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Developmental Biology

Entwicklung eines In-vitro- Assay, hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen Quantitate Zellen (HSPCs) bei der Entwicklung von Zebrafish Embryos

doi: 10.3791/56836 Published: November 30, 2017

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode um hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen Zellen (HSPCs) im embryonalen Zebrafisch quantitate. HSPCs von dissoziierten Zebrafisch sind in Methylcellulose mit unterstützenden Faktoren, Differenzierung in Reife Blut beschichtet. Dies ermöglicht die Erkennung von Blut Mängel und Drogen-screening um leicht durchgeführt werden.

Abstract

Hämatopoese ist ein wesentlicher zellulärer Prozess in dem hämatopoetische Stammzellen und Vorläuferzellen Zellen (HSPCs) in der Vielzahl der verschiedenen Zell-Linien zu unterscheiden, die Reife Blut umfassen. Isolierung und Identifizierung von dieser HSPCs ist schwierig, weil sie Ex-post-Factodefiniert sind; Sie können nur nach ihrer Differenzierung in bestimmte Zelle Linien definiert werden. In den letzten Jahrzehnten geworden der Zebrabärbling (Danio Rerio) Modellorganismus Hämatopoese zu studieren. Zebrafisch-Embryonen entwickeln ex Uteround von 48 h nach Befruchtung (hpf) haben definitive HSPCs. Assays zur Beurteilung von HSPC Differenzierung generiert und Verbreitung Funktionen wurden entwickelt, unter Verwendung der Transplantation und die anschließende Rekonstitution des blutbildenden Systems neben der Visualisierung von spezialisierten transgener Linien mit der konfokalen Mikroskopie. Allerdings sind diese Tests Kosten unerschwinglich, technisch schwierig und zeitaufwendig für viele Labore. Entwicklung eines in-vitro- Modells HSPCs zu bewerten wäre kostengünstiger, schneller und weniger Schwierigkeiten im Vergleich zu vorher beschriebenen Methoden, so dass Laboratorien zu schnell beurteilen, Mutagenese und Drogen-Bildschirme, die HSPC Biologie betreffen. Dieser neuartige in-vitro- Assay zur HSPCs Bewertung erfolgt durch Beschichtung getrennt ganze Zebrafish Embryos und Hinzufügen von exogenen Faktoren, die nur HSPC Differenzierung und Verbreitung zu fördern. Embryonen sind getrennt in einzelne Zellen und vergoldet mit HSPC-unterstützende Kolonie stimulierende Faktoren, die bewirken, dass sie Kolonie bildende Einheiten (KBE) erzeugen, die aus einer einzigen Stammvater Zelle entstehen. Diese Tests sollen vorsichtigeren Untersuchung der molekularen Wege verantwortlich für HSPC Proliferation, Differenzierung und Verordnung, die Forscher zu verstehen, die Grundlagen der vertebrate Hämatopoese und seine Dysregulation ermöglichen während der Krankheit.

Introduction

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Hämatopoese ist der Prozess der Herstellung der Vielzahl von Reife Blutzellen notwendig für das Überleben eines Organismus. Es ist eine wichtige Entwicklungsprozess, die die Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) beinhaltet in einer Vielzahl von entwicklungspolitisch eingeschränkt Zelltypen, die Reife Blut enthalten. Diese HSCs müssen selbst erneuern, so dass das System nie erschöpft ist und sie müssen von der frühen embryonalen Entwicklung bis zum Tod bestehen. Bei Wirbeltieren, ständige Differenzierung und Proliferation von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) genügen, um ausreichend die Mehrheit der Blutzellen wieder aufzufüllen, die Post-mitotische sind und jeden Tag recycelt. HSZ generieren Reife Blutzellen durch die erste Differenzierung in Teilmengen eingeschränkt Vorläuferzellen; gemeinsame lymphoide Vorläuferzellen (CLP)1, die schließlich T, B- und NK-Zellen produzieren, und gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen (CMPs)2 , die Erythrozyten, Granulozyten, Makrophagen und Megakaryozyten zu generieren. Diese Vorfahren verpflichtet bestimmte Zelle Linien erzeugen und weiter differenzieren in mehr entwicklungsgeschichtlich eingeschränkt Vorläuferzellen wie myeloischen erythroiden Vorläuferzellen (MdEP), die Erythrozyten und Thrombozyten und Granulozyten generieren Makrophagen Stammväter (GVP), die eosinophile, Basophils, neutrophilen Granulozyten und Makrophagen2erzeugen. Identifizieren und isolieren diese Stammväter ermöglicht die Identifikation von wichtigen molekularen Signalwege hämatopoetischen Differenzierung beteiligt und viele hämatopoetische Krankheiten wie Leukämie entstehen, wenn diese Vorläuferzellen nicht richtig zu unterscheiden.

In den letzten Jahrzehnten ist der Zebrafisch (Danio Rerio) Modellsystem wichtige Recherche-Tool für embryonalen und adulten hämatopoetischen Studien geworden. Zebrafisch sind genetische Analyse zugänglicher und die phylogenetisch niedrigsten vertebrate Modell-Arten, die eine ähnliche Gefäßsystem und blutbildenden Systems auf den Menschen haben. Zebrafisch-Embryonen entwickeln ex Utero, und innerhalb von 48 Stunden Post Düngung (hpf) HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebrafisch sind auch äußerst fruchtbar, mit Weibchen legen über 100 Eiern in einer einzigen Kupplung, so dass für große Stichproben und experimentelle Replikation. Zebrafisch-Embryonen sind optisch transparent, zulassend mikroskopische Visualisierung des blutbildenden Systems. Mehreren fluoreszierenden transgenen Linien Zebrafisch Kennzeichnung HSCs wie runx1: EGFP Fisch9, cd41: EGFP Fisch10, und Kdrl:mCherry; Cmyb: GFP3 Doppel-positiven Tieren ermöglichen live, in Echtzeit-Visualisierung von HSC Entstehung und Expansion in Vivo3,4,7,8, 9. Der Zebrabärbling schnell Zeit und Entwicklung ex Utero führte zu seiner Verwendung in Mutagenese Studien11,12,13,14,15 und Droge Screening von16,17,18,19,20 für Verbindungen, die therapeutische Versprechung für Erkrankungen des menschlichen Blutes halten. Insgesamt hat Erhaltung des blutbildenden Systems, das Vorhandensein und die einfache Entwicklung von transgenen Linien und schnelle Regenerationszeit der Zebrabärbling ein billig, schnell, flexibel und ideal Modell für hämatopoetische Studien gemacht.

Zahlreiche Methoden der Isolierung und Testen von HSZ wurden in Säugetieren blutbildenden Systeme entwickelt. Ermittler nutzen eine Kombination aus Oberfläche Zellrezeptoren Markus HSCs21,22,23,24, als auch die Fähigkeit der HSCs Efflux Farbstoff25,26zu nutzen. Nachdem diese gekennzeichnet sind, kann Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) ihre räumliche Trennung. Was beweist, dass eine Zelle eine HSC erfordert Bestrahlung ein Wirtstier endogene HSPCs, vermeintliche HSCs Umpflanzen, und beobachten langfristige, Multi-Linie Wiederherstellung aller Blut Zelltypen Reifen zu zerstören. Diese Tests funktionieren gut in Mäusen, da gibt es zahlreiche Zelloberfläche Antikörper gegen hämatopoetischen Zellen und Inzucht Mausstämme, die immun-Abstimmung für die Transplantation erleichtern. Jedoch wurden einige Zebrafisch hämatopoetischen Zelloberfläche Antikörper generierten27, behindern die Identifizierung und Isolierung von HSZ. Die gängigste Methode zum Markieren und Isolieren von Zebrafisch HSCs ist mit transgenen Tieren, wobei ein zellspezifische Promotorsequenz eine fluoreszierende Protein-Expression treibt. Studien haben visualisiert und HSCs in der ventralen Wand der dorsalen Aorta mit Mikroskopie nutzt diese Technik3,4,8,9aufgelistet. Anderen Labors klonaler Stämme von Zebrafisch28,29 generiert haben und im MHC abgestimmt Tiere30erfolgreichen Transplantationen durchgeführt haben. Jedoch diese Techniken sind kostspielig zu vielen Laboratorien sind technisch schwierig und zeitaufwendig sind. Um diese Probleme anzugehen, haben Labors generiert mehrere in-vitro- Tests, um die Präsenz, die Verbreitung Tarife und die Kapazität der Differenzierung der HSPCs31,32,33zu testen, 34,35,36. Diese Tests zeigen, Proliferation und Differenzierung von HSPCs in-vitro-31,32,33,34,35,36, die Rettung von hämatopoetischen Mängel36, und eine effiziente Methode zum entdecken und testen Zytokine33,34,35. Sie wurden auch genutzt, um für HSPC Biologie31,32verantwortlichen Gene zu identifizieren. In dieser Studie nehmen wir diese Tests einen Schritt weiter und erlaubt die Quantifizierung von HSPCs einer sich entwickelnden Zebrafish Embryos. Diese Tests können auch genutzt werden, um die Anzahl der HSPCs im mutierten Tieren quantitate und Tiere mit hämatopoetischen störende Medikamente behandelt. Im Wesentlichen diese Assays sind schnell, vorhanden einige technische Herausforderungen, und kostengünstige Möglichkeiten, um quantitate HSPC zahlen, prüfen ihre Verbreitung und Blöcke in Abgrenzung zu untersuchen.

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Protocol

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Die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) Beirat an der California State University, Chico, genehmigt alle unten beschriebene Methoden.

1. Bleach 48 hpf Zebrafish Embryos

  1. Mit 15 cm (w) 15 cm (l) x 7 cm (h) Kunststoffbehälter erstellen 3 Waschstationen: 1) mit 1 mL 5 % Bleichmittel in 1000 mL Embryo Medium (E3; siehe Tabelle 1), (2) mit sterilen E3 und (3) mit sterilen E3. Sicherstellen Sie, dass jeder Container 500 mL der Lösung hat um die Embryonen zu versenken.
    Hinweis: Für jede Bedingung getestet, werden mindestens 10 Embryonen erforderlich sein. Dieser Waschvorgang bietet Platz für bis zu 200 Embryonen.
  2. Mit einer Transferpipette Embryonen in ein Teesieb und Tauchen Sie Eiern in Waschstation #1 für 5 min. Teesieb (mit Embryonen in) zu entfernen und legen Sie in Waschstation #2 für 5 min; Wiederholen Sie für Waschstation #3 für die letzten 5 Minuten.
  3. Nach dem letzten Waschen spülen Embryonen aus Teesieb durch eine saubere 10 cm Petrischale Kopf umdrehen und sanft spülen Embryonen Teesieb mit sterilen E3 und eine Transferpipette ausschalten.

2. Dechorionate Embryonen

  1. Entfernen Sie mit einer Transferpipette und entsorgen Sie soviel E3 wie möglich aus der Petrischale und 500 μL Dechorionation Protease (10 mg/mL) in Embryonen. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. sanft tippen Sie auf der Seite der Petrischale Chorions vollständig zu entfernen.
  2. Zugeben Sie mit einer serologischen Pipette 20 mL sterile E3 Protease verdünnen. Können Sie Embryonen zu begleichen, und entfernen Sie die E3 mit einer Transferpipette. Wiederholen Sie diese Waschschritt 3 Mal, um alle Spuren der Dechorionation Protease entfernen.

(3) Probenvorbereitung Embryo

  1. Mit einer Pipette P1000, legen Sie 10 Embryonen zu einem einzigen sterile 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
  2. E3 mit einer Pipette entfernen und entsorgen.
    Achtung: Pipette mit Sorgfalt wie Embryonen können leicht verschoben und während der folgenden Schritte waschen verworfen.

(4) vorbereiten Dissoziation Embryonen

  1. Proben in Laminar-Flow-Haube und waschen Embryonen durch Zugabe von 1 mL sterile E3. Lassen Sie Embryonen auf Grund des Schlauches zu begleichen und überstand mit einer Pipette P1000 entfernen. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen.
  2. Nach dem letzten Waschen E3 entfernen und entsorgen. Fügen Sie 1 mL 10 mM Dithiothreitol (DTT) in E3, die Schleim-Beschichtung (und Sporen, Hefe oder Bakterien, die in ihm aufgefangen werden können) rund um die embryonale Zebrafisch zu entfernen. Microcentrifuge Schlauch horizontal legen und bei Raumtemperatur in Laminar-Flow-Haube für 25 min inkubieren.

5. Embryo Dissoziation

  1. Waschen Sie Probe mit 1 mL sterile DPBS (mit Ca2 + und Mg2 +) 3 Mal. Nach dem letzten Waschen 500 μL des DPBS (mit Ca2 + und Mg2 +) dazugeben Sie und 5 μL von 5 mg/mL (26 U/mL) Dissoziation Protease.
    Achtung: Dieses Enzym braucht Ca2 + und Mg2 +, also sicherstellen, dass die DPBS diese Ionen enthält.
  2. Proben bei 37 ° C auf eine horizontale Orbitalschüttler mit 180 u/min für 60 min. Ort Proben in der Laminar-Flow-Haube brüten und genannte Embryonen mit einem P1000 bis Proben vollständig dissoziiert sind.
    Achtung: Prüfen Sie Embryonen in regelmäßigen Abständen zu bestimmen, wenn sie getrennt werden. Die Embryo-Lösung sollte eine gewisse Menge des Gewebes vorhanden haben; Es sollte nicht völlig homogen sein. Es ist möglich, zu verdauen, die die HSPCs zerstören werden (siehe ergänzende Abbildung1).

6. Vorbereitung der dissoziierten Embryonen

  1. Pipette 10 dissoziiert Embryonen auf dem oberen Reservoir von 5 mL Polystyrol runden Unterrohr mit einem 35 μm Zelle Sieb Cap.
  2. Mit einer Pipette gefiltert spülen die Petri-Röhre mit sterilen PBS (mit Ca2 + weder Mg2 +) und Transferlösung 5 mL Polystyrol Rohr mit Zellen aus Schritt 6.1. Wiederholen Sie bis 4 mL der Flüssigkeit in der 5 mL Polystyrol Tube vorhanden ist.
    Hinweis: PBS, DPBS oder andere isotonischen gepufferten Lösungen können in diesem Stadium verwendet werden, solange sie nicht, Ca2 + oder Mg2 enthalten +
  3. Zentrifugieren Sie Rohre bei 4 ° C und 300 X g für 5 min um die homogenisierte Zellprobe pellet. Entfernen Sie mit einer Pipette und entsorgen Sie überstand aus dem Rundboden Röhrchen. Achten Sie darauf, um die Zellen, die oelletiert an der Unterseite des Rohres nicht zu stören. Die Zellen in 100 μl PBS aufzuwirbeln.

7. Vorbereitung der Methylcellulose

  1. 1 x komplette Methylcellulose (Tabelle 1) Stammlösung zu generieren und sterile Rundboden 14 mL Röhrchen mit 3 mL Spritzen und Nadeln, 16 G 2,5 mL hinzufügen. Verwenden Sie eine Röhre für jede Bedingung getestet.
  2. Fügen Sie Zytokine, kleine Moleküle oder andere Agenten für jede Probe untersucht werden.
    1. Myeloische Differenzierung fügen Sie 1 % Carp Serum und 0,3 mg/mL rekombinanter Zebrafisch Granulozyten Kolonie stimulierende Faktor (Gcsf)34 , Methylcellulose Medium hinzu. Siehe Svoboda Et al. 37 für vollständige Beschreibung wie man Karpfen Serum und rekombinanten Zytokine zu generieren.
    2. Fügen Sie 1 % Carp Serum und 0,1 mg/mL rekombinanter Zebrafisch Erythropoetin (Epo)38 erythroiden Differenzierung hinzu Methylcellulose Medium.
    3. Um multilineage Vorfahren zu untersuchen, fügen Sie EPA und Gcsf hinzu.
      Achtung: Zytokine und Zusatzstoffe sollten nicht mehr als 10 % des Gesamtvolumens, total, denn das Medium nicht zäh genug, einzelne Kolonien zu erkennen.

8. Ergänzung der dissoziierten Embryonen zu Methylcellulose

  1. Fügen Sie mithilfe einer Pipette 100 μL der dissoziierten 10 Embryonen auf die Oberfläche des vorbereiteten Methylcellulose mit rekombinanten Zytokine und Karpfen Serum. Kappe Deckel und Wirbel sanft zur Probe vollständig zu homogenisieren. Jedes Rohr sollte nun die dissoziierte Gewebe 10 Embryonen enthalten.
  2. Verwendung von 3 mL Spritzen und 16 G Nadeln, aliquoten 1 mL der Probe in 2 separaten 35 mm Petrischalen. Stellen Sie sicher, dass die Probe in der Petrischale vollständig dispergiert ist. Wiederholen Sie für jede Probe.
  3. Methylcellulose entgegenbringen Sie 35 mm Petrischalen mit Zellen in einem 15 cm Petrischale. Jedes Gericht 15 cm Hinzufügen einer 35 mm-Petri-Platte mit 5 mL sterilem Wasser befeuchten die Proben. 7-10 Tage bei 32 ° C und 5 % CO2 inkubieren.

9. die Visualisierung von HSPC-abgeleitete Koloniebildenden Einheiten (KBE)

  1. Legen Sie nach 7 Tagen Inkubation, Proben auf einem inversen Mikroskop bei 40-100 X für Visualisierung und Enumeration. An dieser Stelle können einzelnen Kolonien isoliert mit einer Pipette und Färbung und/oder gen-Analyse unterzogen werden.

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Representative Results

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HSPC Zahlen im embryonalen Zebrafisch zu bewerten, wurden 48 hpf Embryonen verdaut, in Methylcellulose mit exogenen hämatopoetischen unterstützend Wachstumsfaktoren überzogen und für 7 Tage (Abb. 1A) inkubiert. Nach 7 Tagen waren Kolonie bildende Einheiten (KBE) aufgezählten (Abbildung 1B) und Image (Abbildung 1C). Durch die Steuerung der verschiedenen Zytokinen hinzugefügt, kann man die Arten der Kolonien produziert steuern: Epo ist notwendig für die erythroiden Differenzierung und Gcsf für myeloische Differenzierung erforderlich ist. Karpfen-Serum ist analog zu fetalen Rinderserum Verwendung in Säugetieren Gewebekultur; Es ist eine Quelle des allgemeinen Wachstumsfaktoren. In Abbildung 1wurden Epo, Gcsf und Karpfen Serum hinzugefügt, so dass die Aufzählung der erythroiden, myeloischen und gemischte Erythromyeloid Kolonien. Diese Kolonien können aufgrund ihrer Form und Farbe unterscheiden; die erythroiden Kolonien sind eng, klein, kompakt und haben eine rote Farbe durch Hemoglobinization. Die myeloischen Kolonien sind größer und haben mehr bewegliche Zellen an ihren Rändern, indem Sie ihnen ein zerzaust aussehen.

Erfolgreiche Beschichtung von embryonalen Zebrafisch behandelt mit HSPC-unterstützende Faktoren KBE nach 7-10 Tagen Inkubationszeit erbringt. Wichtig ist, die Menge der KBE korreliert direkt mit der Anzahl der Embryonen beschichtet (Abbildung 1B). Plattieren entweder 4 oder 8 Embryonen pro mL (die korreliert, beginnend mit 10 oder 20 Embryonen zu Beginn des Experiments) ergibt ca. 1.200 oder 2.400 KBE, beziehungsweise. Unser Protokoll schlägt mit 10 Embryonen, da es ist schwierig und zeitaufwendig, 2.400 KBE zu zählen, wenn eine größere Experiment durchführen. Aufgrund der Methodik der ganze Embryonen zu verdauen Diverses Trümmer in der Methylcellulose vorhanden ist, aber kann leicht vom eigentlichen Kolonien mit stärkerer Vergrößerung unter dem Mikroskop erkannt werden. Andere Zelltrümmer kann auch vorhanden sein, aber die einzige KBE vorhanden werden durch die Zugabe von HSPC-unterstützende Zytokinen HSPC abgeleitet. Wenn KBE kleine und nicht leicht zu sehen sind, können die Kulturen bis auf 10 Tage zu mehr Wachstum zu fördern inkubiert werden. Erhöhte Inkubation wird jedoch nicht mehr KBE Ausbeute; Wenn KBE nicht vorhanden sind, bedeutet dies einen Verlust von Zytokin-Aktivität, über Verdauung von Embryonen (und anschließende Vernichtung von HSPCs; siehe ergänzende Abbildung1), oder unsachgemäße Beschichtung der Proben. Es ist immer wichtig, geeignete Kontrollen ausführen jedes Mal, wenn dieses Experiment durchgeführt, um sicherzustellen, dass geringfügige Abweichungen in Technik falsche Unterschiede in HSPC-Enumeration nicht nachgeben. Beispielsweise sollte ein Experiment durchgeführt, um die Anzahl der HSPCs im Morphant Embryonen zu analysieren, eine Probe mit normalen Geschwistern neben vorbereitet werden. Wenn ein Experiment durchgeführt, um die Wirkung eines Medikaments auf die Entwicklung von HSPCs zu vergleichen, eine Probe mit unbehandelten Geschwister vorbereitet und neben analysiert werden sollte.

Figure 1
Abbildung 1: Auflisten von HSPC-abgeleitete KBE von 48 hpf Zebrafish Embryos. (A) schematische Übersicht der Embryo-Beschichtung auf Methylcellulose mit HSPC-unterstützende Zytokine für Generation von hämatopoetischen KBE. 48 hpf Zebrafisch-Embryonen wurden getrennt und vernickelt auf 1 % komplette Methylcellulose mit Erythropoetin (Epo), Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (Gcsf) und Karpfen Serum, so dass Erythromyeloid Differenzierung. (B) Aufzählung der Koloniebildenden Einheiten (KBE) aus Proben, die bei Konzentrationen von 4 oder 8 Embryonen pro mL (beginnend das Experiment mit 10 oder 20 Embryonen bzw.) überzogen. Aufzählung wurde bei 100 X auf einem inversen Mikroskop durchgeführt. Balken zeigen durchschnittliche Zahl von KBE und Fehlerbalken zeigen Standardabweichung. (C) Kolonie Morphologie Vertreter der Embryo-Beschichtung auf Methylcellulose. Die Kolonie Morphologie gibt die Typen von Zellen, aus die die Kolonie besteht; Bilder sind repräsentative erythroiden und myeloischer Kolonien. KBE bei 400 X fotografiert. Skalieren von Balken = 50 μm.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Supplemental Figure 1
Ergänzende Abbildung1: Verdauung von Embryonen mit Dissoziation Protease. (A) Bilder von 10 Embryonen vor der Verdauung (links; unverdaut), nach angemessenen Verdauung (mittlere; verdaulich), und nach der überschüssigen Verdauung (rechts; über verdaut). (B) Zoomed in Bildern (7,3 X) verdaut und über verdaute Schläuche in (A). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Der Zebrafisch-Modell-System ist eine effiziente, effektive und kostengünstige Modell für das Studium primitiv und definitive vertebrate Hämatopoese geworden. Generation von Assays, die sind schnell, preiswert, und einigen technische Schwierigkeiten kann zum Testen kleiner Moleküle, mutierte Embryonen zu analysieren und molekulare Signalwege wichtig für HSPC Biologie Aufklärung genutzt werden. In-vitro- Beschichtung der HSPCs von Erwachsenen Zebrafisch ist eine wirksame Methode, Mutagenese, Zytokine und hämatopoetischen Defekte zu studieren. Dieses Protokoll baut auf diesen Studien, sondern nutzt embryonalen Zebrafisch. Anwendung dieser Tests auf embryonale Zebrafisch ermöglicht eine schnellere Datenerfassung, die Verwendung von weniger physischen Raum, die Verwendung von weniger Drogen (für Drogen-Bildschirme), und ermöglicht Tests mRNA Überexpression und/oder (MO) Morpholino Knockdown von bestimmten genetischen Wege. Wichtig ist, erlaubt es auch die Studie der Stadien der Blutbildung, die nur während der frühen vertebrate Entwicklung auftreten.

Aufgrund der Flexibilität des Assays kann es leicht geändert werden, um die vielen unterschiedlichen Bedürfnisse zu erfüllen. Eine Änderung dieses Protokolls ist die Modulation von Entwicklungsstörungen Timing; ändern das Alter der Embryonen eingesetzt ermöglicht die Quantifizierung der HSPC Generation im Laufe der Zeit. Diese können auch das Studium der unterschiedliche Teilmengen von HSPCs wie Erythromyeloid Stammväter6, die vor 36 entstehen hpf versus Bona Fide HSCs3,4,5,8, die sich ergeben danach. Niemand wurde noch in der Lage, zu isolieren und identifizieren eingeschränktere Zebrafisch HSPC Teilmengen im sich entwickelnden Embryo, aber diese Tests ermöglichen diese Experimente. Es ist wichtig, dass beim Wechsel der Entwicklungsstadien der Tiere, auch die Anzahl der Zellen in der Methylcellulose hinzugefügt optimiert wird; zu wenige Tiere erbringt keine Kolonien, während auch viele werden eine unzählige Platte HSPC Kolonien zu schaffen. Hinzufügen von verschiedenen Zytokinen ist eine weitere Modifikation, die spezifischen Experimente angepasst werden kann. Hinzufügen von EPA erlaubt die Quantifizierung der erythroiden Kolonien, während Gcsf Enumeration der myeloischen Kolonien ermöglichen wird. Hinzufügen von beiden dieser Zytokine wird Multi-Linie KBE Generation ermöglichen. Wichtig ist, erlauben diese Assays, Prüfung von vermeintlichen Zytokine und ihre Wirkung auf HSPC Proliferation und Differenzierung. Diese Tests können auch geändert werden, um groß angelegte Drogentests durchführen; Embryonen können ausgesetzt werden, unterschiedliche Konzentrationen von Verbindungen zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung zu sehen, ob die Chemikalien eine positive oder negative Auswirkungen auf die Blut-Produktion haben. Eine abschließende Weise, dass diese Experimente geändert werden können ist, dass Embryonen injiziert werden können im 1-Zell-Stadium mit spezifischen mRNA oder MOs, die overexpress werden oder Knockdown spezifischer Gene bzw.. Nach Entwicklung für 24-48 h, können diese Embryonen unterzogen werden, um diese Tests zu bestimmen, ob der Gewinn - und Verlust-der-Funktion bestimmter Gene spielen eine wesentliche Rolle in Bildung, Proliferation und Differenzierung von HSPC. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Nutzung transgener Sorten Zebrafisch in der Geschwindigkeit und Einfachheit der Erhebung und Interpretation von Daten helfen werden. Zum Beispiel wenn man in erythroiden Entwicklung interessiert ist, ist es einfach diese Experimente in gata1durchzuführen: DsRed Embryonen40, die der Projektträger des erythroiden-spezifischen transgenen Gata1 Transkriptionsfaktors DsRed fahren Fluoreszenz. Auf diese Weise, bei der Analyse der erythroiden Kolonien kann Fluoreszenzmikroskopie genutzt werden. Ebenso können diese Studien an Tieren mit anwesend, um gleichzeitig mehrere Zelle Linien suchen mehrere transgene erfolgen. Diese Technik wäre nützlich zur Identifikation von multilineage HSPCs; Obwohl erythroiden und myeloischer Kolonien durch Morphologie leicht unterscheidbar sind, ist es schwierig, die Kolonien zu identifizieren, die bipotentialen Vorfahren enthalten, ohne die Anwesenheit von mehreren Abstammung-spezifische Transgene Ausdruck in der gleichen Kolonie zu visualisieren .

Obwohl diese Tests viele Vorteile haben, ist es wichtig, um angemessene Kontrollen einzurichten, jedes Mal, wenn diese Experimente durchgeführt werden; geringfügige Abweichungen in der Technik könnten die Ergebnisse und Interpretationen der Ergebnisse ändern. Beispielsweise ist es möglich, unterschiedliche Anzahl von HSPCs zu bekommen, wenn Sie die Experimente an verschiedenen Tagen durchführen, wenn Ihre Technik nicht präzise; um diese Möglichkeit zu bewältigen, sollte man stets eine entsprechende Ansteuerung beinhalten. Wenn ein Experiment durchgeführt wird, um zu testen, welche Auswirkungen ein MO auf die Entwicklung, dann Embryonen (entweder uninjected oder mit einer Steuerung MO injiziert), die aus dem gleichen Gelege sind zu kontrollieren sollte neben der experimentellen Probe auch verarbeitet werden. Wenn das Experiment entworfen, um die Wirkung eines bestimmten Medikaments zu testen, dann sollte unbehandelte Proben als ein Steuerelement enthalten. Schließlich, wenn Auswirkungen auf die Entwicklung von spezifischen Cytokine testen, dann Tiere von der gleichen Kupplung sollte auch werden verarbeitet und zur gleichen Zeit ohne das Zytokin hinzugefügt, um die Kultur untersucht.

Während dieser in-vitro- Test einfach ist durchzuführen und die Ergebnisse einfach sind zu interpretieren, können einige potenzielle Probleme während des Verfahrens entstehen. Wenn keine Kolonien nach 7 Tagen in der Kultur gesehen werden, gibt es mehrere Probleme, die auftreten können. Prüfen Sie zunächst, um sicherzustellen, dass die Zytokine rein und bei entsprechenden Konzentrationen sind; Je nachdem, wie die Zytokine produziert worden sind können Konzentrationen verändern und optimieren ihre Tätigkeit sein. Ein weiteres Problem, das häufig entsteht ist die Embryonen zu verdauen die zerstört die HSPCs; bei der Verdauung Schritt kümmern Sie, und ändern Sie das Timing zu, wenn keine Kolonien immer wieder gesehen werden. Schließlich könnte die Vermischung von Methylcellulose und Zugabe von Karpfen Serum die Frage sein, so stellen Sie sicher, dass alle Zutaten hinzugefügt und richtig gemischt wurden. Neben den technischen Fragen ist es wichtig zu erkennen, dass die Kolonien mehr unter bestimmten Umständen entwickeln müssen; nach weiteren 3 Tagen in Kultur sind oft kleine Kolonien viel besser sichtbar. Gehen vorbei an 10 Tagen wird nicht empfohlen, da die Methylcellulose beginnt kurz danach austrocknen. Ein weiteres häufiges Problem ist, dass manchmal Kolonien neigen dazu, an den Rändern der 35 mm Petrischalen sammeln; Scannen die Platten gründlich, besonders an den Rändern ist unerlässlich. Auch ist es wichtig zu bedenken, dass diese Kolonien in einem dicken, zähflüssigen Material entwickeln; Wenn mit Schwerpunkt in der Mikroskopie, stellen Sie den Fokus auf und ab, etwas anders zu beobachten werden Flugzeuge-die Kolonien nicht am unteren Rand die Plastikschalen sitzen.

Diese in-vitro- Tests haben viele Vorteile, aber sie haben auch ein paar Einschränkungen. Das größte Problem ist, dass diese Tests nicht endgültig beweist, dass ein Stammvater einer HSC-ist das nur durch langfristige Wiederherstellung der bestrahlten Tieren nachgewiesen werden kann. Darüber hinaus wurden nicht alle Zytokine definiert und untersucht im Zebrafisch noch, was die Typen von HSPCs begrenzt, die untersucht werden können. Zum Beispiel haben keine Zebrafish lymphatischen unterstützende Zytokine, identifiziert werden B und T-Zell-Produktion in diesen Tests zu verhindern. Darüber hinaus ist es unklar, wenn multipotenten HSPCs zu züchten, wenn die Zugabe bestimmter Arten (oder Beträge) von bestimmten Zytokinen die Differenzierung nach unten bestimmte hämatopoetischen Wege verzerren kann. Ein weiterer möglicher Nachteil ist, dass dieser Assay effektiv erkennen kann, ob HSPCs tatsächlich in einer Probe vorhanden sind, aber aus irgendeinem Grund nicht in der Lage zu differenzieren sind (oder sind sonst nicht lebensfähig). Wie bei den meisten in-vitro- Tests, sollten weitere Experimente immer durchgeführt, um die Ergebnisse zu validieren. Abgesehen von diesen Fragen kann viele Informationen aus dieser klonalen Assays entnommen werden.

Diese Tests sind signifikant, da sie schnelle und effiziente Screening von hämatopoetischen Mängel ermöglichen. Forscher können bestimmte genetische Wege mit MOs niederzuschlagen, und Platte verdaut Tiere zu sehen, ob das Gen eine Rolle bei der Blutbildung spielt. Darüber hinaus kann die mutierte Fische (zuvor generierten oder neu generiert in Mutagenese Bildschirme) schnell und einfach beurteilt werden. Diese Tests ermöglichen auch effiziente Medikament Screening-Assays auf live, ganze Organismen, die Modulation des HSPC Biologie gleichzeitig in der Lage zu beobachten, wenn die Medikamente einen negativen Effekt auf die Entwicklung oder das Überleben haben zu identifizieren. Diese Tests können auch Quantifizierung von HSPCs in der entwickelnden Zebrafisches an verschiedenen Zeitpunkten. Während mehrere Studien versucht haben, HSC zahlen Erwachsene7,27,30,41 und embryonalen Zebrafisch3,4,42, quantitate 43, keine Studien haben unterschiedlichen Mengen an Linie beschränkt HSPCs im Zebrafisch quantitated. Darüber hinaus können diese Tests genutzt werden, um zu untersuchen und zu modulieren, molekulare Signalwege wichtig für Blutbildung und Differenzierung, ein Prozess, der rätselhaft bleibt.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wurde gefördert durch die National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1, D.L.S.), der California State University Program für Bildung und Forschung in der Biotechnologie (CSUPERB: molekulare Kontrolle der Vertebrate hämatopoetischen Nische, D.L.S.) und vom Büro Graduate Studies in California State University Chico (zu A.C.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM StemCell Technologies  9300
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ Life Technologies 14080-055
HyClone PBS (1x) GE Healthcare Life Sciences sh30256.01
 DMEM 500 mL Corning CellGrow 10-017-CV
 Ham's F12 500 mL Corning CellGrow 10-080-CV
FBS 500 mL Gemini Bio-Products 100-108
HEPES 100 mL (1 M) Gibco life technologies 15-630-080
Penicillin/streptomycin (5000 U/mL
and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)
Corning Mediatech 30-009-CI
Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) Corning Mediatech 30-005-CR
1.5 mL MCF tube FisherBrand 05-408-129
3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock BD Safety Glide 305905
5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap Corning Falcon 352235
Methocel MC Sigma-Aldrich 64630
14 mL Polystyrene round bottom tube Corning Falcon 352057
10 mm polystyrene easygrip Petri dish Corning Falcon 351008
Librease TM Roche Sigma-Aldrich 5401119001 dissociation protease
Pronase Roche Sigma-Aldrich 11459643001 dechorionation protease
15 cm Petri dish Corning Falcon 351058
AB Zebrafish International Resource Center (ZIRC) ZL1 zebrafish strain used
Dithiolthreitol (DTT) Sigma-Aldrich 646563

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  5. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
  6. Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
  7. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
  8. Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
  9. Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
  10. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
  11. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  12. Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
  13. Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
  14. Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
  15. Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
  16. Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
  17. Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
  18. Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
  19. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
  20. Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
  21. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  22. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
  23. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
  24. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
  25. Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
  27. Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
  28. Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
  29. Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
  30. de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
  31. Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
  32. Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
  33. Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
  34. Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
  35. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
  36. Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
  37. Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
  38. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
  39. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
  40. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
  41. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
  42. Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
  43. Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
Entwicklung eines <em>In-vitro-</em> Assay, hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen Quantitate Zellen (HSPCs) bei der Entwicklung von Zebrafish Embryos
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Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).More

Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).

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