Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

CRISPR/Cas9-mediert målrettet integrering i Vivo med en homologi-mediert slutten begynte-basert strategi

doi: 10.3791/56844 Published: March 12, 2018

ERRATUM NOTICE

Summary

De klynget regelmessig interspaced kort palindromic gjentar/CRISPR tilknyttet protein 9 (CRISPR/Cas9) gir et lovende verktøy for genteknologi, og åpner opp muligheten for målrettet integrasjon av effekter av transgener. Vi beskriver en homologi-mediert slutt begynte (HMEJ)-basert strategi for effektiv DNA målrettet integrering i vivo og målrettet gen-terapi bruker CRISPR/Cas9.

Abstract

Som en lovende genomet redigering plattform har CRISPR/Cas9 systemet stort potensial for effektiv genetisk manipulasjon, spesielt for målrettet integrering av effekter av transgener. Men på grunn av lav effektiviteten av homologe rekombinasjon (HR) og ulike indel mutasjoner av ikke-homologe begynte (NHEJ)-basert strategier i ikke-dele celler, i vivo genomet redigering er fortsatt en stor utfordring. Her beskriver vi en homologi-mediert slutt begynte (HMEJ)-basert CRISPR/Cas9 system for effektiv i vivo presis målrettet integrering. I dette systemet, målrettet genomet og donor vektor inneholder homologi armene (~ 800 bp) flankert av enkelt støttelinje RNA (sgRNA) mål sekvenser er kløyvde av CRISPR/Cas9. Denne HMEJ-basert strategi oppnår effektiv transgene integrering i musen zygotes, samt i hepatocytter i vivo. Dessuten en HMEJ-basert strategi tilbyr en effektiv fremgangsmåte for korreksjon av fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutasjon i hepatocytter og redder Fah-mangel indusert leversvikt mus. Sammen med fokus på målrettet integrasjon, denne HMEJ-basert strategi gir et lovende verktøy for en rekke applikasjoner, inkludert generasjon av genmodifiserte dyr modeller og målrettet gen-terapi.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Presis, målrettet genomet redigering er ofte nødvendig for å produsere genmodifiserte dyr modeller og klinisk behandling. Mye innsats har blitt gjort å utvikle ulike strategier for effektiv målrettet genomet redigering, for eksempel sink finger nuclease (ZFN), transkripsjon aktivator som effektor nucleases (TALENs), og CRISPR/Cas9 systemer. Disse strategiene opprette målrettede DNA dobbel-strand bryter (DSB) i genomet, og dra nytte av innebygd DNA reparasjon systemer, for eksempel homologe rekombinasjon (HR)1,2, microhomology-mediert slutten med (MMEJ)3 , 4 , 5og ikke-homologe slutt begynte (NHEJ)6,7,8 å indusere målrettet integrering av effekter av transgener1,9. Den HR-basert strategien er mest brukte genomet redigering tilnærming, som er svært effektiv i linjer, men ikke lett tilgjengelig for ikke-dele celler på grunn av begrenset forekomst i slutten S/G2 fase. Dermed er den HR-basert strategien ikke tilgjengelig for i vivo genomet redigering. Nylig ble den NHEJ-basert strategien utviklet for effektiv genet banke i musen vev8. Likevel introduserer metoden NHEJ-baserte vanligvis indeler ved veikryss, gjør det vanskelig å generere nøyaktige genomet redigering, særlig når prøver å konstruere i-ramme fusion gener8. MMEJ-baserte målrettede integrering er i stand til nøyaktig genomet redigering. Det øker imidlertid bare beskjedent målrettet integrering effektiviteten i tidligere rapporter5. Derfor er effektivisering av presise målrettet integrering i vivo sterkt behov for bred terapeutiske programmer3.

I en nylig publisert arbeid, vi viste en homologi-mediert slutt begynte (HMEJ)-basert strategi, som viste den høyeste målrettet integrering effektiviteten i alle rapporterte strategier både i vitro og vivo10. Her beskriver vi en protokoll for etablering av HMEJ, og også byggingen av enkelt-guide RNA (sgRNA) vektorer målretting genet av interesse og donor vektorer harboring sgRNA målområder og ~ 800 bp homologi våpen (figur 1) . I denne protokollen beskriver vi også detaljerte trinn for generering av DNA banke i mus og informere skritt for målrettet integrering i vev i vivo. Videre vist en proof-of-concept studie av den HMEJ-basert strategien sin evne til å rette Fah mutasjon og redde Fah- / - leveren feil mus, som videre avslørt sitt terapeutiske potensial.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle prosedyrer inkludert dyr fag er godkjent av den biomedisinsk forskning etiske komiteen ved Shanghai institutter for biologisk vitenskap (CAS).

1. prosjektert av Donor plasmider

  1. Utvalg av sgRNA
    1. Bruke online CRISPR verktøy for å forutsi sgRNAs på målet regionen11,12,13,14,15. For Cdx2 locus, utforme seks ulike sgRNAs (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6) rundt stopp codon med høyere rang og lavere potensial av mål (figur 1A)16.
    2. Linearize 2 µg Cas9-CMV-EGFP uttrykk vektorer og sgRNA av BbsI fordøyelse (1 µL av BbsI 2 h på 37 ° C i en siste konsentrasjon av 1 U/µL i et volum på 20 µL). Deretter rense produktet av gel rensing kit med en 1% agarose gel 1 × TAE buffer.
    3. Blandingen et par sgRNA oligonucleotides i 10 µL av 1 × T4 DNA ligase buffer til en siste konsentrasjon av 50 µM. ruge oligo løsningen med en temperatur gradient fra 95 ° C til 25 ° C med en temperatur endre hastighet på 5 ° C/5 min (95 ° C i 5 min deretter 90 ° C i 5 min, 85 ° C for 5 min osv.), som vil anneal oligos.
    4. Blanding 4 µL av herdet produkt, 2 µL av lineær vektoren med 1 µL av T4 DNA ligase i 10 µL av 1 × T4 DNA ligase buffer, og deretter ligate på 22 ° C i 1-2 h (figur 1B).
  2. Landmåler nuclease analysen av sgRNA
    Merk: Målretting effektiviteten i sgRNA brukes til knock-i eksperimentet vurderes ved surveyor nuclease analysen (også kjent som T7 endonuclease jeg (T7EI) analysen)17. Velg sgRNA med høy DNA cleavage effektivitet og lave avstand mellom sgRNA kutte området og stoppe codon.
    1. Transfect Cas9-sgRNA-EGFP uttrykk vektorer i N2a cellelinjer kulturperler på DMEM supplert med 10% fosterets bovin serum, 1% PSG, og 1% ikke-essensielle aminosyren av hva kit (se Tabell for materiale). Inkuber transfekterte cellene på 37 ° C i 5% CO2.
    2. Etter 48 timer med inkubering, samle 5000 transfekterte celler (GFP+) fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) med ikke-transfekterte celler som en kontroll.
    3. Fordøye det avhentet celler i 2-5 µL oflysis buffer (0,1% Triton X-100, 0,1% mellom 20 og 100 µg/mL proteinasen K) på 56 ° C i 30 minutter, og deretter varme deaktivere proteinasen K på 95 ° C i 10 min.
    4. Forsterke prøven ved nestede PCR (tabell 1) bruker produsentens protokollen. Størrelsen på PCR produkter er satt til 300-500 bp.
      1. Mix 1 µL lysis produktet med DNA polymerase og et par ytre primere gjenkjenne sekvensen rundt målområdet sgRNA (0,1 µM, siste konsentrasjon) (tabell 1), og utføre den primære PCR i et volum på 20 µL.
      2. Aktivere DNA polymerase ved 95 ° C i 5 min og utføre den primære PCR for 30 sykluser på 95 ° C for 30 s, 60 ° C for 30 s og 72 ° C for 24 s (1 min/1 kb), med en endelig utvidelse ved 72 ° C i 5 minutter.
      3. Utføre den sekundære PCR 1 µL av primære PCR produkt og et par nestede indre primere.
    5. Denature og re anneal 300-600 ng renset PCR produkt i 20 µL av 1 × T7EI reaksjon buffer (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7.9) ved hjelp av en gradient temperatur fra 95 ° C til 25 ° C med en rate på 5 ° C/5 min.
    6. Legg til 1 µL av T7EI enzym glødet PCR produkter og fordøye ved 37 ° C i 2 timer. Deretter kjøre fordøyelsen produktet på 2% agarose gel 1 × TAE buffer på 120 V for 40 min til fragmenter er atskilt (se Tabell for materiale).
    7. Bruk ImageJ for å bestemme bandet intensiteter av klipp og uklippet DNA. Beregne indel frekvensen med metodene som tidligere rapportert9 (figur 1C).
  3. Byggingen av donor vektor
    Merk: For å generere HMEJ donor vektorer for Cdx2 genet, konstruere en donor DNA (800 bp HAL-p2A-mCherry-800 bp HAR) flankert med 23 nt Cdx2-sgRNAs målretting sekvens i begge ender (figur 1D og figur 1E). PAM av målet var ved slutten av homologe armen. Gibson montering anbefales for HMEJ donor kloning.
    1. Forsterke 800 bp venstre homologi armen (HAL) med fremover primer-1F (som inneholder 15-20 nt overlapping rekkefølge fra vektor, 23 nt Cdx2-sgRNA målretting sekvens og 20 nt rekkefølge fra HAL) og reversere primer-1R (inneholder 15-20 bp overlapping rekkefølge fra p2A-mCherry og rundt 20 nt rekkefølge fra HAL) på 0,1 µM siste konsentrasjon bruke musen genomisk DNA på 200 ng/µL (figur 1D, tabell 1).
    2. Forsterke p2A-mCherry innsetting fragmentet med fremover primer-2F (inneholder 15-20 nt overlapping sekvens fra HAL og 20 nt rekkefølge fra innsetting fragment) og omvendt primer-2R (som inneholder 15-20 nt overlapping rekkefølge fra HAR og 20 nt rekkefølge fra innsetting fragmentet) på 0,1 µM siste konsentrasjon med genomisk DNA eller plasmider reporter sekvenser på 100 ng/µL eller 30 ng/µL (figur 1D, tabell 1).
    3. Forsterke 800 bp høyre homologi armen (HAR) med fremover primer-3F (som inneholder 15-20 nt overlapping rekkefølge fra vektor, 23 nt Cdx2-sgRNA målretting sekvens og 20 nt rekkefølge fra HAR) og reversere primer-3R (inneholder 15-20 nt overlapping rekkefølge fra p2A-mCherry og rundt 20 nt rekkefølge fra HAR) på 0,1 µM siste konsentrasjon bruke musen genomisk DNA på 200 ng/µL (figur 1D, tabell 1).
    4. Kjør alle PCR produkter på 1% agarose gel 1 × TAE buffer, og rense PCR produkter av forventet størrelse av gel utvinning, i henhold til produsentens instruksjoner (tabell 1).
    5. Fordøye 50-100 ng av en konstruksjon vektor med KpnI og XbaI. Bland 2 µL av lineær vektoren på 30-40 ng/µL med tre PCR forsterket fragmenter (1 µL for hver, 100-200 ng/µL) i 2 x Gibson blanding. Legge til H2O for å justere endelige volumet til 10 µL.Incubate i blandingen på 50 ° C for 60 min.
    6. Transformere kompetent E. coli celler med sammensatte produktet og pakk plasmider konstruksjoner av DNA utvinning i henhold til produsentens instruksjoner. Kontroller HMEJ donor av DNA sekvensering.

2. genomet redigering i Mouse embryoer med metoden HMEJ-basert

  1. Produksjon av Cas9 mRNA
    1. Cas9 mRNA forberedelse, legge T7 promoter sekvensen til Cas9 koding regionen ved PCR forsterkning med riktig primer paret oppført i tabell 1. Legge primer Cas9 F/R på en siste konsentrasjon av 0,1 µM og 20 ng av Cas9 uttrykke vektor til 1 × Hi-Fi DNA polymerase blanding. Juster endelige volumet til 50 µL med H2O.
    2. Aktivere DNA polymerase ved 95 ° C i 5 min og utføre PCR for 36 sykluser på 95 ° C for 30 s, 60 ° C for 30 s og 68 ° C i 4 min (1 min/1 kb), med filtypen siste på 68 ° C i 10 min.
    3. Rense T7-Cas9 PCR produktet i vitro transkripsjon (PES) og deretter transkribere 0,5-1 µg DNA av mRNA transkripsjon ved 37 ° C i 8 timer i et totalvolum på 20 µL, i henhold til produsentens instruksjoner (se Tabell for materiale).
    4. Legge 1 µL av DNase til blandingen å fjerne malen DNA ved 37 ° C i 15 min. Legg en poly-en hale for 45 min ved 37 ° C og komme Cas9 mRNA av RNA rensing kit, i henhold til produsentens instruksjoner (se Tabell for materiale).
  2. Produksjon av sgRNA
    1. Generere malen sgRNA drevet av en T7 promoter med Hi-Fi DNA polymerase som ovenfor. Velg en sgRNA stillaset inneholder vektorgrafikk som mal. Primere brukt er oppført i tabell 1.
    2. Rense T7-sgRNA PCR produktet og bruke 0,5-1 µg DNA som mal for i vitro transkripsjon av sgRNA i en kort RNA transkripsjon kit på 37 ° C 6t i et totalvolum på 20 µL, i henhold til produsentens instruksjoner (se tabell for materiale < / c11 >).
    3. Legg 1 µL av DNase til blandingen og fortsette inkubering ved 37 ° C i 15 minutter for å fjerne malen DNA. Rense sgRNAs av RNA rensing kit, som ovenfor (se Tabell for materiale).
    4. Fortynne sgRNA til 500 ng/µL i RNase-fritt vann og lagre eksemplene på −80 ° C for inntil 3 måneder.
      Merk: CRISPR ribonucleoproteins (RNPs) er en alternativ substitusjon med en bedre kutte effektivitet18,19,20.
  3. Fosteret samling, microinjection og i vitro kultur
    1. Superovulate B6D2F1 (C57BL/6 × DBA2J) hunnmus (7-8 uker gamle) av gravid mare serum gonadotropin (PMSG), etterfulgt av humant choriongonadotropin (hCG) 48 timer senere. Etter hCG injeksjon, huset kvinner med B6D2F1 menn over natten.
    2. Ofre kvinner av CO2 anestesi, 24 timer etter hCG injeksjon. Samle befruktet embryoer fra deres oviducts (med 30-50 embryo for hver kvinne) i M2 medium.
    3. Sted de befruktede embryoene (ca 300 egg for dag injeksjon) i KSOM medium (5.55 finans NaCl, 0,19 finans KCl, 0,05 finans KH2PO4, 0,05 finans MgSO4•7H2O, 0.04 finans glukose, 1,12 finans natrium laktat, 2.1 finans NaHCO3 , 0.02 finans natrium pyruvate, 0,25 g/L CaCl2•2H2O, 0.004 finans EDTA, 0.146 g/L L-glutamin og 1 g/L Bovine serum albumin) på 37 ° C i en inkubator med 5% CO2.
    4. Blanding Cas9 mRNA (100 ng/µL), sgRNA (50 ng/µL), og HMEJ donor vektor (100 ng/µL), og legge til H2O lydstyrken siste 10 µL. Legg blandingen på is.
    5. Trekke kapillær nåler (ytre diameter 1.0 mm indre diameter 0.78 mm med filament) bruker en brønnene avtrekker (parametere: varme, 74, trekk, 60, hastighet, 80, tidsforsinkelse /, 200, press, 300. Se tabell over materialer). Kommersielle nåler ville være en alternativ substitusjon for microinjection.
    6. Sette inn et sannsynlig volum av blandingen i cytoplasma av zygotes med godt definerte pronuclei i en dråpe HEPES-CZB middels med 5 µg/mL cytochalasin B med en microinjector konstant flyt innstillinger (figur 2A) (se Tabell over materialer)21.
      Merk: Hver gruppe med zygotes skal settes inn i 20-30 min. Cytochalasin B kan øke levedyktigheten til musen zygote etter injeksjon. Alternativt kan microinjection brukes med piezo-systemet, som beskrevet tidligere22.
    7. Kultur de injiserte zygotes KSOM medium på 37 ° C under 5% CO2 til blastocysten scenen etter 3,5 dager for fluorescens observasjon (tall 2B og 2C).
  4. Embryoer og generasjon av mus
    1. Kompis estrous ICR kvinnelige mus med vasectomized ICR mannlige mus på samme dag som injeksjon.
    2. Kultur de injiserte zygotes i 2-celle scenen på 37 ° C under 5% CO2, og overføre 25-30 2-celle embryo i oviducts av pseudopregnant ICR kvinner på 0,5 dag innlegget coitum (PPC). Mottaker mødre levere pups til 19,5 dpc.
  5. Musen genotyperingteknologi
    1. Ekstra musen genomisk DNA fra toe eller hale prøver ved en DNA utvinning kit, i henhold til produsentens instruksjoner (se Tabell for materiale).
    2. Identifisere 5' og 3 krysset banke i eventer med 200-400 ng genomisk DNA målt ved UV/vis massespektrometri som en mal til å utføre PCR-amplification.
      1. Aktivere DNA polymerase ved 95 ° C i 5 min og utføre PCR for 38 sykluser på 95 ° C for 30 s, 60 ° C for 30 s og 72 ° C i 1 min (1 min/1 kb), med en endelig utvidelse ved 72 ° C i 10 min. 5' krysset, bruke frem primer på oppstrøms av HAL med den omvendte for banke inn fragmentet (p2A-mCherry). Om 3 junction, bruk frem primer på banke inn fragmentet (p2A-mCherry), med den omvendte for nedstrøms av HAR (tabell 1).
    3. Kjøre 6 µL av PCR produktet på 1% agarose gel i 1 × TAE buffer og sjekk for forventet fragment størrelsen. Bekreft dem av DNA sekvensering (figur 2D).

3. HMEJ-basert i Vivo genomet redigering i hepatocytter

  1. Plasser mottakeren C57BL/6J mus (8 ukers) i en begrensende enhet og sette halen gjennom sprekken.
  2. Bland HMEJ donor vektorer (30 µg) og spCas9 uttrykk vektorer (30 µg) i 2 mL saltvann. Avbryte HMEJ donor vektorer (30 µg) for kontrollen eksperimentet, 2 mL saltvannsoppløsning (Figur 3A).
  3. Rengjør musen halen med 70% etanol. Sett inn nålen inn halen vene og injisere plasmider DNA løsningen innen 5-7 s. Fjern nålen og slipp musen fra begrensende enheten.
  4. Ofre mus for CO2 anestesi etter 5-9 dager etter injeksjon. Perfuse mus-transcardially med 0,9% saltvann, etterfulgt av 4% paraformaldehyde bruker en peristaltiske pumpe og fikse leveren natten på 4 ° C.
  5. Tørke vevet bruker 30% sukrose over natten, før den synker til bunnen av røret.
  6. Delen frossent på tykkelse på 10 µm for leveren prøver.
  7. Skyll avsnittene tre ganger i 0.1 M fosfat-bufret (PB) og ruge dem med primære antistoff: kanin anti-mCherry (fortynnet i 5% NGS) overnatting på 4 ° C.
  8. Vask deler tre ganger i PB, og deretter ruge dem med sekundær antistoff: Cy3-AffiniPure geit anti-kanin IgG for 2 timer ved romtemperatur på en orbital shaker.
  9. Counterstain avsnittene med DAPI for 20 min og montere med glyserin på glass lysbilder for videre fluorescens observasjon (Figur 3B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HMEJ-baserte genomet redigering i mouse embryoer: For å definere banke i effektiviteten av metoden HMEJ-basert i musen zygotes, levert vi Cas9 mRNA, sgRNA rettet mot Cdx2 genet og HMEJ donor i musen zygotes, som var utformet for å fusjonere en p2A-mCherry reporter genet til den siste codon av Cdx2 gene (figur 2A). De injiserte zygotes utviklet seg til blastocysts i kulturen. For å evaluere effektiviteten knock-i, vi analyserte mCherry fluorescens med fluorescerende mikroskop, og vi fant at 12,9% av blastocysts mottar HMEJ givere var positivt for mCherry, som var strengt uttrykt i trophectoderm (tall 2B 2 C). Med sekvensering PCR positiv mus, fant vi også at alle undersøkt integrering hendelser var presis i-ramme integreringer på både 5' og 3 veikryss (figur 2D).

HMEJ-baserte genomet redigering i voksen vev og HMEJ-mediert genterapi: For å undersøke om HMEJ-baserte genomet redigering kan brukes i voksen vev, vi satt inn mCherry kassetten rett før stopp codon av Actb genet av transducing Actb- HMEJ konstruksjoner til C57/B6J musen lever av halen blodåre etter injeksjon (Figur 3A). Etter 7 dager av injeksjoner fant vi at nesten halvparten av de transfekterte hepatocytter uttrykt mCherry som farget på leveren seksjoner (Figur 3B).

For å utforske muligheten for å bruke en HMEJ-basert strategi for genterapi, vi ansatt fumarylacetoacetate hydrolase (Fah)-mangelfull mus. Fah- / - musen er et veletablert arvelig tyrosinemia type I (HTI) musemodell, som et innsettingspunkt fragment i ekson 5 av Fah genet, forårsaker frameshift mutasjoner i følgende rekkefølge23. For å opprettholde Fah- / - mus, behandlet vi Fah- / - mus med en inhibitor av oppstrøms av tyrosin katabolske veien, 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)24. Her setter vi opp for å se om MMEJ - og HMEJ-mediert genet korreksjon kunne redde Fah mutasjon Fah- / - musen. Vi hydrodynamically injisert Cas9 konstruere Fah- MMEJ eller Fah- HMEJ konstruksjoner, designet for å sette inn Fah cDNA av ekson 5 til 14 i intron 4 av Fah genet, Fah - / - mus () lever Figur 3 C). en uke etter injeksjon, NTBC ble trukket tilbake for å indusere leverskader (Figur 3C). Etter tilbaketrekning av NTBC, Fah-korrigert hepatocytter av Fah- / - mus Fah- HMEJ og Cas9 konstruksjoner viste mer effektiv spredning enn MMEJ-basert metode (Figur 3D ).

Figure 1
Figur 1 : HMEJ-mediert målrettet integrering i vitro.
(A) eksperimentelle ordningen for valg av sgRNAs: seks ulike sgRNAs (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6) rundt stopp codon av Cdx2 locus med en høyere rang og off-målet potensial var valgt basert på online CRISPR design verktøyet. Protospacer tilstøtende motiv (PAM) sekvensen er i rødt. (B) eksperimentell design: The Cas9-CMV-GFP uttrykk plasmider uttrykke sgRNA, Cas9 og GFP ble introdusert i N2a celler. GFP+ celler er sortert på dag 3 for landmåler analysen. (C) landmåler analysen for Cdx2 målretting: 6 forskjellige sgRNAs ble utformet for landmåler analysen. Normal N2a celle genomisk DNA fungerer som kontroll. *, sgRNA brukes for Cdx2-2A-mCherry bank i eksperimentet. (D) skjematisk oversikt over byggingen av HMEJ givere bruker Gibson samling. (E) skjematisk oversikt over HMEJ-mediert genet målrette strategi på Cdx2 locus. HAL/HAR, venstre/høyre homologi arm. trekanter, sgRNA målområder; AV / OR ytre forover/bakover grunning; Hvis / IR, indre forover/bakover grunning. Figur endret fra forrige rapport10Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Genomet redigering i mouse embryoer via HMEJ-mediert målrettet integrering
(A) eksperimentelle ordningen med microinjection: en blanding av Cas9 mRNA (100 ng/µL), sgRNA (50 ng/µL) og donor plasmider (100 ng/µL) ble injisert i musen zygotes. (B) representant fluorescens bilder av mouse embryoer redigert av HMEJ strategi. Bar, 20 µm. (C) Knock-i effektivitet angitt av andelen mCherry+ blastocysts. Tall over hver bar, totalt blastocysts regnet. (D) sekvens analyse av genet redigert mus ved Cdx2 locus. PCR produkter forsterket fra 5' og 3 krysset nettsteder var sekvensielt. Øvre, homologi arm. lilla, p2A; rød, mCherry; HAR eller HAL, høyre eller venstre homologe arm. Stiplede linjer markerer regionen utelatt for klarhet. Figur endret fra forrige rapport10Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : HMEJ-mediert målrettet integrering i vivo.
(A) skjematisk oversikt over etter halen blodåre injeksjon. En blanding av plasmider uttrykke donor sekvens og sgRNA og plasmider uttrykke spCas9 ble levert til leveren via etter halen blodåre injeksjon. (B) representant immunofluorescence bilder av hepatocytter. Leveren delene var samlet 7 dager innlegget injeksjon. Skala bar, 50 µm. GFP, transfekterte celler. (C) plasmider enten MMEJ - eller HMEJ-mediert genet erstatning strategi utformet for å sette inn Fah cDNA av ekson 5 til 14 i intron 4 av Fah genet ble levert i Fah- / - mus lever av etter injeksjon. NTBC på: Fah- / - mus ble holdt på NTBC vann. NTBC av: tilbaketrekking av NTBC vann (første dag av NTBC tilbaketrekking var definert som dagen 0, som er 7 dagen etter injeksjon). (D) Fah immunohistochemistry farging av leveren deler fra Fah- / - mus injisert med MMEJ eller HMEJ plasmider. Skala bar, 100 µm. figur endret fra tidligere rapporter5,10Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De viktigste trinnene i konstruksjonen av HMEJ donor plasmider er: (1) utvalg av sgRNA med høy DNA cleavage effektivitet og lave avstanden mellom sgRNA kutte området og stoppe codon, og (2) riktige bygging av HMEJ donor. CRISPR/Cas9-mediert cleavage på begge transgene donor vektor (inneholder sgRNA målområder og ~ 800 bp homologi armene) og målrettet genom er nødvendig for effektiv og presis målrettet integrering i vivo. De viktigste trinnene av generasjon av banker i mus med metoden HMEJ-baserte er: (1) utarbeidelsen av høykvalitets Cas9 mRNA og sgRNA (ingen degenerasjon finnes i Cas9 mRNA og sgRNA), og (2) utarbeidelse av høykvalitets HMEJ donor plasmider. Plasmider viser ingen toksiske effekter på embryonale utvikling.

Nylig, en NHEJ-basert metode også blitt rapportert for effektiv i vivo genomet redigering8. Likevel, ulike typer indel mutasjoner ble vanligvis indusert ved veikryss, som beskrevet i tidligere rapporter8gjør det vanskelig å oppnå presis integrasjon. Her, viste den HMEJ-basert strategien som vi beskrev ovenfor nøyaktig målrettet integrasjon med nesten ingen indel mutasjoner. Således, en HMEJ-basert strategi kan være en ideell plattform for å erstatte en mutert sekvens (for eksempel en punkt mutasjon) med det korrekte ettall, som ikke gjelder for NHEJ-basert metode.

Mosaicism er et stort problem for genet redigering i embryoer. Injeksjon av Cas9 protein i stedet for mRNA på en tidligere gryende scenen kan oppnå transgene banke i én celle trinn uten mosaicism. For klinisk bruk er levering av CRISPR/Cas9 i voksen vev fortsatt utfordrende.

Det er mange fremtidige potensielle bruker av HMEJ-baserte genomet redigering. Den kan brukes til å generere genmodifiserte dyr modeller. Vurderer sin høye banke i effektivitet i embryoer, denne metoden kan redusere hvor dyr nødvendig for genmodifiserte dyr modeller, og åpner spesielt muligheten for ikke-menneskelige primas genetisk modeller. HMEJ-baserte genomet redigering kan linjen spore individuelle celletyper i voksen vev, som er spesielt nyttig for dyr modeller, siden det er en mangel på tilgjengelig dyr modeller, som ikke-menneskelige primater. Den kan brukes for målrettet gene terapi: mest attraktive anvendelsen av en HMEJ-basert strategi er genterapi for klinikk bruker. I denne studien vi rettet Fah mutasjon av arvelige tyrosinemia type jeg mus ved etter injeksjon av angitte vektorer. Levering av CRISPR/Cas9 i voksen vev er imidlertid fortsatt stor teknisk utfordring for klinisk bruk, etter injeksjon er usannsynlig å utføres hos pasienter. Foreløpig er ytterligere forbedring av levering strategien presserende nødvendig før oversette denne HMEJ-basert metode til klinikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av CAS strategiske prioritet Research Program (XDB02050007, XDA01010409), den nasjonale Hightech R & D Program (863 Program, 2015AA020307), National Natural Science Foundation i Kina (NSFC gir 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), Kina ungdom tusen talenter Program (til HY), Break gjennom prosjektet av kinesiske Academy of Sciences, prosjekt Shanghai byen komité for vitenskap og teknologi (16JC1420202 til HY), departementet for vitenskap og teknologi i Kina (de fleste; 2016YFA0100500).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pX330 Addgene 42230
pAAV vector Addgene 37083
pX260 Addgene 42229
AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 Addgene 97307 AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter
AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA Addgene 97308 HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone.
AAV_Cdx2 HMEJ donor Addgene 97319 HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. 
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Life Technology L3000015
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9930
Bbs I New England Biolabs R0539S
NEB Buffer 2 New England Biolabs B7002S
T7 endonuclease I New England Biolabs M0302L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs E2621L
Plasmid EndoFree-Midi Kit Qiagen 12143
MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA Life Technologies AM1345
MEGACLEAR KIT 20 RXNS Life Technologies AM1908
MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS Life Technologies AM1354
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97  Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300)
Borosilicate glass Sutter Instrument B100-78-10 type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) 
FemtoJet microinjector Eppendorf
Freezing microtome Leica CM1950-Cryostat thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver
Rabbit anti-mCherry GeneTex
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG Jackson Immunoresearch
DMEM Gibco 11965092
FBS Gibco 10099141
NEAA Gibco 11140050
Pen,Strep,Glutamine Gibco 10378016
Gel Extraction Kit Omega D2500-02
FACS BD AriaII
PMSG Ningbo Sansheng Medicine S141004
HCG Ningbo Sansheng Medicine B141002
Cytochalasin B Sigma CAT#C6762
KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red Millipore CAT#MR-106-D
M2 Medium with Phenol Red Millipore CAT#MR-015-D
Mineral oil Sigma

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yang, H., et al. Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 154, (6), 1370-1379 (2013).
  2. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29, (8), 731-734 (2011).
  3. Nakade, S., et al. Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9. Nature Communications. 5, 5560 (2014).
  4. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
  5. Yao, X., et al. Cas9 - Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms. EBioMedicine. (2017).
  6. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome research. 24, (1), 142-153 (2014).
  7. Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Research. 23, (3), 539-546 (2013).
  8. Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 540, (7631), 144-149 (2016).
  9. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, (6121), 819-823 (2013).
  10. Yao, X., et al. Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9. Cell Research. 27, (6), 801-814 (2017).
  11. Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells. Nature Cell Biology. 13, (1), 66-71 (2011).
  12. Han, D. W., et al. Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors. Cell Stem Cell. (2012).
  13. Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9, (2), 113-118 (2011).
  14. Sparman, M., et al. Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates. Stem Cells. 27, (6), 1255-1264 (2009).
  15. Schatten, G., Mitalipov, S. Developmental biology: Transgenic primate offspring. Nature. 459, (7246), 515-516 (2009).
  16. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31, (9), 827-832 (2013).
  17. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339, (6121), 819-823 (2013).
  18. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, (1), 92 (2017).
  19. Park, K. E., et al. Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins. International journal of molecular sciences. 217, (6), (2016).
  20. Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature biotechnology. 33, (11), 1162-1164 (2015).
  21. Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).
  22. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature protocols. 9, (8), 1956-1968 (2014).
  23. Grompe, M., et al. Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice. Genes & development. 7, (12), 2298-2307 (1993).
  24. Paulk, N. K., et al. Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo. Hepatology. 51, (4), 1200-1208 (2010).

Erratum

Formal Correction: Erratum: CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy
Posted by JoVE Editors on 03/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. The phrases "surveyor assay" and "Surveyor Nuclease" have been updated to "T7E1 assay"  to " T7 endonuclease I" respectively. 

Step 1.2 in the Protocol has been updated from:

  1. Surveyor nuclease assay of sgRNA
    NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by surveyor nuclease assay (also known as T7 endonuclease I (T7EI) assay)17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.

to:

  1. T7 endonuclease assay of sgRNA
    NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by T7 endonuclease (T7EI) assay17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.

Figure 1 in the Representative Results has been updated from:

Figure 1
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro.
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for surveyor assay. (C) Surveyor assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for surveyor assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 1
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro.
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for T7EI assay. (C) T7EI assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for T7EI assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10Please click here to view a larger version of this figure.

CRISPR/Cas9-mediert målrettet integrering <em>i Vivo</em> med en homologi-mediert slutten begynte-basert strategi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yao, X., Wang, X., Liu, J., Shi, L., Huang, P., Yang, H. CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy. J. Vis. Exp. (133), e56844, doi:10.3791/56844 (2018).More

Yao, X., Wang, X., Liu, J., Shi, L., Huang, P., Yang, H. CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy. J. Vis. Exp. (133), e56844, doi:10.3791/56844 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter