bulbospongiosus 肌从 ischiocavernosus 肌中分离出来。
- 小心地将 ischiocavernosus 肌肉与弯曲钳隔离, 然后切开 ischiocavernosus 肌以暴露小腿海绵的白色膜。
- 遵循小腿语料库海绵的解剖方向, 小心地将针插入小腿语料库海绵通过白色的膜。
注意: 这是成功导尿的关键步骤。如果针插入正确, 少量的血气盐水可以被注射, 并且应该观察轻微的小弟弟膨胀。 - 小心释放针头, 避免任何滑动的针头或中断连接管。检查是否有渗漏。
3. 刺激 CN
- 打开压力信号记录软件程序, 启动压力信号记录。
- 设置刺激的参数:15 赫兹, 脉冲宽度为5毫秒, 5 伏, 和六十年代的持续时间。以15赫兹的频率刺激 CN, 脉冲宽度为5毫秒。
注: 在应用电刺激时, 可观察到 ICP 的急剧上升。 - 让刺激之间有30分钟的休息时间。每只动物的连续刺激的最大值是三倍。
4. 结束程序
- 记录后, 通过注射过量的戊巴比妥钠剂量150毫克/千克体重来管理安乐死。通过检查动脉压力来证实老鼠的死亡。取出老鼠, 清理手术工具。
5. 数据分析
- 保存并导出软件中的数据。反应通常表示为 ICP 与全身平均动脉压的比值 (图)。计算了峰值比值/MAP 对勃起功能的评价。
- 从至少五只老鼠那里采集数据, 并用统计软件进行分析。当p < 0.05 使用学生的 t 测试时, 差异被认为具有统计学意义。
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Representative Results
许多研究表明, 老年男性勃起功能障碍正成为一个普遍的问题。然而, 在管理衰老相关的教育16方面, 医疗治疗受到限制。在衰老相关的啮齿动物模型中, 对老龄大鼠的勃起功能进行了多种治疗。正如我们前面所介绍的那样, ICP 记录试验可用于将 ED 动物与实验动物的总人口区分开来, 这对于量化潜在治疗或药物对勃起功能的影响也很有价值。
如图 3A所示, ed 组典型的 ICP 反应曲线 (年龄为18月的大鼠 AE) 远低于对照组的曲线 (幼鼠、YN、3月龄)。通常, 最高的 ICP 选择的统计分析。在计算了 icp/图的比值后, 5 大鼠的聚集数据表明 AE 组的 ICP/map 比与对照组相比显著降低 (图 3B)。在老年 ED 大鼠中, 除这两个关键参数外, 峰值 icp、高原 icp、消肿时间、反应持续时间和曲线面积均显著降低 (表 1)。这些记录数据提供了一种反映勃起功能的定量测量方法。
图 1: 手动制作的导管、双极电极和用于 ICP 记录的刺激器和信号记录系统.导管和电极都连接到刺激器和信号记录系统设备。导管末端插入左动脉或小腿语料库海绵记录压力。电极放置在海绵状神经下 (CNs)。(A) 电极的两端略有弯曲。(B) 的刺激器和信号记录系统设备。(C) 手动组装导管。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 主要骨盆神经节和海绵状神经的解剖位置.如图所示, 主要骨盆神经节位于前列腺的侧缘。大鼠海绵状神经是一种明显的神经, 它从主要的骨盆神经节延伸出来。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 不同年龄大鼠的代表性 ICP 记录.(A) 在海绵状神经刺激过程中的 ICP 改变表示。对照组 (幼正常大鼠, YN, 3 月大鼠);ed 组 (老年 ed 大鼠, AE, 18 月大)。在 ICP 反应曲线下的杆表示电刺激的时间。(B) 显示不同实验组的勃起功能指数 (海绵压力/平均动脉压力)。至少五只大鼠的数据显示为平均±standard 偏差;当 *p < 0.05 使用学生的 t 测试时, 差异被认为具有统计学意义。请单击此处查看此图的较大版本.
| 年轻正常 (YN) | 老年勃起功能障碍 (AE) | |
| (Mean±SD) | (Mean±SD) | |
| 基 ICP 备 | 22.3±3.7 (mmHg) | 21.9±5.2 (mmHg) |
| 峰值 ICP 备 | 172.8±7.6 (mmHg) | 105.4±4.9 (mmHg) * |
| 高原 ICP 备 | 165.4±2.5 (mmHg) | 86.5±4.1 (mmHg) ** |
| 勃起延迟 | 10.3±1.6 (s) | 15.1±2.3 (s) |
| 消肿时间 | 46.7±2.6 (s) | 11.8±3.3 (s) * |
| 响应持续时间 | 107.2±3.7 (s) | 71.7±4.2 (s) * |
| 曲线下的区域 | 17436.9±736。4 | 6426±428.3 ** |
| 勃起数量 | 3±0。0 | 3±0。0 |
表 1: 年轻和老年勃起功能障碍大鼠勃起功能参数.计算并表达了基底海绵压力 (icp)、峰值 icp、高原 icp、延迟架设、消肿时间、响应时间、ICP 时间响应曲线下的面积以及30分钟内观察到的勃起数量±standard偏差 (n=5)。当 *p < 0.05 或 **p < 0.01 使用学生的 t 测试时, 差异被认为具有统计学意义。
| 故障排除症状 | 可能的原因和建议 |
| 无压力的 ICP 或地图 | 设备问题: 检查设备状态 |
| 泄漏问题: 检查管, 确保连接完好, 然后检查旋塞阀, 是否在适当的位置 | |
| 电刺激后低压升高 | 不充分或没有刺激: 检查电极的连接从刺激器到 CN, 尝试重新定位电极 |
| 对 cn 的伤害: 尝试刺激对侧 cn | |
| 渗漏: 检查 icp 导管插入部位, 因插入部位渗漏会降低 icp | |
| 出血 | 检查出血部位;如果动脉穿孔, 结束实验。如果育种发生在 ICP 插入部位, 重新穿刺是非常棘手的, 也许是不可能的。 |
表 2: 有关 ICP 记录过程的疑难解答.三常见症状的 ICP 手术, 可能的原因, 和建议。
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Discussion
作为勃起功能的直接措施, ICP 是一种可靠的方法14。它允许获得关于基 icp 备、峰值比较、高原 icp、安装时间和消肿时间、响应时间、等的数据。除这些直接测量参数外, 还有一些其它指标参数: (1) "T80", 达到80% 峰值的时间;(2) "D20", 时间减少到20% 峰值 ICP;(3) "ΔT80", T80 压力增加率 (每秒);(4) "ΔD20", 在 D20 的压力降低率 (每秒)。这些参数允许量化每个阶段和 ICP 反应的质量, 这可以反映疾病的影响和检查药物的功效14,17。这种 ICP 记录方法广泛应用于 ED 动物模型中。在本议定书中, 我们比较了青年和老年 ED 大鼠的 ICP 反应。如果需要用药通过海绵导管, 则可以通过将另一海绵导管放置到对侧小腿语料库海绵17来完成。注射总容积应少于0.1 毫升。系统的药物管理可以通过腹腔或皮下注射进行。如果需要静脉用药, 可以考虑右颈静脉。
虽然 ICP 手术在技术上有点挑战性, 需要深入了解下腹部和盆腔器官解剖, 有时间和精力, 你可以掌握的协议。由于导管和电极是由实验者手工制作的, 所以在开始实验之前, 需要检查和校准压力传感器。电极应薄, 两个电极之间的距离应该足够小, 以有效地刺激神经。在放置电极时, 避免神经的拉伸或其他损伤是很重要的。准确地将针插入左下肢是非常关键的, 没有任何滑动或脱落。三常见症状列在表 2中, 可以在出现某些症状时考虑。
这种 ICP 记录方法也转让小鼠。然而, 小鼠的身体比老鼠小, 使得 ICP 在小鼠中的记录更加困难。如果在小鼠中进行了 ICP 记录, 可以使用较小大小的皮下注射针。
ICP 记录也有其局限性, 可以考虑其他方法。通常, 对麻醉动物进行 icp 记录手术, 在短期 icp 测量后牺牲动物, 不适合对 icp 进行纵向监测。直接 icp 记录方法的一个显著改进是在有意识的、自由移动的大鼠上执行 icp 记录, 这在赫德伦德et al编写的协议中有很好的描述。17此方法提供了一个记录 intracavernosal 压力较长时间段的机会。最近, 已经取得了进展, 包括在有意识的, 自由移动的动物中应用的遥测方法18,19,20。虽然遥测方法比传统的 ICP 记录有许多优点, 但它需要昂贵的设备来转换和接收转换后的压力信号。为克服导尿方法, 安达et描述一种通过连续测量大鼠的小弟弟直径21来检查勃起反应的方法。在这种方法中, 一对压电晶体被放置在海绵的本体的轴上。两个参数的定义, 以评估勃起反应: (1) "d-最大": 最大发展的小弟弟直径在测量期间;(2) "T50%": 从最大反应到50% 恢复麻醉大鼠最大反应的时间。通过该协议, 鸡的直径变化也忠实地反映了勃起反应的质量;此外, 在整个测量过程中, 组织没有受伤。然而, 就像遥测方法一样, 这种 sonomicrometry 方法还需要特定的和相对昂贵的设备来转换和接收小弟弟的直径变化。
总之, ICP 记录是一种准确、相对方便、成本低廉的方法。我们相信这一介绍有助于扩大 ICP 方法的应用, 进一步提高对勃起功能障碍的病理学和生理学的认识。
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Disclosures
作者没有什么可透露的
Acknowledgments
这项工作得到了中央大学基础研究基金 (020814380018, 020814380077), 中国奖学金理事会 (CSC, 201606195024 号), 江苏省自然科学基金 (BK20160138) 和重点项目的支持。由南京医科大学科技发展基金会 (2014NJMUZD053) 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| Rats | Strain: Sprague-Dawley Age: 2-3 month | ||
| Rats | Strain: Sprague-Dawley Age: 15-18 month | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Saline | Sigma-Aldrich, S7653 | dissolve 8.5 gram sodium chloride in distilled water | |
| Pentobarbital sodium solution | Sigma-Aldrich, P3761 | dissolve 1 gram in 100 ml saline | |
| Povidone-iodine | BTP Pharmaceutical Co. Limited | 10% (V/V) | |
| Ethanol | China National Pharmaceutical Group Corporation (SINOPHARM) | 70% (V/V) | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, H3149 | dissolve 20000U heparin in 100 ml saline | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Hypodermic needle | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | 23G | |
| Syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 10 ml | |
| Three-way stopcock | Chengdu Instrument factory | TSK 01 | |
| Electrode | Chengdu Instrument factory | JST-1 | |
| Catheter tube | Chengdu Instrument factory | PE-10, PE-50 | |
| Operating scissors | Shanghai operation equipment factory | J22010, J22020 | |
| Ophthalmic operating scissors | Shanghai operation equipment factory | Y00010, Y00020 | |
| Ophthalmic forceps | Shanghai operation equipment factory | JD1010, JD1020 | |
| MicroScissors | World Precision Instruments | WAA260 | |
| silk suture | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | 5-0 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stimulator | Nanjing medease science and technology co. ltd (model 4C501H) | 15 Hz, 5 ms pulse, 5 V, 60 s duration and 5 minutes interval | |
| Multichannel signal collection processing system | Nanjing medease science and technology co. ltd (model 4C501H) | Blood pressure model | |
| Pressure transducer | Beijing Xin Hang Xing Ye Technology Trading Company Limited (model YP100) | 40KPa |
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