Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

تطوير التحليل في المختبر كوانتيتاتي الجذعية المكونة للدم والسلف الخلايا (هسبكس) في تطوير الأجنة الزرد

doi: 10.3791/56836 Published: November 30, 2017

Summary

نقدم هنا، طريقة بسيطة كوانتيتاتي المكونة للدم الخلايا الجذعية والسلف (هسبكس) في الزرد الجنينية. يتم مطلي هسبكس من الزرد منفصلان في ميثيلسيلولوسي مع عوامل داعمة، التفريق في الدم الناضجة. يسمح هذا الكشف عن الدم العيوب ويسمح للمخدرات الفرز ستجري بسهولة.

Abstract

هيماتوبويسيس هو عملية خلوية أساسية التي تفرق الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم (هسبكس) في العديد الأنساب الخلية المختلفة التي تتألف منها الدم الناضجة. يصعب عزل وتحديد هذه هسبكس لأنها محددة الأمر الواقع اللاحق؛ لا يمكن تحديد بعد على التمايز في الأنساب الخلية المحددة. على مدى العقود القليلة الماضية، أصبحت الزرد (دانيو rerio) كائن نموذج لدراسة هيماتوبويسيس. الأجنة الزرد وضع خارج الرحم، وخلال 48 ساعة بعد الإخصاب (hpf) قد ولدت نهائي هسبكس. فحوصات لتقييم التمايز هسبك وطورت قدرات انتشار استخدام زرع واللاحقة إعادة تشكيل النظام المكونة للدم بالإضافة إلى تصور خطوط المعدلة وراثيا المتخصصة مع الفحص المجهري [كنفوكل]. بيد أن هذه الاختبارات تكلفة باهظة وصعبة من الناحية الفنية، وتستغرق وقتاً طويلاً للعديد من المختبرات. وضع نموذج لتقييم هسبكس في المختبر ستكون فعالة من حيث التكلفة، وأسرع، وصعوبات أقل مقارنة بالسابق ووصف الأساليب، السماح لمختبرات تقييم شاشات الطفرات والعقاقير التي تؤثر على بيولوجيا هسبك بسرعة. هذه الرواية في المختبر فحص لتقييم هسبكس يؤديها تصفيح فصل الزرد كله الأجنة وإضافة عوامل خارجية تعزز فقط هسبك التفريق والانتشار. فصل في الخلايا المفردة ومطلي مع عوامل تحفيز مستعمرة هسبك الداعمة التي تسبب لهم لإنشاء مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) التي تنشأ من خلية واحدة السلف الأجنة. ينبغي أن تسمح هذه فحوصات دراسة متأنية أكثر من المسارات الجزيئية مسؤولة عن انتشار هسبك، والتمايز، والتنظيم، التي سوف تسمح للباحثين لفهم أسس هيماتوبويسيس الفقاريات والتقلبات أثناء المرض.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هيماتوبويسيس هو عملية صنع العديد خلايا الدم الناضجة اللازمة لبقاء الكائن الحي. أنها عملية إنمائية رئيسية ينطوي على التفريق بين الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا تنمويا المقيدة التي تتألف منها الدم الناضجة. يجب تجديد هذه هسكس ذاتيا حيث أن النظام لم تستنفد، وأنها يجب أن تستمر من التنمية الجنينية المبكرة حتى الموت. في الفقاريات، هناك حاجة إلى تغذية كافية غالبية خلايا الدم التي يتم بعدها الانقسامية التمايز المستمر وانتشار الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم (هسبكس) ويجري إعادة تدويرها كل يوم. هسكس توليد خلايا الدم الناضجة بالتفريق الأولى إلى مجموعات فرعية خلايا السلف مقيد؛ المشتركة المتكفل اللمفاوية (المعنية)1، والذي في نهاية المطاف إنتاج خلايا تي وب ناغورني-كاراباخ، و المتكفل النقوي (CMPs) المشتركة2 التي تولد المحببة والكريات الحمراء والضامة وميجاكاريوسيتيس. هذه المتكفل ملتزمون بتوليد الأنساب خلية معينة، وكذلك تفرق في المزيد من الخلايا السلف تنمويا المقيدة مثل المتكفل محمر النقوي (MEPs) التي تولد الكريات الحمراء والصفائح الدموية، أو المحببات بلعم موروث (غمبس) التي تولد الحمضات والعدلات، الاسسه والضامة2. تحديد وعزل هذه المتكفل تتيح تحديد المسارات الجزيئية الهامة المشاركة في تمايز المكونة للدم والعديد من الأمراض المكونة للدم مثل اللوكيميا تنشأ عندما تعجز هذه الخلايا السلف بشكل صحيح التفريق.

على مدى العقود القليلة الماضية، أصبح النظام النموذجي الزرد (دانيو rerio) أداة بحث رئيسية للدراسات المكونة للدم الجنينية والكبار. الزرد قابلة للتحليل الجيني والأنواع النموذجية الفقاريات فيلوجينيتيكالي أدنى المفرج مماثلة ونظام المكونة للدم للبشر. تطوير الزرد الأجنة خارج الرحم، وخلال 48 ساعة بعد إنشاء التسميد (hpf) هسبكس3،4،،من56،،من78. الزرد أيضا مثمر جداً، مع الإناث زرع على البيض 100 في مخلب واحد، مما يسمح للعينات ذات الأحجام الكبيرة والنسخ المتماثل التجريبية. الأجنة الزرد شفافة بصريا، مما يسمح لرؤية مجهرية للنظام المكونة للدم. عدة خطوط المعدلة وراثيا الفلورسنت الزرد وسم هسكس مثل runx1: اجفب الأسماك9، cd41: اجفب الأسماك10، و كدرل:مشري؛ كميب: بروتينات فلورية خضراء3 إيجابية مزدوجة الحيوانات، والسماح للتصور في الوقت الحقيقي، والعيش من HSC نشوء وتوسع في فيفو3،4،،من78، 9. الزرد توليد سريعة الوقت والتنمية خارج الرحم أدى إلى استخدامه في الطفرات الدراسات11،،من1213،،من1415 والمخدرات فحص16،17،،من1819،20 للمركبات التي تبشر العلاجية لاضطرابات الدم البشري. عموما، جعلت الحفاظ على المنظومة المكونة للدم، ووجود وسهل تطوير خطوط المحورة وراثيا، ووقت التجديد السريع الزرد نموذجا غير مكلفة وسريعة ومرنة ومثالية للدراسات المكونة للدم.

وقد وضعت أساليب عديدة لعزل واختبار هسكس في الثدييات الأنظمة المكونة للدم. يمكن استخدام المحققين مزيجاً من مستقبلات الخلية السطحية وضع علامة هسكس21،22،،من2324، فضلا عن استغلال قدرة هسكس efflux صبغ25،26. بعد أنها وصفت، يسمح fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) الانفصال الجسدي. تثبت أن خلية هي HSC يتطلب الإشعاعية حيوان مضيف لتدمير هسبكس الذاتية، زرع هسكس المفترضة، ومراقبة إعادة تشكيل طويلة الأجل، ونسب متعددة جميع أنواع خلايا الدم الناضجة. هذه فحوصات تعمل جيدا في الفئران، كما أن هناك العديد من الأجسام المضادة سطح الخلية ضد الخلايا المكونة للدم وسلالات الماوس الفطرية التي تيسر مطابقة المناعي للزرع. ومع ذلك، قد القليلة الزرد سطح الخلية المكونة للدم أجسام ولدت27، التي تعوق تحديد وعزل هسكس. الطريقة الأكثر شيوعاً للاحتفال وعزل هسكس الزرد مع الحيوانات المحورة وراثيا، حيث يقود تسلسل منظم خلية محددة التعبير بروتين فلوري في. وقد تصور الدراسات وتعداد هسكس في الجدار البطني للشريان الاورطي الظهرية مع الفحص المجهري استخدام هذا الأسلوب3،4،،من89. مختبرات أخرى قد ولدت ضغوطا الاستنساخ الزرد28،29 وإجراء عمليات الزرع الناجحة في الحيوانات مطابقة MHC30. ومع ذلك، هذه التقنيات هي التكلفة الباهظة للعديد من المختبرات ويصعب من الناحية الفنية، وهي مضيعة للوقت. لمعالجة هذه القضايا، قد ولدت مختبرات عدة فحوصات في المختبر لاختبار الوجود ومعدلات انتشار وقدرة التمايز، هسبكس31،،من3233 35،،من 3436. إظهار هذه فحوصات الانتشار والتفريق بين هسبكس في المختبر31،32،،من3334،35،36، إنقاذ 36من عيوب المكونة للدم، ووسيلة فعالة لاكتشاف واختبار السيتوكينات33،،من3435. وقد استخدمت أيضا لتحديد الجينات المسؤولة عن هسبك البيولوجيا31،32. في هذه الدراسة، نأخذ هذه الاختبارات خطوة أخرى، مما يتيح كوانتيتيشن هسبكس في جنينا الزرد نامية. كما يمكن أن تستخدم هذه الاختبارات قوانتيتاتي عدد هسبكس في الحيوانات المسخ والحيوانات تعامل مع الأدوية المكونة للدم التخريبية. في جوهرها، هذه فحوصات سريعة، وهذا من التحديات التقنية القليلة، وهي طرق غير مكلفة كوانتيتاتي أرقام هسبك ودراسة انتشارها، والتحقيق في كتل في التفريق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وافق المجلس الاستشاري "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ولاية كاليفورنيا، شيكو، جميع الأساليب المذكورة أدناه.

1-التبييض 48 هبف الزرد الأجنة

  1. مع 15 سم x 15 (w) سم (l) × 7 سم (ح) حاويات بلاستيكية إنشاء 3 محطات للمياه والصرف الصحي: 1) مع 1 مل التبييض 5 ٪ في المتوسط الجنين 1000 مل (E3) (انظر الجدول 1) 2) E3 العقيمة، ومع 3) مع E3 العقيمة. التأكد من 500 مل من محلول إلى غمر الأجنة في كل حاوية.
    ملاحظة: لكل حالة اختبار، سيلزم على الأقل 10 أجنة. ويتسع هذا الإجراء الغسيل الأجنة يصل إلى 200.
  2. مع ماصة نقل، وضع الأجنة في مصفاة الشاي وغمر البيض في محطة الغسيل #1 5 الحد الأدنى إزالة مصفاة الشاي (مع الأجنة داخل) ووضع في محطة الغسيل #2 لمدة 5 دقائق؛ كرر محطة الغسيل #3 لدقيقة 5 نهائي.
  3. بعد الغسيل الأخير، قبالة شطف الأجنة من مصفاة الشاي بتحويلها رأسا على مدى 10 سم نظيفة طبق بيتري والشطف بلطف الأجنة مصفاة الشاي مع E3 العقيمة وماصة نقل.

2-ديتشوريوناتي الأجنة

  1. مع ماصة نقل، إزالة وتجاهل E3 قدر ممكن من طبق بيتري وإضافة 500 ميكروليتر من البروتياز ديتشوريونيشن (10 مغ/مل) للأجنة. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 اضغط بلطف إلى جانب طبق بيتري لإزالة تشوريونس.
  2. مع ماصة مصلية، إضافة 20 مل E3 العقيمة تمييع حوزتي. السماح للأجنة لتسوية، وإزالة E3 مع ماصة نقل. كرر هذه الخطوة يغسل 3 مرات لإزالة جميع آثار حوزتي ديتشوريونيشن.

3-إعداد عينات الأجنة

  1. استخدام ماصة P1000، ضع 10 أجنة في أنبوب ميكروسينتريفوجي واحد معقم 1.5 مل.
  2. إزالة E3 مع ماصة، وتجاهل.
    تنبيه: "الماصة؛" بعناية كما يمكن بسهولة المشردين الأجنة وتجاهل أثناء الغسيل الخطوات التالية.

4-إعداد أجنة للانفصال

  1. نقل العينات إلى هود الاندفاق الصفحي، وتغسل الأجنة بإضافة 1 مل E3 العقيمة. السماح للأجنة لتسوية إلى أسفل الأنبوب وإزالة المادة طافية مع ماصة P1000. كرر هذه العملية لما مجموعة 3 يغسل.
  2. بعد غسل آخر، إزالة E3 وتجاهل. أضف 1 مل من 10 مم ديثيوثريتول (DTT) في E3 لإزالة الطلاء المخاط (وأي جراثيم أو خميرة أو البكتيريا التي قد حوصروا في ذلك) المحيطة الزرد الجنينية. وضع أنبوب ميكروسينتريفوجي أفقياً، واحتضان في درجة حرارة الغرفة في هود الاندفاق الصفحي لمدة 25 دقيقة.

5-الأجنة الانفصال

  1. تغسل العينة 3 مرات مع 1 مل دببس العقيمة (مع Ca2 + و Mg2 +). بعد غسل الماضي إضافة 500 ميكروليتر من دببس (مع Ca2 + و Mg2 +) وإضافة 5 ميكروليتر من مبطلات الانفصال 5 ملغ/مل (26 U/mL).
    تنبيه: هذا الإنزيم يحتاج Ca2 + و Mg2 +، حتى تضمن أن دببس تحتوي على هذه الأيونات.
  2. احتضان عينات في 37 درجة مئوية في شاكر مداري أفقي 180 لفة في الدقيقة للعينات مكان 60 دقيقة في هود الاندفاق الصفحي وتريتوراتي الأجنة مع P1000 حتى يتم فصل العينات تماما.
    تنبيه: فحص الأجنة بشكل دوري لتحديد متى تصبح نات بأنهم. يجب أن يكون الحل الجنين كمية من الأنسجة الحالية؛ يجب أن لا متجانسة تماما. فمن الممكن لهضم المفرط، الذي سوف يدمر هسبكس (انظر تكميلية الشكل 1).

6-إعداد أجنة ينتابها

  1. ماصة 10 فصل الأجنة إلى الخزان العلوي البوليسترين 5 مل الجولة أنبوب أسفل مع قبعة مصفاة خلية ميكرومترات 35.
  2. مع ماصة، تصفية شطف الأنبوب بيتري مع PBS العقيمة (مع لا Ca2 + أو Mg2 +) ونقل الحل إلى 5 مل البوليستيرين أنبوب يحتوي على خلايا من الخطوة 6، 1. كرر حتى 4 مل سائل موجود في أنبوب البوليستيرين 5 مل.
    ملاحظة: برنامج تلفزيوني أو دببس، أو حلول أخرى مخزنة متساوي التوتر قد تستعمل في هذه المرحلة، طالما أنها لا تحتوي على Ca2 + أو Mg2 +
  3. الطرد المركزي أنابيب في 4 درجة مئوية و 300 غرام x لمدة 5 دقائق بيليه العينة خلية المتجانس. مع ماصة، إزالة وتجاهل المادة طافية من أنبوب أسفل جولة. الحرص على عدم تعطيل الخلايا القريبون في الجزء السفلي من الأنبوب. ريسوسبيند الخلايا في 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني.

7-إعداد ميثيلسيلولوسي

  1. توليد 1 × الحل الأسهم methylcellulose كاملة (الجدول 1) وإضافة 2.5 مل لأنابيب معقمة أسفل الجولة 14 مل مع 3 مل المحاقن والإبر ز 16. استخدام أنبوب واحد لكل حالة اختبار.
  2. إضافة السيتوكينات، والجزيئات الصغيرة، أو وكلاء آخرين التحقيق لكل عينة.
    1. التفريق النقوي، إضافة 1% كارب 0.3 ملغ/مل والمصل الزرد المؤتلف المحببات مستعمرة حفز عامل (Gcsf)34 إلى متوسط ميثيلسيلولوسي. انظر سفوبودا et al. 37 لوصف كامل على كيفية توليد سمك الشبوط السيتوكينات المصل والمؤتلف.
    2. التفريق محمر، إضافة 1% كارب المصل و 0.1 مغ/مل الزرد المؤتلف الاريثروبويتين (Epo)38 إلى المتوسطة methylcellulose.
    3. بحث موروث مولتيلينيجي، أضف البراءات وجكسف.
      تنبيه: السيتوكينات، والمضافات، ينبغي أن لا مجموع أكثر من 10% الحجم الإجمالي، المتوسط يكون لزج ما يكفي تمييز المستعمرات الفردية.

8-إضافة للأجنة منفصلان إلى ميثيلسيلولوسي

  1. استخدام ماصة، إضافة 100 ميكروليتر من الأجنة 10 منفصلان لسطح ميثيلسيلولوسي المعدة مع المصل السيتوكينات وسمك الشبوط المؤتلف. غطاء كاب ودوامه بلطف مجانسة عينة تماما. ينبغي أن تتضمن كل أنبوبة الآن ينتابها أنسجة الأجنة 10.
  2. استخدام 3 مل المحاقن والإبر ز 16، الكوة 1 مل من العينة في أطباق بتري منفصلة 35 مم 2. تأكد من أن العينة هي موزعة تماما طبق بيتري. كرر لكل عينة.
  3. ضع أطباق بتري 35 ملم مع الخلايا في ميثيلسيلولوسي إلى 15 سم طبق بيتري. لكل طبق 15 سم، إضافة لوح بيتري 35 ملم واحد مع 5 مل الماء المعقم يرطب العينات. احتضان أول أكسيد الكربون 32 درجة مئوية و 5%2 لمدة 7-10 أيام.

9-تصور مستعمرة هسبك-مشتقة تشكيل وحدات (كفوس)

  1. بعد حضانة 7 أيام، وضع عينات إلى مجهر مقلوب في 40-100 X للتصور والتعداد. عند هذه النقطة، يمكن عزلة مع ماصة مستعمرات فردية وتخضع للتحليل تلطيخ و/أو الجينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تقييم الأرقام هسبك في الزرد الجنينية، يهضم 48 هبف الأجنة، مطلي في ميثيلسيلولوسي مع عوامل النمو المكونة للدم داعمة خارجية، والمحتضنة لمدة 7 أيام (الشكل 1أ). بعد 7 أيام، كانت مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) المذكورة (الشكل 1ب) والمصورة (الشكل 1ج). عن طريق التحكم في السيتوكينات المختلفة وأضاف، واحدة يمكن التحكم في أنواع المستعمرات المنتجة: مكتب البراءات الأوروبي ضروري للتمايز محمر و Gcsf من الضروري التفريق النقوي. مصل الكارب يماثل استخدام مصل بقرى الجنين في زراعة أنسجة الثدييات؛ مصدر لعوامل النمو العام. في الشكل 1، أضيفت البراءات، وجكسف، والمصل الكارب، السماح بتعداد محمر، المستعمرات اريثرومييلويد النقوي، والمختلطة. ويمكن تمييز هذه المستعمرات نظراً للشكل واللون؛ المستعمرات محمر ضيق، والصغيرة، والتعاقد، واللون أحمر لسبب هيموجلوبينيزيشن. وهي أكبر المستعمرات النقوي المزيد من خلايا متحركة على الحواف، مما يعطيها مظهر تكدرت.

نجاح طلاء من الزرد الجنينية تعامل مع هسبك داعمة العوامل سوف تسفر عن كفوس بعد 7-10 أيام للحضانة. الأهم من ذلك، كمية كفوس يرتبط مباشرة بعدد الأجنة مطلي (الشكل 1ب). تصفيح الأجنة أما 4 أو 8 كل مل (الذي يرتبط بدءاً من الأجنة 10 أو 20 في بداية التجربة) ينتج حوالي كفوس 1,200 أو 2,400، على التوالي. لدينا البروتوكول تشير إلى استخدام الأجنة 10، كما أنها صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً لعد كفوس 2,400 عند إجراء تجربة أكبر. سبب منهجية هضم الأجنة كله، الحطام متنوعة موجودة في ميثيلسيلولوسي، ولكن يمكن بسهولة تمييز من المستعمرات الفعلية مع أعلى التكبير تحت المجهر. الحطام الخلوية الأخرى أيضا قد تكون موجودة، ولكن كفوس الوحيدة الحالية سوف تكون هسبك المستمدة من سبب إضافة السيتوكينات هسبك داعمة. إذا كفوس صغيرة ولا ينظر إليها بسهولة، يمكن المحتضنة الثقافات تصل إلى 10 أيام لتشجيع زيادة النمو. ومع ذلك، لن تؤتي زيادة الاحتضان كفوس أكثر؛ إذا لم تكن موجودة كفوس، هذا يشير إلى فقدان النشاط سيتوكين، خلال عملية هضم أجنة (وتدميرها فيما بعد هسبكس؛ انظر تكميلية الشكل 1)، أو الطلاء غير لائق للعينات. من المهم دائماً لتشغيل الضوابط الصحيحة في كل مرة يتم إجراء هذه التجربة التأكد من أن الاختلافات الطفيفة في أسلوب لا تسفر عن خلافات كاذبة في تعداد هسبك. على سبيل المثال، إذا كان يتم إجراء تجربة لتحليل عدد هسبكس الموجودة في الأجنة مورفانت، ينبغي إعداد عينة مع الأشقاء العادية جنبا إلى جنب مع. إذا كان يتم إجراء تجربة لمقارنة أثر المخدرات على تطوير هسبكس ينبغي إعداد وتحليل جنبا إلى جنب مع عينة مع الأشقاء غير المعالجة.

Figure 1
رقم 1: كفوس "هسبك تعداد" المستمدة من الأجنة الزرد هبف 48. (أ) التخطيطي نظرة عامة على الجنين والطلاء على ميثيلسيلولوسي مع السيتوكينات هسبك داعمة لجيل كفوس المكونة للدم. فصل الأجنة الزرد هبف 48 ومطلي على 1% methylcellulose كاملة مع الاريثروبويتين (Epo) والمحببات مستعمرة عامل حفز (جكسف)، ومصل الكارب، مما يسمح للتمييز اريثرومييلويد. (ب) بتعداد مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) من عينات مطلي بتركيزات 4 أو 8 أجنة كل مل (بدءاً التجربة مع الأجنة 10 أو 20، على التوالي). تم تعداد في 100 X في مجهر مقلوب. أشرطة تشير إلى متوسط عدد الأرقام من كفوس، وأشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. (ج) مستعمرة مورفولوجيا الممثل للجنين والطلاء على ميثيلسيلولوسي. مورفولوجيا المستعمرة يشير إلى أنواع الخلايا التي تتألف منها هذه المستعمرة؛ الصور هي الممثل محمر والمستعمرات النقوي. كفوس صورت في 400 X. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر.  الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplemental Figure 1
تكميلية الشكل 1: الهضم الأجنة بحوزتي الانفصال. (أ) الصور 10 أجنة قبل الهضم (اليسار؛ عسر الهضم)، بعد الهضم كافية (الأوسط؛ وهضمها)، وبعد الهضم الزائدة (ما يزيد على هضم الحق؛). (ب) زوميد في الصور (7.3 X) من أنابيب الهضم هضمها وأكثر في (أ). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد أصبح النظام النموذجي الزرد نموذجا كفؤة وفعالة وغير مكلفة لدراسة هيماتوبويسيس الفقاريات البدائية ونهائي. ويمكن استخدام جيل فحوصات سريعة وغير مكلفة، ويقدم بعض الصعوبات التقنية لاختبار الجزيئات الصغيرة وتحليل الأجنة متحولة، وتوضيح المسارات الجزيئية الهامة للبيولوجيا هسبك. في المختبر الطلاء من هسبكس من الزرد الكبار وسيلة فعالة لدراسة الطفرات، السيتوكينات، وعيوب المكونة للدم. هذا البروتوكول يستند إلى تلك الدراسات، ولكن يستخدم الزرد الجنينية. تطبيق هذه الاختبارات على الزرد الجنينية يسمح لجمع البيانات أسرع، واستخدام المساحة الفعلية أقل، استخدام المخدرات أقل (للشاشات المخدرات)، ويسمح باختبار مرناً overexpression و/أو morpholino (MO) ضربة قاضية لمسارات محددة الوراثية. الأهم من ذلك، فإنه يسمح أيضا دراسة مراحل هيماتوبويسيس التي تحدث فقط أثناء المبكرة الفقاريات.

بسبب مرونة هذا التحليل، يمكن تعديلها بسهولة لتلبية العديد من الاحتياجات المتنوعة. تعديل واحد من هذا البروتوكول هو تحوير توقيت الإنمائية؛ تعديل سن الأجنة المستخدمة يسمح كوانتيتيشن جيل هسبك على مر الزمن. وهذا يمكن أن تسمح أيضا دراسة فرعية متميزة من هسبكس مثل اريثرومييلويد فروعه6، التي تنشأ قبل 36 هبف، مقابل حسن النية هسكس3،4،،من58، التي تنشأ بعد ذلك. لا أحد كان قادراً على عزل وتحديد المجموعات هسبك الزرد أكثر تقييداً في الجنين النامي حتى الآن، ولكن هذه الاختبارات تسمح هذه التجارب. ومن الضروري أن عند تغيير المراحل التنموية للحيوانات، كمية الخلايا إضافة إلى ميثيلسيلولوسي هو أيضا الأمثل؛ عدد قليل جداً من الحيوانات سوف تسفر عن لا مستعمرات، بينما جداً كثير سيخلق صفيحة لا يحصى من المستعمرات هسبك. إضافة السيتوكينات المختلفة هو تعديل آخر التي يمكن تكييفها لتجارب محددة. إضافة مكتب البراءات الأوروبي سيسمح كوانتيتيشن محمر المستعمرات، بينما تسمح جكسف بتعداد المستعمرات النقوي. إضافة كل من هذه السيتوكينات سيتيح الجيل زيمبابوي نسب متعددة. الأهم من ذلك، تسمح هذه الاختبارات اختبار السيتوكينات المفترضة وأثرها على انتشار هسبك والتمايز. يمكن أيضا تعديل هذه الاختبارات لإجراء اختبار المخدرات واسعة النطاق؛ يمكن أن تتعرض الأجنة بتركيزات مختلفة من المركبات عند نقاط زمنية مختلفة خلال التنمية لترى ما إذا كانت المواد الكيميائية لها تأثير إيجابي أو سلبي على إنتاج الدم. طريقة نهائي أنه يمكن تعديل هذه التجارب هو أنه يمكن حقن الأجنة في مرحلة واحدة-خلية مع مرناً محددة أو موس، الذي سوف أوفيريكسبريس أو ضربة قاضية جينات محددة، على التوالي. بعد وضع ح 24-48، يمكن أن تخضع هذه الأجنة لهذه الاختبارات لتحديد إذا كان مكسب أو خسارة-من-وظيفة جينات معينة تلعب دوراً أساسيا في تشكيل وانتشار التمايز هسبك. من المهم أيضا أن نلاحظ أن استخدام مختلف السلالات المعدلة وراثيا من الزرد سيساعد في سرعة وسهولة جمع وتفسير البيانات. على سبيل المثال، إذا كان أحد مهتم بتنمية محمر، أنه من السهل لإجراء هذه التجارب في gata1: دسريد الأجنة40، التي لها مروج محمر محددة وراثيا Gata1 النسخ عامل القيادة دسريد الأسفار. وبهذه الطريقة، عند تحليل المستعمرات محمر، يمكن الاستفادة من الفحص المجهري الأسفار. وبالمثل، يمكن إجراء هذه الدراسات على الحيوانات مع متعددة المتسلسلات الحالية للبحث عن الأنساب خلايا متعددة في وقت واحد. هذه التقنية ستكون مفيدة في تحديد هسبكس مولتيلينيجي؛ على الرغم من أن محمر والمستعمرات النقوي يمكن تمييزها بسهولة بالتشكل، من الصعب تحديد المستعمرات التي تحتوي على بيبوتينتيال موروث دون تصور وجود التعبير التحوير الخاصة بنسب متعددة في نفس المستعمرة .

على الرغم من أن هذه الاختبارات لها فوائد عديدة، من الضروري إعداد ضوابط كافية في كل مرة يتم إجراء هذه التجارب؛ اختلافات طفيفة في تقنية يمكن أن تغير نتائج وتفسيرات للنتائج. على سبيل المثال، فمن الممكن الحصول على أرقام مختلفة من هسبكس عند إجراء التجارب في أيام مختلفة إذا كان الأسلوب الخاص بك غير دقيقة؛ للتعامل مع هذا الاحتمال، واحدة ينبغي أن تتضمن دائماً عنصر تحكم مناسب. وينبغي أيضا تجهيز إذا كان يتم إجراء تجربة لاختبار تأثير مو على التنمية، ثم مراقبة الأجنة (أما أونينجيكتيد أو حقن مع عنصر تحكم مو) التي من براثن نفسه جنبا إلى جنب مع العينة التجريبية. إذا تم تصميم التجربة لاختبار تأثير دواء معين، ثم عينات غير المعالجة ينبغي إدراجها كعنصر تحكم. أخيرا، إذا كان اختبار آثار سيتوكين محددة شأن التنمية، ثم الحيوانات من براثن نفسه ينبغي أيضا ستعالج ودرست في نفس الوقت دون سيتوكين إضافة إلى الثقافة.

وبينما مباشرة للقيام بهذا التحليل في المختبر وسهلة لتفسير النتائج، يمكن أن تنشأ بعض المشاكل المحتملة أثناء الإجراء. إذا لا يوجد مستعمرات تعتبر بعد 7 أيام في الثقافة، هناك العديد من القضايا التي قد تكون حدثت. أولاً، تحقق للتأكد من أن السيتوكينات نقية وتركيزات السليم؛ اعتماداً على كيفية تم إنتاج السيتوكينات قد يلزم تغيير التركيزات وتحسين نشاطهم. والمسألة الأخرى التي تنشأ عادة من الإفراط هضم الأجنة، الذي يدمر هسبكس؛ العناية في مرحلة الهضم، وتغيير التوقيت إذا لا مستعمرات تعتبر مرارا وتكرارا. أخيرا، يمكن أن اختلاط ميثيلسيلولوسي وإضافة مصل الكارب القضية، لذا تأكد من أن جميع المكونات المضافة ومختلطة بشكل صحيح. وبالإضافة إلى المسائل التقنية، من المهم أن ندرك أن المستعمرات قد تحتاج فترة أطول لتطوير ظروف معينة؛ المستعمرات الصغيرة غالباً ما تكون مرئية أكثر بكثير بعد 3 يوما إضافيا في الثقافة. لا ينصح تجاوز 10 أيام، كما يبدأ ميثيلسيلولوسي لتجف بعد ذلك بوقت قصير. قضية مشتركة آخر أن المستعمرات في بعض الأحيان يميلون إلى جمع حول حواف أطباق بتري 35 مم؛ تفحص اللوحات جيدا، لا سيما حول الحواف، أمر ضروري. أيضا، من المهم أن نتذكر أن تتطور هذه المستعمرات في مادة سميكة، لزج؛ عندما تركز المجهر، ضبط التركيز صعودا وهبوطاً لمراقبة مختلف قليلاً طائرات-المستعمرات سوف لا أن يجلس على الجزء السفلي من الأطباق البلاستيك.

هذه الاختبارات في المختبر لها الكثير من المزايا، ولكن لديهم أيضا عدد قليل من القيود. المشكلة الأكبر هو أن هذه الاختبارات لا يثبت نهائياً السلف HSC-التي يمكن أن تثبت إلا بإعادة تشكيل طويلة الأجل للحيوانات المشععة. بالإضافة إلى ذلك، تم تعريفها ليست كلها السيتوكينات والتحقيق في الزرد حتى الآن، مما يحد من أنواع هسبكس التي يمكن أن تحقق. على سبيل المثال، لا السيتوكينات اللمفاوية داعمة الزرد قد حددت بعد، منع إنتاج ب وخلية T في هذه الاختبارات. وعلاوة على ذلك، من الواضح عند استزراع هسبكس مولتيبوتينت إذا إضافة بعض أنواع (أو المبالغ) السيتوكينات محددة يمكن أن تحرف التفريق بين أسفل بعض المسارات المكونة للدم. التحذير محتمل آخر أن هذا التحليل لا يمكن أن نستشف فعالية إذا هسبكس موجودة فعلا في عينة، ولكن لسبب غير قادر على التفريق بين (أو خلاف ذلك لا تكون قابلة للتطبيق). كما هو الحال مع معظم في المختبر فحوصات، كذلك تجارب ينبغي دائماً إجراء للتحقق من صحة النتائج. وفيما عدا هذه المسائل، الكثير من المعلومات يمكن استخلاصها من هذه الاختبارات الاستنساخ.

هذه الاختبارات كبيرة، لأنها تتيح فحص سريعة وفعالة من عيوب المكونة للدم. الباحثين يمكن أن نهدم بعض المسارات الجينية مع موس، ولوحة يهضم الحيوانات لمعرفة إذا كان هذا الجين يلعب دوراً في هيماتوبويسيس. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم الأسماك المسخ (التي تم إنشاؤها مسبقاً أو التي تم إنشاؤها حديثا في شاشات الطفرات) بسرعة وسهولة. كما تسمح هذه فحوصات المخدرات فعالية فحوصات الكشف على الكائنات الحية، وكلها التعرف على تحوير البيولوجيا هسبك حين يجري أيضا قادرة على مراقبة إذا المخدرات لها تأثير سلبي على التنمية أو البقاء على قيد الحياة. كما تسمح هذه فحوصات كوانتيتيشن هسبكس في الزرد النامي في تيميبوينتس مختلفة. وفي حين حاولت دراسات متعددة كوانتيتاتي أرقام HSC في البالغين7،27،،من3041 والزرد الجنينية3،4،42، 43، لا توجد دراسات قد quantitated كميات مختلفة من هسبكس مقيدة بالنسب في الزرد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تستخدم هذه الاختبارات لفحص وتعديل المسارات الجزيئية الهامة في تشكيل خلايا الدم والتمايز، وهي عملية ما زالت غامضة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تم توفير التمويل من "معاهد الصحة الوطنية" (المعاهد الوطنية للصحة: K01-DK087814-01A1 إلى D.L.S.)، "برنامج جامعة كاليفورنيا الولاية" للتعليم والبحوث في مجال التكنولوجيا الأحيائية (كسوبيرب: "السيطرة الجزيئية" من "الفقاريات مكانة المكونة للدم" إلى D.L.S.) ومن مكتب الدراسات العليا في جامعة ولاية كاليفورنيا في تشيكو (إلى A.C.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM StemCell Technologies  9300
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ Life Technologies 14080-055
HyClone PBS (1x) GE Healthcare Life Sciences sh30256.01
 DMEM 500 mL Corning CellGrow 10-017-CV
 Ham's F12 500 mL Corning CellGrow 10-080-CV
FBS 500 mL Gemini Bio-Products 100-108
HEPES 100 mL (1 M) Gibco life technologies 15-630-080
Penicillin/streptomycin (5000 U/mL
and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)
Corning Mediatech 30-009-CI
Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) Corning Mediatech 30-005-CR
1.5 mL MCF tube FisherBrand 05-408-129
3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock BD Safety Glide 305905
5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap Corning Falcon 352235
Methocel MC Sigma-Aldrich 64630
14 mL Polystyrene round bottom tube Corning Falcon 352057
10 mm polystyrene easygrip Petri dish Corning Falcon 351008
Librease TM Roche Sigma-Aldrich 5401119001 dissociation protease
Pronase Roche Sigma-Aldrich 11459643001 dechorionation protease
15 cm Petri dish Corning Falcon 351058
AB Zebrafish International Resource Center (ZIRC) ZL1 zebrafish strain used
Dithiolthreitol (DTT) Sigma-Aldrich 646563

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  5. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
  6. Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
  7. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
  8. Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
  9. Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
  10. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
  11. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  12. Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
  13. Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
  14. Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
  15. Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
  16. Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
  17. Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
  18. Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
  19. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
  20. Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
  21. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  22. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
  23. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
  24. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
  25. Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
  27. Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
  28. Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
  29. Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
  30. de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
  31. Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
  32. Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
  33. Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
  34. Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
  35. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
  36. Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
  37. Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
  38. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
  39. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
  40. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
  41. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
  42. Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
  43. Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
تطوير التحليل <em>في المختبر</em> كوانتيتاتي الجذعية المكونة للدم والسلف الخلايا (هسبكس) في تطوير الأجنة الزرد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).More

Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter