Summary

Développement d’un test In Vitro pour doser les progéniteurs et souches hématopoïétiques cellules (HSPCs) dans le développement des embryons de poisson-zèbre

Published: November 30, 2017
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Summary

Nous présentons ici une méthode simple pour quantifier les cellules hématopoïétiques souches et progénitrices (HSPCs) chez le poisson zèbre embryonnaire. HSPCs de poisson-zèbre dissocié sont plaqués en méthylcellulose facteurs favorables, DIFFERENCIATION en sang mature. Cela permet la détection du sang des défauts et permet aux médicaments de dépistage doit être réalisée facilement.

Abstract

L’hématopoïèse est un processus cellulaire essentiel dans lequel des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) se différencient en la multitude de lignées cellulaires qui composent le sang mature. Isolement et identification de ces HSPCs est difficile parce qu’ils sont définis ex post facto; ils ne peuvent être définis qu’après leur différenciation en lignées cellulaires spécifiques. Dans les dernières décennies, le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme modèle pour étudier l’hématopoïèse. Développent ex uterodes embryons de poisson-zèbre et par fécondation après 48 h (hpf) ont généré définitif HSPCs. tests afin d’évaluer la différenciation HSPC et capacités de prolifération ont été développées, utilisant la transplantation et suivantes reconstitution du système hématopoïétique en plus de la visualisation des lignées transgéniques spécialisées avec la microscopie confocale. Cependant, ces essais sont coût prohibitif, techniquement difficile et chronophage pour de nombreux laboratoires. Développement d’un modèle in vitro pour évaluer HSPCs serait rentable, plus rapide, et présentes moins de difficultés par rapport à précédemment décrit les méthodes, permettant aux laboratoires d’évaluer rapidement des écrans mutagenèse et de drogues qui affectent la biologie HSPC. Cette analyse roman in vitro pour évaluer HSPCs est réalisée par les embryons de poissons zèbres entier de placage dissociée et ajout des facteurs exogènes qui favorisent seulement la CSPH différentiation et la prolifération. Embryons sont dissociés en cellules individuelles et plaqués avec HSPC conciliants facteurs stimulants de colonie qui les amènent à générer des unités formant colonies (UFC) qui proviennent d’une cellule unique ancêtre. Ces tests devraient permettre un examen plus attentif des voies moléculaires responsables de la prolifération, la différenciation et la réglementation, ce qui permettra aux chercheurs de comprendre les fondements de l’hématopoïèse vertébré et son dérèglement HSPC au cours de la maladie.

Introduction

L’hématopoïèse est le processus de fabrication de la multitude de cellules sanguines matures nécessaires à la survie de l’organisme. C’est un processus de développement clé qui implique la différenciation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) dans une variété de types de cellules développemental restreinte qui composent le sang mature. Ces CSH doit se renouveler afin que le système n’est jamais épuisé et ils doivent persister depuis le début du développement embryonnaire jusqu’à la mort. Chez les vertébrés, la constante différenciation et la prolifération des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) sont nécessaires pour remplir adéquatement la majorité des cellules sanguines qui sont post-mitotiques et être recyclé tous les jours. CSH génère des cellules sanguines matures en premier différenciant en sous-ensembles de cellules progénitrices restreinte ; commune cellules souches lymphoïdes (SPDP)1, qui finit par produire des cellules T et B NK et commune progéniteurs myéloïdes (CMPs)2 qui génèrent les granulocytes, les érythrocytes, les macrophages et les mégacaryocytes. Ces cellules souches se sont engagés à générer des lignées cellulaires spécifiques et davantage se différencient en plus progéniteurs développemental restreints tels que les progéniteurs érythroïdes myéloïde (députés) qui génèrent des érythrocytes et des plaquettes ou des granulocytes progéniteurs de macrophages (BPF) qui génèrent des basophiles, éosinophiles, neutrophiles et les macrophages2. Identifier et isoler ces cellules souches permettent l’identification d’importants mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation hématopoïétique et de nombreuses maladies hématopoïétiques telles que la leucémie se posent lorsque ces cellules progénitrices ne pas correctement faire la différence.

Dans les dernières décennies, le système de modèle de poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un outil de recherche d’études hématopoïétiques embryonnaires et adultes. Poisson zèbre se prêtent à des analyses génétiques et sont les espèces de vertébrés modèle phylogénétiquement plus bas qui ont une vascularisation similaire et le système hématopoïétique aux humains. Développent des embryons de poisson-zèbre ex utero, et dans les 48 heures après la fécondation (hpf) générer HSPCs3,4,5,6,7,8. Poisson zèbre sont également très fécondes, les femelles portant sur 100 oeufs dans une seule couvée, permettant la réplication expérimentale et de vastes échantillons. Des embryons de poisson-zèbre sont optiquement transparentes, permettant une visualisation microscopique du système hématopoïétique. Plusieurs lignées transgéniques fluorescentes de poisson-zèbre marquage autorenouveler comme runx1: EGFP poisson9, cd41: EGFP pêcher10, et kdrl :mCherry ; CMJN: GFP3 double-positifs animaux, permettent pour la visualisation en temps réel de HSC émergence et l’expansion in vivo3,4,7,8, 9. Génération rapide temps et développement ex utero du poisson-zèbre a mené à son utilisation en mutagénèse études11,12,13,14,15 et drogues le dépistage de16,17,18,19,20 pour les composés qui sont thérapeutiques prometteuses pour troubles du sang humain. Dans l’ensemble, conservation du système hématopoïétique, la présence et le développement facile des lignées transgéniques et l’heure de régénération rapide a fait le poisson-zèbre, un modèle peu coûteux, rapide, flexible et idéal pour les études hématopoïétiques.

Nombreuses méthodes d’isolement et CSH ont été développés dans des systèmes hématopoïétiques chez les mammifères. Les enquêteurs peuvent utiliser une combinaison de récepteurs membranaires à Marc autorenouveler21,22,23,24, en plus d’exploiter la capacité des CSH à efflux colorant25,26. Après qu’ils sont étiquetés, cellule activée par fluorescence triant (FACS) permet leur séparation physique. Ce qui prouve qu’une cellule est un HSC nécessite irradier un animal hôte pour détruire HSPCs endogènes, repiquage autorenouveler putatif et en observant les reconstitution à long terme, lignée multiples de tous matures des types de cellules sanguines. Ces tests fonctionnent bien chez la souris, comme il y a de nombreux anticorps de surface cellulaire contre les cellules hématopoïétiques et souches de souris consanguines qui facilitent le système immunitaire correspondant à la transplantation. Cependant, quelques poissons zèbres hématopoïétiques anticorps de surface cellulaire ont été généré27, empêchant l’identification et l’isolement des CSH. La façon la plus courante pour marquer et isoler le poisson-zèbre CSH est avec des animaux transgéniques, selon lequel une séquence promotrice de la spécificité cellulaire est le moteur expression de la protéine fluorescente. Études ont visualisé et énuméré les CSH dans la paroi ventrale de l’aorte dorsale au microscope utilisant cette technique3,4,8,9. Autres laboratoires ont généré des souches clonales du poisson-zèbre28,29 et ont effectué des greffes réussies dans animaux appariés MHC30. Toutefois, ces techniques sont inabordable pour de nombreux laboratoires, sont techniquement difficiles et demandent beaucoup de temps. Pour résoudre ces problèmes, les laboratoires ont généré plusieurs essais in vitro pour tester la présence, le taux de prolifération et la capacité de différenciation des HSPCs31,32,33, 34,35,,36. Ces tests montrent la prolifération et la différenciation des HSPCs in vitro31,32,33,34,35,36, le sauvetage des hématopoïétiques défauts36et une méthode efficace pour découvrir et tester les cytokines33,34,35. Ils ont également été utilisés pour identifier les gènes responsables de la CSPH biologie31,32. Dans cette étude, nous prenons ces tests un peu plus loin, ce qui permet le dosage des HSPCs dans un embryon de poisson zèbre. Ces tests peuvent également être utilisées pour quantifier le nombre de HSPCs chez les animaux mutants et animaux traités avec des médicaments hématopoïétiques sans interruption. Essentiellement, ces tests sont rapides, présentes quelques difficultés techniques et des moyens peu coûteux pour quantifier les numéros HSPC, examiner leur prolifération et enquêter sur les blocs dans la différenciation.

Protocol

Le Conseil consultatif institutionnel animalier et utilisation Comité (IACUC) à la California State University, Chico, approuvé toutes les méthodes décrites ci-dessous. 1. eau de Javel 48 hpf embryons de poisson-zèbre Avec 15 cm x 15 (w) cm (l) x contenants de plastique de 7 cm (h) créer des stations de lavage 3 : 1) avec 1 mL d’eau de Javel 5 % dans 1000 mL de milieu d’embryon (E3 ; voir tableau 1), 2) avec E3 stérile et 3) E3 stérile. Veiller à ce q…

Representative Results

Pour évaluer les numéros HSPC chez le poisson zèbre embryonnaire, 48 embryons hpf ont été digérés, plaqués en méthylcellulose présentant des facteurs de croissance hématopoïétiques conciliants exogènes et incubés pendant 7 jours (Figure 1A). Après 7 jours, unités formant colonies (UFC) ont été énumérés (Figure 1B) et représentation (Figure 1<st…

Discussion

Le système de modèle de poisson-zèbre est devenu un modèle efficient, efficace et peu coûteux pour étudier l’hématopoïèse vertébré primitif et définitive. Génération de tests qui sont rapides, peu coûteux et présenter quelques difficultés techniques peut être utilisée pour les essais de petites molécules, analysant les embryons mutants et élucider les voies moléculaires importantes pour la biologie HSPC. In vitro un placage de HSPCs de poisson-zèbre adulte est une méthode efficace pour …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financé par le National Institutes of Health (NIH : K01-DK087814-01 a 1 à D.L.S.), Program de la California State University pour l’éducation et de recherche en biotechnologie (CSUPERB : contrôle moléculaire de la Niche hématopoïétiques vertébrés à D.L.S.) et du Bureau des études supérieures au California State University Chico (à A.C.B.).

Materials

10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM StemCell Technologies  9300
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ Life Technologies 14080-055
HyClone PBS (1x) GE Healthcare Life Sciences sh30256.01
 DMEM 500 mL Corning CellGrow 10-017-CV
 Ham's F12 500 mL Corning CellGrow 10-080-CV
FBS 500 mL Gemini Bio-Products 100-108
HEPES 100 mL (1 M) Gibco life technologies 15-630-080
Penicillin/streptomycin (5000 U/mL
and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)
Corning Mediatech 30-009-CI
Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) Corning Mediatech 30-005-CR
1.5 mL MCF tube FisherBrand 05-408-129
3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock BD Safety Glide 305905
5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap Corning Falcon 352235
Methocel MC Sigma-Aldrich 64630
14 mL Polystyrene round bottom tube Corning Falcon 352057
10 mm polystyrene easygrip Petri dish Corning Falcon 351008
Librease TM Roche Sigma-Aldrich 5401119001 dissociation protease
Pronase Roche Sigma-Aldrich 11459643001 dechorionation protease
15 cm Petri dish Corning Falcon 351058
AB Zebrafish International Resource Center (ZIRC) ZL1 zebrafish strain used
Dithiolthreitol (DTT) Sigma-Aldrich 646563

References

  1. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  5. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
  6. Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
  7. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
  8. Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
  9. Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
  10. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
  11. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  12. Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
  13. Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
  14. Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
  15. Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
  16. Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
  17. Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
  18. Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
  19. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
  20. Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
  21. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  22. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
  23. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
  24. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
  25. Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
  27. Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
  28. Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
  29. Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
  30. de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
  31. Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
  32. Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
  33. Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
  34. Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
  35. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
  36. Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
  37. Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
  38. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
  39. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
  40. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
  41. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
  42. Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
  43. Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).

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Cite This Article
Berrun, A., Stachura, D. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).

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