Summary

CRISPR/Cas9-medieret målrettede Integration In Vivo ved hjælp af en homologi-medieret End at deltage-baseret strategi

Published: March 12, 2018
doi:

Summary

De grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentager/CRISPR forbundet protein 9 (CRISPR/Cas9) system giver et lovende redskab for genteknologi, og åbner op for muligheden for målrettede integration af transgener. Vi beskriver en homologi-medieret ende sammenføjning (HMEJ)-baseret strategi for effektiv DNA målrettet integration i vivo og målrettet genterapier bruger CRISPR/Cas9.

Abstract

Som en lovende genom redigering platform har CRISPR/Cas9-systemet et stort potentiale for effektiv genetisk manipulation, især for målrettede integration af transgener. Men på grund af den lave effektivitet af homologe rekombination (HR) og forskellige indel mutationer af ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ)-baserede strategier i ikke-dividere celler, i vivo genom-redigering er fortsat en stor udfordring. Her, vi beskriver en homologi-medieret ende sammenføjning (HMEJ)-baseret CRISPR/Cas9 system til effektiv i vivo præcist målrettede integration. I dette system, de målrettede genom og donor vektor indeholdende homologi arme (~ 800 bp) flankeret af enkelt guide RNA (sgRNA) mål sekvenser er kløvet af CRISPR/Cas9. Denne HMEJ-baseret strategi opnår effektiv transgen integration i mus zygotes samt i hepatocytter i vivo. Desuden en HMEJ-baseret strategi tilbyder en effektiv tilgang til korrektion af fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation i hepatocytter og redder Fah-vitaminmangel induceret leversvigt mus. Taget sammen, med fokus på målrettet integration, denne HMEJ-baseret strategi giver et lovende redskab for en bred vifte af applikationer, herunder generation af genetisk modificerede dyremodeller og målrettede genterapier.

Introduction

Præcise, målrettede genom-redigering er ofte påkrævet for at producere genetisk modificerede dyremodeller og kliniske behandlinger. Stor indsats er gjort at udvikle forskellige strategier for effektiv målrettede genom-redigering, såsom zink nukleasen (ZFN), transkription aktivere-lignende effektor nukleaser (TALENs), og CRISPR/Cas9 systemer. Disse strategier skabe målrettede DNA dobbelt-strenget pauser (DSB) i genomet, og drage fordel af iboende DNA reparation systemer, såsom homologe rekombination (HR)1,2, microhomology-medieret ende sammenføjning (MMEJ)3 , 4 , 5, og ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ)6,7,8 for at fremkalde målrettede integration af transgener1,9. Den HR-baseret strategi er i øjeblikket mest almindeligt anvendte genom-redigering tilgang, som er meget effektiv i cellelinjer, men ikke let tilgængelige for ikke-dividere celler på grund af dens begrænsede forekomst i den sene S/G2 fase. Således, den HR-baseret strategi er ikke gældende for i vivo genom-redigering. For nylig, den NHEJ-baseret strategi er udviklet til effektiv gen banke i i mus væv8. Ikke desto mindre, den NHEJ-baseret metode normalt introducerer indels på vejkryds, hvilket gør det vanskeligt at generere præcis genom-redigering, især når de forsøger at konstruere i-frame fusion gener8. MMEJ-baserede målrettede integration er i stand til præcis genom-redigering. Det øger dog kun beskedent målrettede integration effektiviteten i tidligere rapporter5. Derfor, effektivisering af præcist målrettede integration i vivo er bydende nødvendigt for bred terapeutisk anvendelse3.

I en nyligt offentliggjort arbejde, vi viste en homologi-medieret ende sammenføjning (HMEJ)-baseret strategi, som viste den højeste målrettede integration effektivitet i alle rapporterede strategier både in vitro- og i vivo10. Her, vi beskriver en protokol om oprettelse af HMEJ systemet, og også opførelsen af single-guide RNA (sgRNA) vektorer målretning gen af interesse og donor vektorer husly sgRNA målwebsteder og ~ 800 bp homologi våben (figur 1) . I denne protokol beskriver vi også de detaljerede trin til generering af DNA knock-i mus og korte trin for målrettede integration i væv i vivo. Desuden viste en proof of concept undersøgelse af HMEJ-baseret strategien sin evne til at korrigere Fah mutation og redde Fah– / – leveren manglende mus, som yderligere afslørede dets terapeutiske potentiale.

Protocol

Alle procedurer, herunder animalske emner er blevet godkendt af den biomedicinske forskning etiske komité på Shanghai institutter for biologisk videnskab (CAS). 1. design af Donor plasmider Valg af sgRNA Brug online CRISPR design værktøj til at forudsige sgRNAs på den indskyde region11,12,13,14,1…

Representative Results

HMEJ-baseret genom-redigering i mus embryoner: Hvis du vil definere knock-i effektiviteten af HMEJ-baseret metode i mus zygotes, leverede vi Cas9 mRNA, sgRNA rettet mod Cdx2 -gen og HMEJ donor til musen zygotes, som var designet til at lunte en p2A-mCherry reporter gen til den sidste codon af Cdx2 gen (figur 2A). De injicerede zygotes udviklet sig til blastocyster i kulturen. For at evaluere overvågningsakt…

Discussion

De mest afgørende skridt i opbygningen af HMEJ donor plasmider er: (1) valg af sgRNA med høj DNA kavalergang effektivitet og lave afstand mellem sgRNA skæring websted og stop codon, og (2) en korrekt opførelse af HMEJ donor. CRISPR/Cas9-medieret kavalergang på begge transgen donor vektor (indeholdende sgRNA målwebsteder og ~ 800 bp homologi våben) og målrettede genom er nødvendige for effektivt og præcist målrettede integration in vivo. De mest kritiske trin i generation af knock-i mus ved hjælp af H…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af CAS strategiske prioritet Research Program (XDB02050007, XDA01010409), den nationale Hightech R & D Program (863 Program; 2015AA020307), National Natural Science Foundation of China (NSFC tilskud 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), Kina ungdom tusinde talenter Program (til HY), bryde gennem projektet af kinesiske Academy of Sciences, projekt Shanghai City Udvalget for videnskab og teknologi (16JC1420202 til HY), Ministeriet for videnskab og teknologi i Kina (de fleste; 2016YFA0100500).

Materials

pX330 Addgene 42230
pAAV vector Addgene 37083
pX260 Addgene 42229
AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 Addgene 97307 AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter
AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA Addgene 97308 HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone.
AAV_Cdx2 HMEJ donor Addgene 97319 HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. 
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Life Technology L3000015
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9930
Bbs I New England Biolabs R0539S
NEB Buffer 2 New England Biolabs B7002S
T7 endonuclease I New England Biolabs M0302L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs E2621L
Plasmid EndoFree-Midi Kit Qiagen 12143
MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA Life Technologies AM1345
MEGACLEAR KIT 20 RXNS Life Technologies AM1908
MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS Life Technologies AM1354
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97  Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300)
Borosilicate glass Sutter Instrument B100-78-10 type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) 
FemtoJet microinjector Eppendorf
Freezing microtome Leica CM1950-Cryostat thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver
Rabbit anti-mCherry GeneTex
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG Jackson Immunoresearch
DMEM Gibco 11965092
FBS Gibco 10099141
NEAA Gibco 11140050
Pen,Strep,Glutamine Gibco 10378016
Gel Extraction Kit Omega D2500-02
FACS BD AriaII
PMSG Ningbo Sansheng Medicine S141004
HCG Ningbo Sansheng Medicine B141002
Cytochalasin B Sigma CAT#C6762
KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red Millipore CAT#MR-106-D
M2 Medium with Phenol Red Millipore CAT#MR-015-D
Mineral oil Sigma

References

  1. Yang, H., et al. Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  2. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
  3. Nakade, S., et al. Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9. Nature Communications. 5, 5560 (2014).
  4. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
  5. Yao, X., et al. Cas9 – Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms. EBioMedicine. , (2017).
  6. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).
  7. Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).
  8. Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).
  9. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  10. Yao, X., et al. Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9. Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).
  11. Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells. Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).
  12. Han, D. W., et al. Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors. Cell Stem Cell. , (2012).
  13. Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
  14. Sparman, M., et al. Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates. Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).
  15. Schatten, G., Mitalipov, S. Developmental biology: Transgenic primate offspring. Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).
  16. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  17. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  18. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
  19. Park, K. E., et al. Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins. International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).
  20. Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
  21. Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).
  22. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  23. Grompe, M., et al. Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice. Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).
  24. Paulk, N. K., et al. Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo. Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).

Play Video

Cite This Article
Yao, X., Wang, X., Liu, J., Shi, L., Huang, P., Yang, H. CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy. J. Vis. Exp. (133), e56844, doi:10.3791/56844 (2018).

View Video