Udvikling af et In Vitro Assay at kvantificere hæmatopoietisk stilk og stamfader celler (HSPCs) i at udvikle zebrafisk embryoner
Summary
Her præsenterer vi en enkel metode til at kvantificere hæmatopoietisk stilk og stamfader celler (HSPCs) i embryonale zebrafisk. HSPCs fra dissocierede zebrafisk er belagt i methylcellulose med understøttende faktorer, differentiere til modne blod. Dette giver mulighed for påvisning af blod pixeldefekter og giver mulighed for narkotika screening for at foretages nemt.
Abstract
Bloddannelsen er en afgørende cellulære proces hvor hæmatopoietisk stilk og stamfader celler (HSPCs) differentiere i mange forskellige celle slægter, der omfatter modne blod. Isolering og identifikation af disse HSPCs er vanskelig, fordi de er defineret ex post facto; de kan kun defineres efter deres differentiering af specifikke celle lineages. I de seneste par årtier, er zebrafisk (Danio rerio) blevet en model organisme at studere bloddannelsen. Zebrafisk embryoner udvikle ex utero, og af 48 timer efter befrugtning (hpf) har genereret definitive HSPCs. Assays for at vurdere HSPC differentiering og spredning kapaciteter er blevet udviklet, udnytte transplantation og efterfølgende rekonstituering af hæmatopoietisk systemet ud over visualisere specialiserede transgene linjer med Konfokal mikroskopi. Men disse assays er omkostningerne uoverkommelige, teknisk vanskeligt og tidskrævende for mange laboratorier. Udvikling af en in vitro- model til at vurdere HSPCs ville være omkostningseffektive, hurtigere, og færre vanskeligheder i forhold til tidligere beskrevne metoder, så laboratorier til hurtigt at vurdere mutagenese og narkotika skærme, der påvirker HSPC biologi. Denne roman i vitro assay at vurdere HSPCs er udført af plating dissocieres hele zebrafisk embryoner og tilføje eksogene faktorer, der fremmer kun HSPC differentiering og spredning. Embryoner er adskilles i enkelt celler og belagt med HSPC-støttende koloni stimulerende faktorer, der forårsager dem til at generere koloni danner enheder (CFUs) der opstår fra en enkelt stamfader celle. Disse assays skal tillade mere omhyggelig undersøgelse af de molekylære veje ansvarlig for HSPC spredning, differentiering og regulering, som giver forskere til at forstå fundament for hvirveldyr bloddannelsen og dens dysregulering under sygdom.
Introduction
Bloddannelsen er processen med at gøre mange modne blodceller kræves for en organisme overlevelse. Det er en vigtig udviklingsproces, der involverer differentiering af hæmatopoietisk stamceller (HSCs) ind i en række udviklingshæmmede begrænset celletyper, der omfatter modne blod. Disse HSCs skal selv forny, således at systemet aldrig er opbrugt, og de skal fortsætte fra begyndelsen embryonale udvikling indtil døden. I hvirveldyr, konstant differentiering og spredning af hæmatopoietisk stilk og stamfader celler (HSPCs) er nødvendige for at tilstrækkeligt genbestilles fleste af blodlegemer, der er post mitotiske og bliver genanvendt hver dag. HSCs genererer modne blodceller af første differentiering i delmængder af begrænset stamceller; fælles lymfoide stamceller (CLPs)1, som i sidste ende producerer T-, B- og NK celler, og fælles myeloide stamceller (Kystforvaltningsplaner)2 , der genererer granulocytter, erytrocytter, makrofager og megakaryocytes. Disse ophav er forpligtet til at generere specifikke celle slægter, og yderligere differentiere i flere udviklingshæmmede begrænset stamceller som myeloid erythroid ophav (MEP’erne) at genererer erytrocytter og trombocytter eller granulocyt makrofag stamfaderen (GMPs), der genererer basofile, eosinofile, neutrofiler og makrofager2. At identificere og isolere disse stamfaderen giver identifikation af vigtige molekylære veje involveret i hæmatopoietisk differentiering og mange hæmatopoietisk sygdomme såsom leukæmi opstår når disse stamceller ikke korrekt differentiere.
I de seneste par årtier, er zebrafisk (Danio rerio) modelsystemet blevet en vigtig forskningsværktøj til embryonale og voksne hæmatopoietisk undersøgelser. Zebrafisk kan efterproeve genetisk analyse og er Fylogenetisk laveste hvirveldyr model arter, som har en lignende vaskulatur og hæmatopoietisk systemet til mennesker. Zebrafisk embryoner udvikle ex utero, og inden for 48 timer post befrugtning (hpf) generere HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebrafisk er også yderst frugtbar, med hunnerne om over 100 æg i en enkelt kobling, giver mulighed for store stikprøvestørrelser og eksperimenterende replikering. Zebrafisk embryoner er optisk gennemsigtige, giver mulighed for mikroskopiske visualisering af hæmatopoietisk systemet. Flere fluorescerende transgene linjer af zebrafisk mærkning HSCs som runx1: EGFP fiske9, cd41: EGFP fiske10, og kdrl:mCherry; cmyb: normal god landbrugspraksis3 dobbelt-positive dyr, giver mulighed for live, real-time visualisering af HSC fremkomsten og ekspansion i vivo3,4,7,8, 9. Zebrafisks hurtig generation tid og udvikling ex utero har ført til dens anvendelse i mutagenese undersøgelser11,12,13,14,15 og stof screening16,17,18,19,20 til forbindelser, der holder terapeutiske lovende for menneskelige blodsygdomme. Bevarelse af hæmatopoietisk systemet, tilstedeværelse og nem udvikling af transgene linjer og hurtig regenerering tid har generelt gjort zebrafisk en billig, hurtig, fleksibel og ideel model for hæmatopoietisk undersøgelser.
Talrige metoder til isolering og test HSCs er blevet udviklet i pattedyr hæmatopoietisk systemer. Efterforskere kan udnytte en kombination af celle overfladen receptorer til at markere HSCs21,22,23,24, samt udnytte evne til HSCs at efflux farvestof25,26. Efter at de er mærket, tillader fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) deres fysiske adskillelse. Beviser, at en celle er en HSC kræver bestråling af en vært dyret at ødelægge endogene HSPCs, omplantning formodede HSCs, og observere langsigtede, multi lineage rekonstituering af alle modne blod celletyper. Disse assays fungerer godt i mus, som der er mange celle-overflade antistoffer mod hæmatopoietisk celler og indavlede mus stammer, der letter immun matchende til transplantation. Par zebrafisk hæmatopoietisk celle-overflade antistoffer har dog været genererede27, hindre identifikation og isolering af HSCs. Den mest almindelige måde at markere og isolere zebrafisk HSCs er med transgene dyr, hvorved en celle-specifikke promotor sekvens er drivkraften bag en fluorescerende proteiner udtryk. Undersøgelser har visualiseret og optalt HSCs i den ventrale mur af dorsal aorta med mikroskopi udnytte denne teknik3,4,8,9. Andre laboratorier har genereret klonede stammer af zebrafisk28,29 og har udført vellykkede transplantationer i MHC-matchede dyr30. Men disse teknikker er omkostningseffektivt uoverkommelige for mange laboratorier, er teknisk vanskeligt, og er tidskrævende. For at løse disse problemer, har laboratorier, der genereret flere in vitro- assays til at teste for forekomst, spredning priser og differentiering kapaciteten af HSPCs31,32,33, 34,35,36. Disse assays vis spredning og differentiering af HSPCs in vitro-31,32,33,34,35,36, redning af hæmatopoietisk defekter36, og en effektiv metode til at opdage og teste cytokiner33,34,35. De har også været udnyttet til at identificere gener ansvarlige for HSPC biologi31,32. I denne undersøgelse tager vi disse assays et skridt videre og giver mulighed for kvantificering af HSPCs i et embryo under udvikling zebrafisk. Disse undersøgelser kan også udnyttes til at kvantificere antallet af HSPCs i mutant dyr og dyr behandlet med hæmatopoietisk-forstyrrende stoffer. I bund og grund disse assays er hurtig, til stede nogle tekniske udfordringer, og billige måder at kvantificere HSPC numre, undersøge deres spredning og undersøge blokke i differentiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafisk modelsystemet er blevet en effektiv, effektiv og billig model til at studere primitive og endelige hvirveldyr bloddannelsen. Generation af assays, der er hurtig, billig, og præsentere nogle tekniske vanskeligheder kan udnyttes til at teste små molekyler, analysere mutant embryoner og belyse molekylære veje vigtigt for HSPC biologi. In vitro- plating af HSPCs fra voksne zebrafisk er en effektiv metode til at studere mutagenese, cytokiner og hæmatopoietisk defekter. Denne protokol bygger på disse un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansieringen blev leveret af National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 til D.L.S.), California State University Program for uddannelse og forskning inden for bioteknologi (CSUPERB: Molekylær kontrol af hvirveldyr hæmatopoietisk Niche til D.L.S.) og studier på kontoret på California State University Chico (til A.C.B.).
Materials
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
References
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
- Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
- Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
- Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
- Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
- de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
- Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
- Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
- Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
- Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
- Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
- Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
