यहाँ, हम भ्रूण zebrafish में टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) quantitate करने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं । असंबद्ध zebrafish से HSPCs सहायक कारकों के साथ methylcellulose में चढ़ाया जाता है, परिपक्व रक्त में अंतर । यह रक्त दोषों का पता लगाने की अनुमति देता है और दवा स्क्रीनिंग आसानी से आयोजित किया जा करने के लिए अनुमति देता है ।
Hematopoiesis एक आवश्यक सेलुलर प्रक्रिया है जिसमें टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) अलग कोशिका वंश कि परिपक्व रक्त शामिल की भीड़ में अंतर है । अलगाव और इन HSPCs की पहचान मुश्किल है क्योंकि वे पूर्व पोस्ट वास्तविकपरिभाषित कर रहे हैं; वे केवल विशिष्ट कोशिका वंश में उनके भेदभाव के बाद परिभाषित किया जा सकता है । पिछले कुछ दशकों से zebrafish (ढाणियो rerio) hematopoiesis का अध्ययन करने वाला एक मॉडल जीव बन गया है । Zebrafish भ्रूण पूर्व uteroविकसित, और द्वारा ४८ ज बाद निषेचन (hpf) निश्चित HSPCs. परख पैदा की है HSPC भेदभाव और प्रसार क्षमताओं का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है, प्रत्यारोपण और बाद का उपयोग टेम प्रणाली का पुनर्गठन फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ विशेष ट्रांसजेनिक लाइनों visualizing के अलावा । हालांकि, इन परख लागत पर प्रतिबंधक हैं, तकनीकी रूप से मुश्किल है, और कई प्रयोगशालाओं के लिए समय लगता है । एक इन विट्रो मॉडल के विकास HSPCs का आकलन करने के लिए प्रभावी लागत, जल्दी होगा, और कम कठिनाइयों पहले वर्णित विधियों की तुलना में वर्तमान, प्रयोगशालाओं जल्दी mutagenesis और दवा स्क्रीन है कि HSPC जीव विज्ञान को प्रभावित का आकलन करने के लिए अनुमति देता है । इस उपंयास इन विट्रो परख HSPCs का आकलन करने के लिए असंबद्ध पूरे zebrafish भ्रूण चढ़ाना और exogenous कारकों है कि केवल HSPC भेदभाव और प्रसार को बढ़ावा देने के द्वारा किया जाता है । भ्रूण एकल कोशिकाओं में असंबद्ध और HSPC के साथ चढ़ाया सहायक कॉलोनी कारकों उत्तेजक है कि उंहें पैदा करने के लिए कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) है कि एक जनक सेल से पैदा उत्तेजित । इन परख आणविक HSPC प्रसार, भेदभाव के लिए जिंमेदार रास्ते के और अधिक सावधान परीक्षा की अनुमति चाहिए, और विनियमन है, जो शोधकर्ताओं हड्डीवाला hematopoiesis और उसके dysregulation के आधार समझने के लिए अनुमति देगा रोग के दौरान ।
Hematopoiesis एक जीव के अस्तित्व के लिए आवश्यक परिपक्व रक्त कोशिकाओं की भीड़ बनाने की प्रक्रिया है । यह एक महत्वपूर्ण विकास प्रक्रिया है कि विकास के लिए प्रतिबंधित कोशिका प्रकार है कि परिपक्व रक्त शामिल की एक किस्म में टेम स्टेम सेल (HSCs) के भेदभाव शामिल है । इन HSCs आत्म नवीकरण करना चाहिए ताकि प्रणाली कभी नहीं थक गया है और वे जल्दी भ्रूण विकास से मृत्यु तक बनाए रखना चाहिए । रीढ़ में, लगातार भेदभाव और टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) के प्रसार के लिए पर्याप्त रूप से रक्त कोशिकाओं है कि पोस्ट कर रहे है के बहुमत की भरपाई की जरूरत है mitotic और हर दिन पुनर्नवीनीकरण किया जा रहा है । HSCs पहले प्रतिबंधित जनक कोशिकाओं के उपसमुच्चय में अंतर से परिपक्व रक्त कोशिकाओं उत्पन्न; आम लसीकावत् progenitors (CLPs)1, जो अंततः टी, बी, और NK कोशिकाओं का उत्पादन, और आम माइलॉयड progenitors (CMPs)2 कि उत्पन्न granulocytes, एरिथ्रोसाइट्स, मैक्रोफेज, और megakaryocytes. इन progenitors विशिष्ट कोशिका वंश पैदा करने के लिए प्रतिबद्ध हैं, और आगे ऐसी माइलॉयड erythroid progenitors (MEPs) के रूप में अधिक विकास प्रतिबंधित जनक कोशिकाओं में अंतर है कि एरिथ्रोसाइट्स और प्लेटलेट्स उत्पन्न, या granulocyte macrophage progenitors (GMPs) जो बेसोफिल, इयोस्नोफिल्स, न्यूट्रोफिल, और मैक्रोफेज2उत्पन्न करता है । पहचान और अलग इन progenitors टेम भेदभाव में शामिल महत्वपूर्ण आणविक रास्ते की पहचान की अनुमति देता है और ल्यूकेमिया जैसे कई टेम रोगों उठता है जब इन जनक कोशिकाओं को ठीक करने के लिए असफल अंतर.
पिछले कुछ दशकों में, zebrafish (ढाणियो rerio) मॉडल प्रणाली भ्रूण और वयस्क टेम अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण अनुसंधान उपकरण बन गया है । Zebrafish आनुवंशिक विश्लेषण के लिए उत्तरदायी हैं और phylogenetically निम्नतम हड्डीवाला मॉडल प्रजातियाँ हैं जो मनुष्यों को एक समान vasculature और टेम प्रणाली है. Zebrafish भ्रूण पूर्व utero विकसित, और ४८ घंटे के भीतर निषेचन के बाद (hpf) उत्पंन HSPCs3,4,5,6,7,8। Zebrafish भी अत्यधिक उपजाऊ हैं, महिलाओं के साथ एक ही क्लच में १०० से अधिक अंडे बिछाने, बड़े नमूना आकार और प्रयोगात्मक प्रतिकृति के लिए अनुमति देता है । Zebrafish भ्रूण ऑप्टिकली पारदर्शी हैं, टेम प्रणाली के सूक्ष्म दृश्य के लिए अनुमति देता है । zebrafish के कई फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक लाइनें ऐसी runx1के रूप में HSCs अंकन: EGFP मछली9, cd41: EGFP मछली10, और kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 डबल पॉजिटिव जानवरों, जीने के लिए अनुमति देते हैं, HSC उद्भव और विस्तार vivo3,4,7,8, 9. है zebrafish त्वरित पीढ़ी के समय और विकास के पूर्व utero mutagenesis अध्ययन में इसके उपयोग के लिए नेतृत्व किया है11,12,13,14,15 और नशीली दवाओं स्क्रीनिंग16,17,18,19,20 यौगिकों कि मानव रक्त विकारों के लिए चिकित्सीय वादा पकड़ के लिए । कुल मिलाकर, टेम प्रणाली के संरक्षण, उपस्थिति और ट्रांसजेनिक लाइनों के आसान विकास, और जल्दी पुनर्जनन समय zebrafish एक सस्ती, जल्दी, लचीला है, और टेम अध्ययन के लिए आदर्श मॉडल बना दिया है ।
अलग और परीक्षण HSCs के कई तरीकों स्तनधारी टेम प्रणालियों में विकसित किया गया है । जांचकर्ताओं HSCs21,22,23,24, के रूप में अच्छी तरह से समाप्ति डाई25,26के लिए HSCs की क्षमता का दोहन करने के लिए चिह्नित करने के लिए सेल सतह रिसेप्टर्स का एक संयोजन का उपयोग कर सकते हैं । वे लेबल कर रहे हैं के बाद, प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS) उनके शारीरिक जुदाई की अनुमति देता है. साबित करना है कि एक सेल एक HSC है radiating अंतर्जात HSPCs को नष्ट करने के लिए एक मेजबान जानवर की आवश्यकता है, ख्यात HSCs प्रत्यारोपण, और दीर्घकालिक, बहु सभी परिपक्व रक्त कोशिका प्रकार के वंश पुनर्गठन देख । इन परख चूहों में अच्छी तरह से काम करते हैं, के रूप में वहां कई सेल टेम कोशिकाओं और नस्ल माउस उपभेदों कि प्रत्यारोपण के लिए प्रतिरक्षा मिलान की सुविधा के खिलाफ सतह एंटीबॉडी रहे हैं । हालांकि, कुछ zebrafish टेम कोशिका-सतह एंटीबॉडी27उत्पंन किया गया है, पहचान और HSCs के अलगाव में बाधा । zebrafish HSCs को चिह्नित और अलग करने का सबसे आम तरीका ट्रांसजेनिक जानवरों के साथ है, जिससे एक कोशिका-विशिष्ट प्रवर्तक अनुक्रम एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति चला रहा है । अध्ययनों की कल्पना की है और इस तकनीक का उपयोग सूक्ष्मता के साथ पृष्ठीय महाधमनी के ventral दीवार में HSCs की गणना की है3,4,8,9। अंय प्रयोगशालाओं zebrafish28,29 के क्लोनिंग उपभेदों उत्पंन किया है और MHC-मिलान पशुओं30में सफल प्रत्यारोपण का प्रदर्शन । हालांकि, इन तकनीकों की लागत कई प्रयोगशालाओं के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं, तकनीकी रूप से मुश्किल है, और समय लगता है । इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, प्रयोगशालाओं की उपस्थिति के लिए परीक्षण करने के लिए इन विट्रो परख में कई उत्पंन किया है, प्रसार दर, और HSPCs31के भेदभाव की क्षमता,३२,३३, ३४,३५,३६. ये परख इन विट्रो31,३२,३३,३४,३५,३६, के बचाव में HSPCs के प्रसार और भेदभाव दिखाते हैं । टेम दोष३६, और खोज और परीक्षण के लिए एक कुशल विधि साइटोकिंस३३,३४,३५। वे भी HSPC जीवविज्ञान31,३२के लिए जिंमेदार जीन की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया है । इस अध्ययन में, हम इन परख एक कदम आगे ले, एक विकासशील zebrafish भ्रूण में HSPCs के quantitation की अनुमति । इन परख भी उत्परिवर्ती पशुओं और टेम-विघटनकारी दवाओं के साथ इलाज जानवरों में HSPCs की संख्या quantitate करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । संक्षेप में, इन परख तेजी से कर रहे हैं, वर्तमान कुछ तकनीकी चुनौतियों, और HSPC संख्या quantitate करने के लिए सस्ती तरीके हैं, उनके प्रसार की जांच, और भेदभाव में ब्लॉक की जांच ।
zebrafish मॉडल प्रणाली आदिम और निश्चित हड्डीवाला hematopoiesis के अध्ययन के लिए एक कुशल, प्रभावी, और सस्ती मॉडल बन गया है । परख की पीढ़ी है कि तेजी से कर रहे हैं, सस्ती, और वर्तमान कुछ तकनीकी कठिनाइयों छोटे अणुओं के परीक…
The authors have nothing to disclose.
धन स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा प्रदान की गई (NIH: K01-DK087814-01A1 D.L.S. के लिए), कैलिफोर्निया राज्य जैव प्रौद्योगिकी में शिक्षा और अनुसंधान के लिए विश्वविद्यालय कार्यक्रम (CSUPERB: हड्डीवाला टेम आला के आणविक नियंत्रण D.L.S. के लिए) और कैलिफोर्निया स्टेट यूनिवर्सिटी चिको (A.C.B. करने के लिए) में स्नातक अध्ययन कार्यालय से ।
10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |