Summary

ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной целенаправленной интеграции в естественных условиях с помощью стратегию на основе присоединения гомологии опосредованной конец

Published: March 12, 2018
doi:

Summary

Кластеризованный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется/ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (ТРИФОСФАТЫ/Cas9) система обеспечивает перспективным инструментом для генной инженерии и открывает возможность целенаправленной интеграции трансгенов. Мы описываем гомологии опосредованной конец присоединения (HMEJ)-на основе стратегии для эффективных ДНК интеграции в естественных условиях и целевой терапии гена с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9.

Abstract

Как перспективный генома редактирования платформы ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система имеет большой потенциал для эффективного генетические манипуляции, особенно для целенаправленной интеграции трансгенов. Однако, из-за низкой эффективности гомологичная рекомбинация (HR) и различных indel мутации не гомологичных конца присоединения (NHEJ)-на основе стратегии-деления клеток, в естественных условиях генома редактирования остается большой проблемой. Здесь мы описываем гомологии опосредованной конец присоединения (HMEJ)-основанный ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы для эффективного в vivo точные целевые интеграции. В этой системе, целенаправленных генома и доноров вектор содержащий гомологии оружия (~ 800 bp) в окружении одной руководство РНК (sgRNA) целевой последовательности расщепляется, ТРИФОСФАТЫ/Cas9. Эта стратегия на основе HMEJ достигает эффективного трансген интеграции мыши зигот, а также в гепатоциты в естественных условиях. Кроме того, стратегия на основе HMEJ предлагает эффективный подход для коррекции fumarylacetoacetate гидролазы (фа) мутации в гепатоцитах и спасает фа-дефицит индуцированные поражения печени мышей. Вместе взятые, сосредоточив внимание на целенаправленных интеграции, эта стратегия на основе HMEJ обеспечивает перспективным инструментом для различных приложений, включая создание генетически модифицированных животных моделей и целевых генной терапии.

Introduction

Точные, целенаправленных генома редактирования часто требуется для производства генетически модифицированных животных моделей и клинической терапии. Много усилий был достигнут в разработке различных стратегий для эффективного целенаправленного генома, редактирования, такие как цинковый палец нуклеиназы (ZFN), транскрипции эффекторных активатор как nucleases (Таленс) и ТРИФОСФАТЫ/Cas9 систем. Эти стратегии создания целевых двухнитевые разрывы ДНК (DSB) в геноме и воспользоваться преимуществами встроенных систем ремонта ДНК, таких как гомологичная рекомбинация (HR)1,2, microhomology опосредованной конец присоединения (MMEJ)3 , 4 , 5и не гомологичных конце присоединения (NHEJ)6,,78 побудить целенаправленной интеграции трансгенов1,9. HR-стратегия на основе в настоящее время наиболее часто используемые генома редактирования подход, который является очень эффективным в клеточных линий, но не легко доступной для не деления клеток из-за его ограниченного возникновения в конце S/G2 фазе. Таким образом HR-стратегия на основе не применима для в естественных условиях изменения генома. Недавно была разработана стратегия на основе NHEJ для забивные эффективного гена в ткани мыши8. Тем не менее метод на основе NHEJ обычно вводит indels на перекрестках, что делает его трудно генерировать точные генома редактирования, особенно при попытке построить в кадр фьюжн генов8. На основе MMEJ целенаправленной интеграции способен редактирования точных генома. Однако это лишь незначительно увеличивает эффективность целенаправленной интеграции в предыдущих докладах5. Таким образом повышение эффективности точные целевые интеграции в vivo срочно необходима для широкого терапевтического применения3.

В недавно опубликованной работе, мы продемонстрировали гомологии опосредованной конец присоединения (HMEJ)-на основе стратегии, которая показала высокую эффективность целенаправленной интеграции всех сообщений о стратегии как in vitro и in vivo10. Здесь, мы описать протокол для создания системы HMEJ, а также строительство векторов сингл руководство РНК (sgRNA), ориентация гена интереса и доноров векторы укрывательстве sgRNA целевые сайты и ~ 800 bp гомологии оружия (рис. 1) . В этом протоколе мы также описывают подробные шаги для генерации ДНК забивные мышей и краткие шаги для целенаправленной интеграции в тканях в естественных условиях. Кроме того исследование доказательства в концепция стратегии на основе HMEJ продемонстрировала свою способность исправить Fah мутации и спасти фа– / – печени провал мышей, которые далее показали его терапевтический потенциал.

Protocol

Все процедуры, включая животных темы были утверждены Комитетом по этике биомедицинских исследований на Шанхай институтов биологических наук (CAS). 1. дизайн доноров плазмиды Выбор sgRNA Используйте онлайн-ТРИФОСФАТЫ дизайн инструментов для прогнозирова…

Representative Results

HMEJ-основанные геном редактирования в эмбрионов мыши: Чтобы определить стук в эффективности метода, основанного на HMEJ в мыши зигот, мы поставляли Cas9 мРНК, sgRNA ориентации генов Cdx2 и HMEJ доноров в мыши зигот, который был разработан для предохранителя p2A-mCherry Ре?…

Discussion

Наиболее важные шаги в строительстве HMEJ плазмид доноров являются: (1) выбор sgRNA с высокой эффективностью расщепления ДНК и низкой расстояние между sgRNA резки и стоп-кодон и (2) надлежащего строительства HMEJ доноров. ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной расщепление на обоих трансген доноров вектор (…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана CAS стратегической приоритетной исследовательской программы (XDB02050007, XDA01010409), Национальный Hightech R & D программы (863 программы; 2015AA020307), Национальный фонд естественных наук Китая (NSFC предоставляет 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), Китай молодежи тысяч талантов программа (HY), перерыв через проект Академии наук Китая, Шанхай городской комитет по науке и технике проекта (16JC1420202 HY), Министерство науки и техники Китая (наиболее; 2016YFA0100500).

Materials

pX330 Addgene 42230
pAAV vector Addgene 37083
pX260 Addgene 42229
AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 Addgene 97307 AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter
AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA Addgene 97308 HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone.
AAV_Cdx2 HMEJ donor Addgene 97319 HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. 
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Life Technology L3000015
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9930
Bbs I New England Biolabs R0539S
NEB Buffer 2 New England Biolabs B7002S
T7 endonuclease I New England Biolabs M0302L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs E2621L
Plasmid EndoFree-Midi Kit Qiagen 12143
MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA Life Technologies AM1345
MEGACLEAR KIT 20 RXNS Life Technologies AM1908
MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS Life Technologies AM1354
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97  Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300)
Borosilicate glass Sutter Instrument B100-78-10 type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) 
FemtoJet microinjector Eppendorf
Freezing microtome Leica CM1950-Cryostat thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver
Rabbit anti-mCherry GeneTex
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG Jackson Immunoresearch
DMEM Gibco 11965092
FBS Gibco 10099141
NEAA Gibco 11140050
Pen,Strep,Glutamine Gibco 10378016
Gel Extraction Kit Omega D2500-02
FACS BD AriaII
PMSG Ningbo Sansheng Medicine S141004
HCG Ningbo Sansheng Medicine B141002
Cytochalasin B Sigma CAT#C6762
KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red Millipore CAT#MR-106-D
M2 Medium with Phenol Red Millipore CAT#MR-015-D
Mineral oil Sigma

References

  1. Yang, H., et al. Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  2. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
  3. Nakade, S., et al. Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9. Nature Communications. 5, 5560 (2014).
  4. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
  5. Yao, X., et al. Cas9 – Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms. EBioMedicine. , (2017).
  6. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).
  7. Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).
  8. Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).
  9. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  10. Yao, X., et al. Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9. Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).
  11. Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells. Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).
  12. Han, D. W., et al. Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors. Cell Stem Cell. , (2012).
  13. Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
  14. Sparman, M., et al. Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates. Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).
  15. Schatten, G., Mitalipov, S. Developmental biology: Transgenic primate offspring. Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).
  16. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  17. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  18. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
  19. Park, K. E., et al. Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins. International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).
  20. Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
  21. Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).
  22. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  23. Grompe, M., et al. Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice. Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).
  24. Paulk, N. K., et al. Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo. Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).

Play Video

Cite This Article
Yao, X., Wang, X., Liu, J., Shi, L., Huang, P., Yang, H. CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy. J. Vis. Exp. (133), e56844, doi:10.3791/56844 (2018).

View Video