Summary

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

Published: March 12, 2018
doi:

Summary

Die gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR verbundenen Protein 9 (CRISPR/Cas9) System bietet ein viel versprechendes Instrument für Gentechnik und eröffnet die Möglichkeit, gezielte Integration der transgene. Wir beschreiben eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basierte Strategie für effiziente DNA Integration in Vivo gezielte und gezielte Gentherapien verwenden CRISPR/Cas9.

Abstract

Als eine viel versprechende Genom-editing-Plattform hat das CRISPR/Cas9 System großes Potential für effiziente Genmanipulation, vor allem für die gezielte Integration von transgenen. Aufgrund der geringen Effizienz der homologen Rekombination (HR) und verschiedenen Indel Mutationen von nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ)-basierte Strategien in nicht-teilenden Zellen, in Vivo Genom Bearbeitung bleibt eine große Herausforderung. Hier beschreiben wir eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basiertes CRISPR/Cas9 System zur effizienten in Vivo präzise gezielte Integration. In diesem System, das gezielte Genom und der Spender Vektor mit Homologie Arme (~ 800 bp) flankiert von einzelnen Guide RNA (SgRNA) Ziel Sequenzen sind durch CRISPR/Cas9 gespalten. Diese HMEJ-basierte Strategie erzielt effiziente Transgen Integration in Maus Zygoten sowie in Hepatozyten in Vivo. Darüber hinaus eine HMEJ-basierte Strategie bietet einen effizienten Ansatz zur Korrektur von Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Mutation in den Hepatozyten und rettet Fah-Mangel induziert Leberversagen Mäuse. Zusammen genommen, mit Schwerpunkt auf Integration ausgerichtet, diese HMEJ-basierte Strategie bietet ein viel versprechendes Instrument für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Erzeugung von gentechnisch veränderten Tiermodelle und gezielte Gentherapien.

Introduction

Präzise, gezielte Genom-Bearbeitung ist oft für die Herstellung gentechnisch veränderter Tiermodellen und klinischen Therapien erforderlich. Viel Anstrengungen unternommen worden, um verschiedene Strategien für effiziente zielgerichtete Genom bearbeiten, wie z. B. Zink Nuklease (ZFN), Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen (TALENs) und CRISPR/Cas9 Systeme. Diese Strategien gezielte DNA-Doppel-Strangbrüchen (DSB) im Genom zu erstellen und profitieren Sie von inneren DNA-Reparatursysteme, wie homologe Rekombination (HR)1,2, Microhomology-vermittelte Ende verbinden (MMEJ)3 , 4 , 5und nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ)6,7,8 , gezielte Integration der transgene1,9zu induzieren. Die HR-Strategie ist derzeit die am häufigsten verwendeten Genom Bearbeitung Ansatz, der in Zell-Linien sehr effizient, aber nicht teilenden Zellen aufgrund seines beschränkten Auftretens in der Spätphase der S/G2 nicht ohne weiteres zugänglich ist. Der HR-Strategie gilt somit nicht für in Vivo Genom-Bearbeitung. Vor kurzem wurde die Grundstrategie des NHEJ für effiziente gen-Knock-in Maus Gewebe8entwickelt. Dennoch stellt die NHEJ-basierte Methode in der Regel Indels an den Verbindungsstellen, macht es schwierig, präzise Genom-Bearbeitung, vor allem wenn Sie versuchen, im Rahmen Fusion Gene8konstruieren zu generieren. MMEJ-basierte gezielte Integration ist in der Lage, präzise Genom-Bearbeitung. Es erhöht jedoch nur in bescheidenem Maße die gezielte Integration Effizienz in vorherigen Berichten5. Verbesserung der Effizienz der präzise gezielte Integration in Vivo ist daher für breite therapeutische Anwendungen3dringend erforderlich.

In einer kürzlich veröffentlichten Arbeit zeigten wir eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basierte Strategie, die die höchste Effizienz der gezielte Integration in alle gemeldeten Strategien sowohl in Vitro und in Vivo10zeigte. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Einrichtung des HMEJ Systems, und auch der Bau der Einzel-Guide RNA (SgRNA) Vektoren gezielt das gen des Interesses und des Spenders Vektoren beherbergen SgRNA Ziel-Sites und ~ 800 bp Homologie Wappen (Abbildung 1) . In diesem Protokoll erläutern wir im folgenden die einzelnen Schritte zur Erzeugung von DNA-Knock-in Mäusen und kurze Schritte für die gezielte Integration in Geweben in Vivo. Darüber hinaus zeigte eine Proof-of-Concept-Studie über die HMEJ-basierte Strategie seine Fähigkeit, Fah Mutation zu korrigieren und Fah– / – Leber Versagen Mäuse, die weiter seine therapeutische Potenzial offenbart zu retten.

Protocol

Alle Verfahren einschließlich tierische Themen wurden von der biomedizinischen Forschung-Ethik-Kommission der Shanghai Institute für biologische Wissenschaften (CAS) genehmigt. 1. Aufbau des Spenders Plasmide Auswahl des sgRNA Verwenden Sie Online-CRISPR-Design-Tools SgRNAs am Ziel Region11,12,13,14,<sup class="xref"…

Representative Results

HMEJ-basierte Genom-Bearbeitung in Mausembryonen: Um die Effizienz Knock-in der HMEJ-basierte Methode Maus Zygoten definieren, lieferten wir Cas9 mRNA, SgRNA gezielt das Gen Cdx2 und der HMEJ Spender in Maus Zygoten, die entworfen wurde, um ein Reportergen p2A-mCherry zu den letzten Codon Cdx2 Sicherung gen (Abbildung 2A). Die injizierten Zygoten entwickelte sich zu Blastozysten in der Kultur. Um die Knock-i…

Discussion

Die wichtigsten Schritte beim Bau von HMEJ Spender Plasmide sind: (1) Wahl des SgRNA mit hoher DNA Spaltung Effizienz und geringe Abstand zwischen SgRNA schneiden Website und Stopp-Codon und (2) die ordnungsgemäße Errichtung der HMEJ Spender. CRISPR/Cas9-vermittelte Spaltung auf beide Transgen-Spender-Vektor (mit SgRNA-Ziel-Sites und ~ 800 bp Homologie Arme) und gezielte Genom ist notwendig für eine effiziente und präzise gezielte Integration in-vivo. Die wichtigsten Schritte der Generation von Knock-in Mäu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch CAS strategische Priorität Research Program (XDB02050007, XDA01010409), der nationalen Hightech-R & D-Programm (863 Programm; 2015AA020307), der National Natural Science Foundation of China (NSFC Zuschüsse, 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), China Youth tausend Talente Programm (HY), Pause durch Projekt der chinesischen Akademie der Wissenschaften, Projekt Shanghai City Committee von Wissenschaft und Technik (16JC1420202, HY), das Ministerium of Science and Technology of China (die meisten; 2016YFA0100500).

Materials

pX330 Addgene 42230
pAAV vector Addgene 37083
pX260 Addgene 42229
AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 Addgene 97307 AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter
AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA Addgene 97308 HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone.
AAV_Cdx2 HMEJ donor Addgene 97319 HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. 
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Life Technology L3000015
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9930
Bbs I New England Biolabs R0539S
NEB Buffer 2 New England Biolabs B7002S
T7 endonuclease I New England Biolabs M0302L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs E2621L
Plasmid EndoFree-Midi Kit Qiagen 12143
MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA Life Technologies AM1345
MEGACLEAR KIT 20 RXNS Life Technologies AM1908
MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS Life Technologies AM1354
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97  Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300)
Borosilicate glass Sutter Instrument B100-78-10 type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) 
FemtoJet microinjector Eppendorf
Freezing microtome Leica CM1950-Cryostat thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver
Rabbit anti-mCherry GeneTex
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG Jackson Immunoresearch
DMEM Gibco 11965092
FBS Gibco 10099141
NEAA Gibco 11140050
Pen,Strep,Glutamine Gibco 10378016
Gel Extraction Kit Omega D2500-02
FACS BD AriaII
PMSG Ningbo Sansheng Medicine S141004
HCG Ningbo Sansheng Medicine B141002
Cytochalasin B Sigma CAT#C6762
KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red Millipore CAT#MR-106-D
M2 Medium with Phenol Red Millipore CAT#MR-015-D
Mineral oil Sigma

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Yao, X., Wang, X., Liu, J., Shi, L., Huang, P., Yang, H. CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy. J. Vis. Exp. (133), e56844, doi:10.3791/56844 (2018).

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