Summary
כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה כדי quantitate hematopoietic גזע קדמון תאים (HSPCs) בדג זברה עובריים. HSPCs של דג זברה חלופה מועדפת הינם מצופה ב- methylcellulose עם גורמים תומכת, המבדילים לדם בוגרת. פעולה זו מאפשרת הגילוי של דם פגמים ומאפשר סמים הקרנת להתנהל בקלות.
Abstract
Hematopoiesis הוא תהליך הסלולר חיוני שבו תאי גזע וקדמון hematopoietic (HSPCs) להבדיל לתוך ריבוי של שושלות תאים שונים המרכיבים את דם בוגרים. בידוד וזיהוי של אלה HSPCs היא קשה כי הם מוגדרים לשעבר פוסט פקטו; הם רק יכולה להיות מוגדרת לאחר בידול שלהם לתוך שושלות תאים מסוים. במהלך העשורים האחרונים, הפך דג זברה (רזבורה rerio) אורגניזם מודל ללמוד hematopoiesis. דג זברה עוברי להתפתח לשעבר עם רחם, וכי על ידי 48 שעות לאחר ההפריה (hpf) יצרו סופית HSPCs. מבחני להעריך בידול HSPC, פותחו יכולות הפצה, ניצול השתלת ובעקבות שיחזור של מערכת hematopoietic בנוסף להמחיש קווים הטרנסגניים מיוחדים עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. עם זאת, מבחני אלה הם העלות אוסרני טכנית וקשה, זמן רב עבור מעבדות רבות. פיתוח מודל במבחנה כדי להעריך HSPCs יהיה העלות האפקטיבית, מהיר, ותיאר נוכח קשיים פחות בהשוואה בעבר שיטות, ומאפשר מעבדות להעריך במהירות מסכי התרופות, מוטגנזה מכוונת להשפיע על ביולוגיה HSPC. זה רומן במבחנה הנועד להעריך HSPCs מתבצע על ידי ציפוי הפומבית דג זברה כל העוברים, הוספת גורמים אקסוגניים לקדם רק HSPC בידול והתפשטות. עוברי הפומבית לתוך תאים בודדים, מצופה HSPC-תומכת גורם ממריץ שגורמים להם לייצר המושבה ויוצרים יחידות (CFUs) הנובעות תאים ובתאים יחיד. מבחני האלה צריך לאפשר בחינה זהירה יותר של מסלולים מולקולריים האחראי על התפשטות HSPC, בידול, התקנה, אשר יאפשר לחוקרים להבין את. הפסיכולוגי של חוליות hematopoiesis ואת dysregulation שלה במהלך המחלה.
Introduction
Hematopoiesis היא התהליך של ביצוע ריבוי של תאי דם בוגר נדרש להישרדות של אורגניזם. זה תהליך התפתחותי מפתח המערבת את הבידול של תאי גזע hematopoietic (HSCs) במגוון רחב של סוגי תאים מוגבלת מבחינת המרכיבים דם בוגרים. אלה HSCs עצמית לחדש, כך המערכת לעולם אינו הם חייבים להתמיד של התפתחות עוברית מוקדמת עד מותו. גולגולת, בידול קבוע והתפשטות של תאי גזע וקדמון hematopoietic (HSPCs) יש צורך לחדש בצורה הולמת את רוב תאי דם הם שלאחר mitotic להיות ממוחזרים בכל יום. HSCs יצירת תאי דם בוגרים על-ידי המבדילים הראשון לערכות משנה של ובתאים מוגבלת; נפוץ אבות הלימפה (CLPs)1, אשר בסופו של דבר לייצר תאי T, B, ו- NK, ונפוץ מיאלואידית אבות (CMPs)2 היוצרים גרנולוציטים, אריתרוציטים, מקרופאגים, megakaryocytes. אבות אלה מחויבים יצירת שושלות תאים מסוים, להבדיל עוד יותר לתוך יותר ובתאים מוגבלת מבחינת כגון erythroid מיאלואידית אבות (פיגל) היוצרים אריתרוציטים, טסיות דם, או גרנולוציט אבות מקרופאג (Gmp) היוצרים בזופילים, אאוזינופילים, נויטרופילים ומקרופגים2. זיהוי ובידוד אבות אלה מאפשר זיהוי מסלולים מולקולריים חשוב מעורב בידול hematopoietic, מחלות hematopoietic רבות כגון לוקמיה מתעוררות כאשר אלה ובתאים להיכשל כראוי להבדיל.
במהלך העשורים האחרונים, מערכת מודל דג זברה (רזבורה rerio) הפך כלי מחקר מפתח עבור מחקרים hematopoietic עובריים למבוגרים. דג זברה נתונות ניתוח גנטי והם מינים דגם חוליות phylogenetically הנמוך ביותר שיש להערכת דומים ומערכת hematopoietic לבני אדם. דג זברה עוברי לפתח לשעבר עם רחם, וצור בתוך 48 שעות שלאחר ההפריה (hpf) HSPCs3,4,5,6,7,8. דג זברה גם הם הפוריה ביותר, עם הנקבות שוכב מעל 100 ביצים מצמד בודד, מתן אפשרות עבור מדגמים גדולים ושכפול ניסיוני. דג זברה העוברים הם שטיחות שקוף, המאפשר ויזואליזציה מיקרוסקופיים של מערכת hematopoietic. מספר שורות הטרנסגניים פלורסנט דג זברה סימון HSCs כגון runx1: EGFP דגים9, cd41: EGFP דגים10, ו- kdrl:mCherry; cmyb: בעלי חיים GFP3 כפול-חיובית, לאפשר להמחשת בשידור חי, בזמן אמת של מועדון הכדורגל מונפלייה הופעתה והתרחבות ויוו3,4,7,8, 9. של דג זברה דור מהיר זמן ופיתוח לשעבר עם רחם הוביל השימוש בו מוטגנזה מכוונת מחקרים11,12,13,14,15 וסמים הקרנת16,17,18,19,20 שאמורות להחזיק ההבטחה טיפולית בהפרעות דם אנושי. בסך הכל, שימור המערכת hematopoietic, הנוכחות ואת פיתוח קלה של קווים מהונדס, וזמן התחדשות מהירה הפך דג זברה מודל זול, מהיר, גמיש, אידיאלי עבור מחקרים hematopoietic.
פותחו שיטות רבות של בידוד ובדיקה HSCs בתרבית של מערכות hematopoietic. חוקרים יכולים לנצל שילוב של קולטני התא השטח כדי לסמן HSCs21,22,23,24, כמו גם לנצל את היכולת של HSCs בזרימת לצבוע25,26. אחרי, הם מסומנים תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) מאפשר הפרדה פיזית שלהם. להוכיח כי תא HSC מחייב בין חיה המארח כדי להרוס את HSPCs אנדוגני, משתילים בשם HSCs, והתבוננות ארוכת טווח, שושלת היוחסין מרובה שיחזור של כל בוגר סוגי תאים בדם. מבחני אלה פועלות היטב עכברים, שכן ישנם רבים תא-פני נוגדנים נגד תאים hematopoietic וללחצים העכבר המפגרים המאפשרים התאמת המערכת החיסונית עבור השתלת. עם זאת, כמה דג זברה hematopoietic תא-פני נוגדנים כבר שנוצר27, הפרעה של זיהוי ובידוד של HSCs. הדרך הנפוצה ביותר כדי לסמן ולבודד דג זברה HSCs היא עם בעלי חיים מהונדס, לפיה רצף ספציפי תא יזם נוהג הביטוי של החלבון הניאון. מחקרים דמיינו, לספור HSCs בקיר הגחון של אבי העורקים הגבי עם מיקרוסקופ ניצול זו טכניקת3,4,8,9. מעבדות אחרות יצרו זנים המשובטים של דג זברה28,29 , אמורה לבצע השתלה מוצלחת ב- MHC-מתאימים לבעלי חיים30. עם זאת, שיטות אלה העלות אוסרני מעבדות רבות, מבחינה טכנית קשה, הם לארוך זמן רב. כדי לטפל בבעיות אלה, מעבדות יצרו מספר במבחנה מבחני לבדיקת הנוכחות, שיעור התפשטות, והיכולת בידול של HSPCs31,32,33, 35, 34,36. מבחני אלה להראות התפשטות ובידול של HSPCs במבחנה31,32,33,34,35,36, חילוץ פגמים hematopoietic36, שיטה יעילה לגילוי ולבדיקה ציטוקינים33,34,35. הם כבר נעזרו גם לזהות את הגנים אחראית HSPC-ביולוגיה-31,-32. במחקר זה, ניקח את אלה מבחני צעד נוסף, המאפשר כימות של HSPCs של העובר מתפתח דג זברה. מבחני אלה גם יכול להיות מנוצל כדי quantitate את המספר של HSPCs חיות, בעלי חיים שמטופלים בתרופות hematopoietic משובש. בעיקרו של דבר, אלה מבחני מהר, נוכח האתגרים הטכניים אחדים הינם דרכים זולות quantitate מספרי HSPC, לבדוק את ההפצה שלהם, ולחקור בלוקים בידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) חבר הוועדה המייעצת באוניברסיטת קליפורניה, צ'יקו, אישר כל השיטות המתוארות להלן.
1. מלבין 48 hpf דג זברה עוברי
- עם 15 ס מ x 15 (w) ס"מ (l) x 7 ס מ (h) מיכלי פלסטיק ליצור תחנות שטיפת 3: 1) עם 1 מ"ל של 5% אקונומיקה במדיום העובר 1000 מ"ל (E3; ראה טבלה 1), 2) עם E3 סטרילי, ועם 3) E3 סטרילי. להבטיח לכל מכולה מכילה 500 מ של פתרון ומטביעים את העוברים ב.
הערה: עבור כל תנאי נבדק, לפחות 10 עוברי יהיה צורך. הליך זה כביסה יכול להכיל עד 200 עוברי. - עם פיפטה העברה, להכניס העוברים בתוך מסננת תה ויציפו ביצים בתחנת רחיצת #1 עבור 5 דק. להסיר את מסננת תה (עם העוברים בתוך) ומניחים לתוך תחנת רחיצת #2 עבור 5 דקות; חזור על תחנת רחיצת #3 עבור דקה 5 הסופי.
- לאחר השטיפה האחרונה העוברים שטיפה של תה מסננת על ידי מסובבים אותו הפוך נקי 10 ס"מ פטרי ושטיפה בעדינות עוברי הנחה את מסננת תה עם E3 סטרילי, פיפטה של העברה.
2. Dechorionate עוברי
- עם פיפטה העברה, להסיר, למחוק כמה שיותר E3 ככל האפשר מתוך הפטרי ולהוסיף 500 μL של dechorionation פרוטאז (10 mg/mL) העוברים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק טפח בעדינות את הצד של הפטרי כדי להסיר לחלוטין את chorions.
- פיפטה סרולוגית, להוסיף 20 מ של E3 סטרילי כדי לדלל פרוטאז. לאפשר עוברי להתיישב, ולהסיר E3 עם פיפטה העברה. חזור על שלב זה שטיפת 3 פעמים כדי להסיר כל עקבות הפרוטאז dechorionation.
3. הכנת דוגמאות העובר
- באמצעות פיפטה P1000, מניחים 10 עוברי לתוך צינור microcentrifuge יחיד mL 1.5 סטרילי.
- הסרת E3 עם פיפטה וזורקים.
התראה: פיפטה בזהירות ככל עוברי יכול בקלות להיות שנעקרו מבתיהם במהלך שטיפת בשלבים הבאים.
4. הכנת העוברים דיסוציאציה
- העברת דגימות למינארי, ולשטוף העוברים על-ידי הוספת 1 מ"ל E3 סטרילי. לאפשר עוברי ליישב לחלק התחתון של צינור ולהסיר תגובת שיקוע עם פיפטה P1000. חזור על סך של 3 מנקי.
- לאחר השטיפה האחרונה להסיר E3 וזורקים. להוסיף 1 מ"ל של 10 מ מ dithiothreitol (DTT) ב- E3 להסיר את הציפוי ריר (וכל נבגים, שמרים, או חיידקים, כי אמנם כלואה בתוכו) המקיפים את דג זברה עובריים. פרופיל microcentrifuge צינור אופקי, דגירה בטמפרטורת החדר למינארי במשך 25 דקות.
5. עובר דיסוציאציה
- רחץ מדגם 3 פעמים עם 1 מ"ל של DPBS סטרילי (עם Ca2 + ו Mg2 +). לאחר השטיפה האחרונה להוסיף 500 μL של DPBS (עם Ca2 + ו Mg2 +) ולהוסיף 5 μL של 5 מ"ג/מ"ל (26 U/mL) דיסוציאציה פרוטאז.
התראה: אנזים זה זקוק Ca2 + ו- Mg2 +, אז ודא כי DPBS מכיל יונים אלה. - דגירה בדגימות ב- 37 מעלות צלזיוס על אופקי מטרף מסלולית-180 סל ד עבור 60 דקות דגימות מקום בשכונה זרימה שכבתית, triturate עוברי עם P1000 עד מלא חלופה מועדפת דגימות.
התראה: בדוק עוברי מעת לעת כדי לקבוע מתי הם הופכים חלופה מועדפת. הפתרון העובר צריך כמות מסוימת של רקמת הנוכחי; זה לא צריך להיות הומוגני לגמרי. זה אפשרי תקציר יתר, אשר תהרוס את HSPCs (ראה איור 1 משלימה).
6. הכנת העוברים חלופה מועדפת
- פיפטה 10 הפומבית העוברים אל המאגר העליון פוליסטירן מ ל סיבוב התחתית התחתונה עם כובע מסננת תא 35 μm.
- עם פיפטה, יש לשטוף הצינור פטרי עם PBS סטרילי (עם Ca2 + או Mg2 +), פתרון העברת מ ל פוליסטירן שפופרת המכילה מסונן תאים מהשלב 6.1. חזור עד 4 מ של נוזל נמצא בצינור פוליסטירן מ.
הערה: PBS, DPBS או פתרונות אחרים במאגר מול עשוי לשמש בשלב זה, כל עוד הם אינם מכילים Ca2 + או מ ג2 + - צנטריפוגה צינורות-4 ° C ו- g x 300 במשך 5 דקות כדי הצניפה המדגם תא הומוגני. עם פיפטה, להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע ברכבת התחתית התחתונה עגול. לטפל כדי לא לשבש את התאים מגורען בתחתית הצינורית. Resuspend תאי μL 100 ל- PBS.
7. הכנת Methylcellulose
- צור 1 x פתרון מלאי מלאה methylcellulose (טבלה 1) ולהוסיף 2.5 מ ל צינורות סטרילי סיבוב המדרגה 14 מ עם 3 mL מזרקים ומחטים 16 גרם. להשתמש שפופרת אחת עבור כל תנאי נבדק.
-
הוסף ציטוקינים, מולקולות קטנות או סוכנים אחרים כדי לחקור כדי כל דגימה.
- התמיינות תאים מיאלואידים, הוסיפו 1% קרפיון סרום ו- 0.3 מ"ג/מ"ל דג זברה רקומביננטי גרנולוציט המושבה מגרה פקטור (Gcsf)34 methylcellulose לבינוני. ראה Svoboda. et al. 37 עבור תיאור מלא על איך ליצור ציטוקינים סרום ו רקומביננטי קרפיון.
- עבור בידול erythroid, להוסיף 1% קרפיון סרום ו- 0.1 מ"ג/מ"ל דג זברה רקומביננטי אריתרופויאטין (Epo)38 methylcellulose בינונית.
- לבחון אבות multilineage, מוסיפים Epo Gcsf.
התראה: ציטוקינים ותוספים צריך לא סה כ יותר מ-10% מהנפח הכולל, כפי המדיום לא יהיה מספיק צמיגה להבחין מושבות בודדות.
8. תוספת של חלופה מועדפת העוברים אל Methylcellulose
- בעזרת פיפטה של, להוסיף 100 μL של העוברים 10 dissociated אל פני השטח של methylcellulose מוכן עם סרום ציטוקינים, קרפיון רקומביננטי. כובע המכסה, מערבולת בעדינות כדי homogenize באופן מלא דוגמאות. כל שפופרת עכשיו להכיל הרקמה dissociated של 10 עוברי.
- באמצעות 3 mL מזרקים ומחטים 16 גרם, aliquot 1 מ"ל מדגם פטרי נפרד 35 מ מ 2. ודא כי המדגם באופן מלא מפוזרים על צלחת פטרי. חזור על כל דגימה.
- מקום 35 מ מ צלחות פטרי עם תאים methylcellulose לתוך 15 ס מ פטרי. על כל מנה 15 ס מ, להוסיף אחד צלחת פטרי 35 מ מ עם 5 מ ל מים סטריליים כדי ללחלוח הדגימות. תקופת דגירה-32 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 של 7-10 ימים.
9. ויזואליזציה של המושבה, נגזר HSPC ויוצרים יחידות (CFUs)
- לאחר המקננת 7 ימים, במקום דוגמאות על גבי מיקרוסקופ הפוכה בגיל 40-100 X עבור ויזואליזציה וספירה. בשלב זה, מושבות בודדות יכול להיות מבודדת עם פיפטה ונחשפו ניתוח מכתים ו/או הגן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להעריך את המספרים HSPC דג זברה עובריים, 48 hpf העוברים היו מתעכל, מצופה ב- methylcellulose עם גורמי גדילה hematopoietic תומכת אקסוגני, מודגרות במשך 7 ימים (איור 1א'). לאחר 7 ימים, יחידות ויוצרים מושבה (CFUs) היו ספורים (איור 1B), תמונה (איור 1C). על ידי שליטה של ציטוקינים שונים הוסיף, אחד יכול לשלוט בסוגים של מושבות המיוצר: Epo הוא הכרחי עבור בידול erythroid ו Gcsf הוא הכרחי עבור בידול מיאלואידית. קרפיון סרום הוא מקביל לשימוש של סרום שור עוברית בתרבות רקמה יונקים; זה מקור של גורמי גדילה כללי. איור 1, Epo Gcsf, קרפיון סרום נוספו, המאפשר את הספירה של erythroid, מושבות תאים מיאלואידים ומעורבות erythromyeloid. מושבות אלו מבחינים עקב שלהם צורה וצבע; המושבות erythroid צמוד, קטן, קומפקטי, יש צבע אדום עקב hemoglobinization. המושבות מיאלואידית גדולים יותר, יש יותר תאי תאים בקצוות שלהם, לתת להם מראה הסתור.
מצליח ציפוי של דג זברה עובריים מטופלים עם HSPC-תומכת גורמים תניב CFUs לאחר 7-10 ימי דגירה. חשוב, כמות CFUs ישירות בקורלציה עם מספר העוברים מצופה (איור 1B). ציפוי עוברי או 4 או 8 לכל mL (לאפקטים החל עוברי 10 או 20 בתחילת הניסוי) מניב CFUs כ 1,200 או 2,400, בהתאמה. פרוטוקול שלנו מציע באמצעות 10 עוברי, גם ככה קשה וצורכת זמן לספור 2,400 CFUs בעת ביצוע ניסוי גדול יותר. המתודולוגיה של עיכול כל העוברים, פסולת שונות נמצא methylcellulose, אלא ניתן להבחין בקלות מן המושבות בפועל עם הגדלה גבוהה יותר תחת המיקרוסקופ. פסולת אחרים התאית עשוי גם להיות נוכח, אבל CFUs רק הנוכחי יהיה נגזר HSPC בשל התוספת של ציטוקינים HSPC-תומכת. אם CFUs קטן, לא לראות בקלות, יכול מודגרות התרבויות עד ל-10 ימים כדי לעודד צמיחה מוגברת. עם זאת, לא תניב הדגירה מוגברת יותר CFUs; אם CFUs אינם קיימים, זה מצביע על אובדן פעילות ציטוקינים, על העיכול של עוברי (והרס עוקבות HSPCs; ראה משלימה איור 1), או הפסולה ציפוי של דגימות. . זה תמיד חשוב להפעיל פקדי נאותה בכל פעם ניסוי זה מבוצע כדי להבטיח כי סטיות בטכניקה לא תשואה שווא הבדלים HSPC ספירה. לדוגמה, אם ניסוי מבוצע כדי לנתח את מספר HSPCs נוכח morphant עוברי, צריך להיות מוכן מדגם עם אחים נורמליים לצד. אם ניסוי מתבצע כדי להשוות את השפעת התרופה על התפתחות HSPCs מדגם עם אחים לא מטופל צריך להיות מוכן וניתח לצד.
איור 1: CFUs HSPC מונה-derived מעוברים דג זברה hpf 48. (א) סקירה סכמטי של עובר ציפוי על methylcellulose עם ציטוקינים HSPC-תומכת בדור של hematopoietic CFUs. 48 hpf דג זברה העוברים היו הפומבית, מצופה ב- 1% methylcellulose מלאה אריתרופויאטין (Epo) גרנולוציט המושבה מגרה פקטור (Gcsf), סרום קרפיון, לאפשר בידול erythromyeloid. (B) ספירה של המושבה יוצרי יחידות (CFUs) מדגימות מצופה בריכוזים של העוברים 4 או 8 לכל mL (החל את הניסוי עם עוברי 10 או 20, בהתאמה). הספירה נעשתה ב- 100 X במיקרוסקופ הפוכה. מציינות מספר ממוצע של CFUs, קווי שגיאה מציינות סטיית תקן. מורפולוגיה המושבה (ג) נציג של עובר ציפוי על methylcellulose. המורפולוגיה של המושבה מציין את סוגי התאים המרכיבים את המושבה; תמונות יהיו נציג erythroid, מושבות מיאלואידית. CFUs צולם 400 X. גודל ברים = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 1: עיכול של העוברים עם דיסוציאציה פרוטאז. (א) תמונות של 10 עוברי לפני עיכול (עזב; מעוכלים), לאחר עיכול נאותים (האמצעי; מתעכל), לאחר עיכול עודף (נכון; מעל מתעכל). (B) Zoomed בתמונות (7.3 X) של צינורות מתעכל מתעכל ושוב ב (). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת דגם דג זברה הפך מודל יעיל, יעילה וזולה עבור הלומדים hematopoiesis חוליות פרימיטיביים ומוחלטת. דור של מבחני מהיר, זול, והוא מציג כמה בעיות טכניות יכול להיות מנוצל עבור בדיקות מולקולות קטנות, ניתוח מוטציה עוברי שחקרתי חשוב HSPC ביולוגיה מולקולרית מסלולים. במבחנה ציפוי של HSPCs של דג זברה בוגרת היא שיטה יעילה כדי ללמוד מוטגנזה מכוונת, ציטוקינים ו פגמים hematopoietic. פרוטוקול זה מתבססת על מחקרים אלה, אבל מנצל דג זברה עובריים. החלת מבחני אלה מתחלקים דג זברה מאפשר איסוף נתונים מהיר יותר, השימוש של המרחב הפיזי פחות, השימוש בסמים פחות (עבור מסכי סמים), וההיתרים ביטוי mRNA בדיקה ו/או מורפולינו (מו) נוקאאוט של מסלולים גנטיים מסוימים. חשוב, זה גם מאפשר הלימוד בשלבים של hematopoiesis רק להתרחש במהלך התפתחות מוקדמת חוליות.
בשל הגמישות של assay הזה, זה יכול בקלות להיות שונה לצרכים מגוונים רבים. שינוי אחד של פרוטוקול זה הוא האפנון של תזמון התפתחותי; שינוי גיל העוברים מנוצל מאפשר את כימות של הדור HSPC לאורך זמן. זה יכול גם לאפשר לימוד נפרדות קבוצות משנה של HSPCs כגון erythromyeloid אבות6, להתעורר לפני 36 hpf, לעומת bona פיד ה HSCs3,4,5,8, להתעורר לאחר מכן. אף אחד עדיין לא מסוגלים לבודד ולזהות קבוצות משנה HSPC דג זברה מוגבלת יותר של העובר המתפתח, אך מבחני אלה מאפשרים ניסויים אלה. זה חיוני כי בעת שינוי בשלבים התפתחותיים של בעלי החיים, כמות התאים הוסיף לתוך methylcellulose אופטימיזציה; בעלי חיים מעטים מדי תניב אין מושבות, בעוד גם רבים תיצור צלחת הנפולת של המושבות HSPC. הוספת ציטוקינים שונים היא שינוי אחר אשר ניתן להתאים ניסויים ספציפיים. הוספת Epo תאפשר את כימות של המושבות erythroid, בעוד Gcsf תאפשר ספירה של מושבות מיאלואידית. הוספת שני ציטוקינים אלה תאפשר השושלת מרובה CFU הדור. חשוב, אלו מבחני אישור בדיקה של ציטוקינים בשם ואת השפעתם על התפשטות HSPC ובידול. כן, ניתן לשנות את מבחני אלה כדי לבצע בדיקות סמים בקנה מידה גדול; עוברי יכול להיחשף ריכוזים שונים של תרכובות בנקודות זמן שונות במהלך הפיתוח כדי לראות אם הכימיקלים יש השפעה חיובית או שלילית על ייצור הדם. דרך סופית כי ניסויים אלה ניתן לשנות היא כי עוברי יכול להיות מוזרק בשלב אחד-תא mRNA ספציפי או מוס, אשר overexpress או תמונות ציפורים גנים ספציפיים, בהתאמה. לאחר פיתוח במשך 24-48 שעות, אלה העוברים יכול להיות נתון מבחני אלה כדי לקבוע אם רווח או הפסד-של-פונקציה של גנים ספציפיים לשחק תפקיד חיוני HSPC מערך ההפצה, בידול. חשוב גם לציין כי ניצול הטרנסגניים זנים של דג זברה יסייעו המהירות והקלות של איסוף ופרשנות של נתונים. למשל, אם אחד מעוניין בפיתוח erythroid, קל לביצוע ניסויים אלה ב- gata1: DsRed עוברי40, אשר יש האמרגן של erythroid ספציפיים הטרנסגניים Gata1 גורם שעתוק נהיגה DsRed קרינה פלואורסצנטית. בדרך זו, בעת ניתוח erythroid מושבות, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות יכול להיות מנוצל. באופן דומה, ניתן לבצע מחקרים אלו בעלי חיים מרובים transgenes נוכח לחפש אחר שושלות תאים מרובים בבת אחת. טכניקה זו יהיה שימושי לזיהוי multilineage HSPCs; למרות erythroid ועל מושבות תאים מיאלואידים בקלות ניתן להבחנה על ידי מורפולוגיה, קשה לזהות את המושבות המכילות bipotential אבות בלי להמחיש את הנוכחות של שושלת היוחסין הספציפי transgene מרובות, ביטוי המושבה באותו .
אף על פי מבחני אלה יש יתרונות רבים, זה חיוני כדי להגדיר בקרה נאותה בכל פעם ניסויים אלה מבוצעות; הבדלים קלים בטכניקה יכול לשנות את התוצאות ואת פרשנויות של הממצאים. לדוגמה, זה אפשרי לקבל מספר שונה של HSPCs בעת ביצוע הניסויים בימים שונים אם הטכניקה שלך אינו מדויק; כדי להתמודד עם האפשרות הזו, אחד תמיד צריך לכלול את פקד המתאים. אם ניסוי מתבצע כדי לבחון את ההשפעה של סרט על פיתוח, ואז לשלוט עוברי (גם uninjected או להזריק פקד מו) של המצמד אותו גם תעובד לצד המדגם ניסיוני. אם הניסוי נועד לבחון את ההשפעה של תרופה מסוימת, אז דגימות לא מטופל צריך להיות כלול כפקד. בסופו של דבר, אם בחינת השפעת ציטוקין ספציפי על פיתוח, אז חיות מכל המצמד אותו צריך גם להיות מעובד ובחן באותו הזמן מבלי של ציטוקין הוסיף לתרבות.
בזמן הזה assay במבחנה הוא פשוט לבצע התוצאות הם קלים לפירוש, כמה בעיות פוטנציאליות יכול להיווצר במהלך ההליך. אם המושבות לא נראים לאחר 7 ימים בתרבות, ישנם מספר בעיות שייתכן שהתרחשה. תחילה, בדוק כדי לוודא כי ציטוקינים הם טהור בריכוזים נאות; תלוי איך ציטוקינים הופקו זה ייתכן שיהיה צורך לשנות ריכוזים ולייעל את פעילותם. בעיה נוספת שעולה בדרך כלל יתר מעכלת את העוברים, אשר הורסת את HSPCs; . שמור על עצמך בשלב עיכול, לשנות את התזמון אם המושבות לא נראים שוב ושוב. לבסוף, ערבוב של methylcellulose, תוספת של קרפיון סרום יכול להיות הנושא, כדי לוודא כי כל החומרים היו הוסיף, מעורב בצורה נכונה. בנוסף בעיות טכניות, חשוב להבין כי מושבות כנראה נצטרך יותר לפתח בנסיבות מסוימות; מושבות קטנות לעיתים קרובות גלויים יותר לאחר 3 ימים נוספים בתרבות. לעבור 10 ימים לא מומלץ, כפי methylcellulose מתחיל להתייבש זמן קצר לאחר מכן. בעיה נפוצה נוספת היא כי לפעמים מושבות נוטים לאסוף מסביב לקצוות של צלחות פטרי 35 מ מ; סריקת הלוחות ביסודיות, במיוחד בקצוות, חיוני. כמו כן, חשוב לזכור כי מושבות אלו מפתחים בחומר עבה, צמיגה; בעת התמקדות המיקרוסקופ, להתאים את המוקד למעלה ולמטה כדי להתבונן מעט שונה מטוסים-המושבות לא אשב על החלק התחתון של כלים פלסטיק.
אלה מבחני במבחנה יש שפע של יתרונות, אבל יש להם גם כמה מגבלות. הבעיה הגדולה היא כי מבחני האלה לא יכול להוכיח בוודאות כי הוא אב קדמון מועדון הכדורגל מונפלייה-כי ניתן להוכיח רק על ידי שיחזור לטווח ארוך של חיות לקרינה. בנוסף, ציטוקינים לא כל כבר מוגדרת, חקר בדג זברה, אשר מגביל את סוגי HSPCs זה יכול ייחקרו. למשל, ציטוקינים הלימפה תומכת אין דג זברה זוהו עדיין, מניעת ייצור B ו- T cell מבחני אלה. יתר על כן, לא ברור כאשר culturing multipotent HSPCs אם התוספת של סוגים מסוימים (או כמויות) של ציטוקינים ספציפי יכול להטות את הבידול למטה מסוימים מסלולים hematopoietic. הקונה הפוטנציאלי נוספת היא כי זו assay ביעילות אינו יכול להבחין אם HSPCs קיימות למעשה במדגם, אך מסיבה כלשהי אינם יכולים להבחין (או אחרת אינם קיימא). כמו עם מבחני במבחנה רוב, עוד ניסויים צריכה תמיד להתבצע כדי לאמת את הממצאים. בבדיקות סוגיות אלה, המידע יכול להיות שלוקט אלה מבחני המשובטים.
מבחני אלה הם משמעותיים, משום שהם מאפשרים סינון מהיר ויעיל של פגמים hematopoietic. חוקרים יכולים להפיל מסלולים גנטיים מסוימים עם MOs, צלחת מתעכל בעלי חיים כדי לראות אם הגן ממלא תפקיד hematopoiesis. בנוסף, דגים מוטנטים (שנוצר קודם לכן או שנוצר לאחרונה במסכים מוטגנזה מכוונת) יכול להידרש בקלות ובמהירות. מבחני אלה מאפשרות גם סמים יעיל מבחני המיון על אורגניזמים חיים, כל לזהות את מודולציה של הביולוגיה HSPC גם בעת היותו מסוגל להתבונן אם הסמים יש השפעה שלילית על התפתחות או הישרדות. מבחני אלה מאפשרות גם כימות של HSPCs ב דג זברה המתפתח-timepoints שונים. בעוד מחקרים רבים ניסו quantitate מספרים HSC למבוגרים7,27,30,41 ודג זברה עובריים3,4,42, 43, אין מחקרים יש quantitated את כמויות שונות של מוגבלת השושלת HSPCs של דג זברה. בנוסף, מבחני אלה יכול להיות מנוצל כדי לבחון לווסת מסלולים מולקולריים חשוב כדוריות דם, בידול, תהליך זה נשאר חידתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מימון סופק על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (NIH: K01-DK087814-01A1 כדי D.L.S.), התוכנית אוניברסיטת מדינת קליפורניה עבור חינוך ומחקר בתחום הביוטכנולוגיה (CSUPERB: בקרה מולקולרית של הגומחה Hematopoietic חוליות כדי D.L.S.) מ במשרד לתארים צ'יקו באוניברסיטה של מדינת קליפורניה (ל A.C.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
References
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
- Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
- Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
- Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
- Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
- de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
- Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
- Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
- Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
- Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
- Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
- Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
