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Medicine

Verbesserung der einen geschlossenen Kasten porcinen Myokardinfarkt Modell durch Standardisierung der Gewebe und Blut Stichprobenverfahren

doi: 10.3791/56856 Published: March 12, 2018

Summary

Hier zeigen wir ein Protokoll zur Stichprobenverfahren eine etablierte porcinen Modell der akuten Myokardinfarkt zu standardisieren, um der translationalen Wertsteigerung für das Verständnis der Pathophysiologie der myokardialen Ischämie/Reperfusion Verletzungen und neuartige Medikamenten-Kandidaten zu testen.

Abstract

Myokardiale Ischämie Reperfusion (ich / R) Verletzung trägt fast die Hälfte der nekrotischen Bereich nach Myokardinfarkt. Bisher gibt es kein zugelassenes Medikament zur Verhinderung oder Reduzierung myokardialen ich / R Verletzungen. Das Studium und Verständnis der pathophysiologischen Mechanismen der myokardialen ich / R Verletzung ist wesentlich für die erfolgreiche Behandlungen zu entwickeln. Großen Tierversuche sind ein wichtiger Schritt in translational Methoden. Das porcinen Modell eines akuten Myokardinfarkts wurde gegründet und von uns selbst und andere beschrieben. Wir wollten den Wert des Modells weiter zu verbessern, indem Sie im Detail auf die Sampling-Techniken für den Einsatz in weiteren Untersuchungen. Darüber hinaus legen wir Wert auf kleine, aber wichtige Schritte, die die Qualität der Ergebnisse beeinflussen können. Um die klinische Situation der myokardialen imitieren ich / R Verletzungen, eine perkutane Koronarintervention (PCI)-Katheter in der linken vorderen absteigenden Koronararterie (LAD) von einem narkotisierten Schwein eingefügt wurde. ° ° ° Dieses Modell ahmt akutem Myokardinfarkt und PCI-Behandlung bei Menschen mit der Möglichkeit der genauen Bestimmung den Bereich am Risiko sowie die Nekromanten- und tragfähige ischämischen Gewebe. Hier wurde das Modell zur Untersuchung der Wirkung von einem bicyclischen Peptid-Inhibitor der FXIIa. Das Modell kann auch geändert werden, um die Reperfusion länger um später Myokardinfarkt untersuchen zu lassen.

Introduction

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Ischämischer Herzkrankheit, insbesondere akuten Myokardinfarkt (MI), ist die häufigste Todesursache in Industrieländern 1. Heute ist die Standardbehandlung der MI perkutane Koronarintervention (PCI), die Ballon-Katheter-Behandlung. Einer der kritischen Faktoren, die Qualität des Lebens betrifft und Prognose von Patienten nach PCI-behandelten akuten MI ist die Infarkt-Größe. Die Verringerung der Größe haben einen großen Einfluss auf Patienten überleben und Prognose 2. Myokardiale Ischämie/Reperfusion (ich / R) Verletzung hat einen wesentlichen Einfluss auf die Größe des Infarktes, so ist eines der wichtigsten Ziele in der Herz-Kreislauf-Forschung zur Verhinderung oder Reduzierung myokardialen ich / R Verletzungen 3. Die genauen Mechanismen der I / R Verletzungen sind noch in der Untersuchung 4. Aktivierung des Plasma-Kaskaden und Endothelzellen sind Markenzeichen von I / R Verletzungen 5. Aktivierung des Systems der Koagulation ist deutlich mit 6,7. Vor kurzem hat die Rolle des FXII, als einen frühen vorgelagerten Peptid beteiligt Kontaktphase Aktivierung der Gerinnung Kaskade in eine FXII gezeigt Knock-out Rattenmodell der zerebralen ich / R Verletzungen 8. Validierung der Ergebnisse in einem porcinen Modell ist ein wichtiger Schritt in die klinische Übersetzung. Daher testen wir ein neuartiges bicyclischen (80 kDa) FXIIa Proteasehemmer im Zusammenhang mit der Myokardinfarkt ich / R Verletzungen in einer Pilotstudie.

Tiermodellen, die die klinische Situation der akuten MI und PCI-Behandlungen zu imitieren, sind unerlässlich, um unser Verständnis der Pathophysiologie der myokardialen ich verbessern / R Verletzungen und neuartige Behandlungsmöglichkeiten zu testen. Schweine sind eine gute Tiermodell für klinische myokardialen ich / R Verletzungen. Dies ist nicht nur, weil ihre Herzen sehr ähnlich zu den Herzen der Menschen in Bezug auf Anatomie und Herz-Kreislauf sind, sondern sie auch ähnliche pathophysiologische Reaktionen auf myokardiale Ischämie und Reperfusion 9,10 zeigen. Andere Modelle wie Ratten und Mäuse nicht erfüllen diese Kriterien und zeigen erhebliche Unterschiede im Vergleich zu den Herzen der Menschen 11,12, während Hunde zum Beispiel viele weitere Sicherheiten Herzkranzgefäße im Vergleich zu Menschen haben 13.

Porcines akutem Myokardinfarkt-Modell ist am meisten benutzt in der Herz-Kreislauf-Forschung zu ischämischen Herzkrankheiten einschließlich myokardialen untersuchen ich / R Verletzungen 14,15,16,17. Letzteres ist eine entzündliche Erkrankung, die durch die Minimierung die entzündliche Reaktion im Zusammenhang mit Sternotomie oder Thorakotomie verwendet in offenen Thoraxchirurgie ist unerlässlich. Der geschlossene Kasten Modell mit einer klinischen C-Bogen-Angiographie-Einstellung überwindet dieses Problem. Darüber hinaus ist einer der wichtigsten Punkte, dass unser Protokoll eine genaue Unterscheidung zwischen ischämischen (gefährdet, AAR) und nicht-ischämische Bereiche des linken Ventrikels (Bereich nicht gefährdet, ANR), bietet so dass die Infarkt-Größe (nekrotische ischämischen Gewebe, NIT) kann werden Sie genau bestimmt. Unser Ziel für dieses Papier ist, klar zu definieren, eine reproduzierbare Methodik von einem porcinen myokardialen ich / R Verletzungen zu modellieren, insbesondere in Bezug auf Herzmuskelgewebe Probenahme, wodurch für eine genauere Analyse der molekularen Mechanismen von I / R Verletzungen und eine klareres Bild von den Auswirkungen der neuartige medikamentöse Behandlungen.

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Protocol

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(1) Tiere:

Alle Tiere wurden nach den Richtlinien der Schweizer nationalen Gesetze behandelt. Die Studie wurde von der lokalen Tierversuche-Ausschuss des Kantons Bern genehmigt (Erlaubnis keine. WERDEN SIE 25/16).

Verwenden Sie große weiße Schweine beider Geschlechter (~ 30 ± 5 kg). Die Tiere blind in zwei Gruppen aufteilen einer Gruppe ein bicyclischen (80 kDa) Proteasehemmer von FXIIa oder Behandlung der Wahl und der andere ein inaktives Steuerelement empfangen.

2. chirurgische Verfahren (Abbildung 1)

  1. Anästhesie und Vorbereitung des Tieres:
    1. Schnell die Tiere für 12 h vor Beginn des Experiments.
    2. Vorab behandeln Sie das Tier mit 20 mg/kg Ketamin und 2 mg/kg Xylazin über eine intramuskuläre Injektion in den Hals, mit einer 10 mL Spritze. Notieren Sie das Tier Gewicht und Geschlecht.
    3. Narkose durch die Injektion von 0,5 mg/kg Midazolam und 0,05 mg/kg Atropin in die Ohrmuschel Vene zu induzieren. Das Tier mit einem Endotrachealtubus Intubation.
    4. Aufrechterhaltung die Narkose durch Beatmung mit einem Beatmungsgerät (O2/air 1:3, Sevorane 1,5 %), ein 7-8 mm Atemwege Rohr und einen Filter. Passen Sie den Bruchteil der inspiriert Sauerstoff (FiO2) auf 35 % und das Atemvolumen auf 6 bis 10 mL/kg.
    5. Tiefe der Narkose wird in Abwesenheit von motor oder vegetative Reaktionen auf Nase kneifen als angemessen beurteilt. Palpebrale Reflexe und Kiefer Ton wurden überwacht kontinuierlich sowie targeting entspannter Kiefer Ton und fehlender palpebrale Reflexe. Kerntemperatur wurde kontinuierlich überwacht und Wartung der Normothermie (38-38,5 ° C) sorgte mit passiven Erwärmung (Decken und warme Flaschen zu isolieren).
    6. Frei, wie zuvor beschrieben von Koudstaal und seine Kollegen Schritte 3: 1 3: 3-18, die Halsschlagadern auf beiden Seiten zu sezieren und cannulate sie mit einem 7F Mantel. Cannulate der linken Halsschlagader mit einem 7F Mantel für venöse Blutentnahme.
    7. Verwalten Sie eine Bolusdosis von 250 µg Fentanyl Schmerzmittel durch den zentralen Venenkatheter, gefolgt von 250 µg/h als intravenöse Dauerinfusion über eine Infusionspumpe. Körpertemperatur, Herzfrequenz und Rhythmus mit einer 3-adrige Elektrokardiogramm (EKG), arteriellen und zentralen Venendrucks während des gesamten Experiments zu überwachen.
    8. Verwenden standard Blutentnahmeröhrchen, entziehen den Venenkatheter die folgenden Grundlinie Blutproben: 5 mL citrated Plasma und 2,9 mL EDTA-Plasma in die jeweiligen Röhren. Zentrifugieren Sie sofort bei 2.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Nehmen Sie 2,9 mL Blut in ein Serum Röhrchen und lassen für 30 min bei Raumtemperatur gerinnen vor Zentrifugation wie oben beschrieben.
    9. Aliquoten 200 µL Plasma oder Serum in 500 µL Rohre und alle Proben bei-80 ° C für weitere Analysen zu speichern.
    10. Ziehen Sie 0,5 mL Blut aus dem arteriellen Linie mit speziellen Blut-Gas-Analyse (BGA) Spritzen zur Messung der BGA mit der BGA-Maschine gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    11. Der Venenkatheter mit einer standard 2-mL-Spritze 0,5 mL Blut entziehen und sofort in die ACT-Patrone mit einer 30 G-Nadel zu übertragen. Legen Sie die gefüllte Patrone in die ACT-Maschine zur Messung der Gerinnungszeit nach den Anweisungen des Herstellers. Siehe Abbildung 2 für Zeitpunkte.
    12. Verabreichen Sie 5000 IU fraktioniertem Heparin in den Venenkatheter mit einer 2 mL Spritze und lassen Sie das Tier zu stabilisieren für 20 min vor Beginn der MI-Experiment.
    13. Monitor handeln alle 30-45 min wie in 2.1.11 erwähnt. Injizieren Sie 2500 IU fraktioniertem Heparin intravenös, wenn ACT < 180 s.
  2. Myokardinfarkt experiment
    1. Verwenden Sie C Arm Fluoroskopie Serienausstattung (Koronarangiographie Programm, Winkel 0°, 12 Bilder pro Sekunde, ~ 70 kV) - oder alternativ eine dedizierte Angiographie-System - die Koronarintervention durchführen.
    2. Verwenden Sie Röntgendurchleuchtung Anweisungen zum Einfügen eines Druck-Katheters (5F, 120 cm) über die zuvor platzierten Hülle in der linken Halsschlagader. Wechseln sie in den linken Ventrikel. Verbinden Sie den Druck-Katheter mit ein Erfassungssystem linken Ventrikeldruck aufzeichnen. Das Erfassungssystem muss kontinuierlich berechnen und erfassen von Herzfrequenz, entwickelt Druck, dP/dt maximale (Kontraktilität des linken Ventrikels) und dP/dt minimale (Entspannung des linken Ventrikels) während des gesamten Experiments. Ausgangswerte für 10 min aufnehmen.
    3. Einfügen einer 6F (100 cm, EB3.75) Führungskatheter über die zuvor platzierten Hülle in der rechten Halsschlagader. Kanüle an der linken Koronararterie zum Erreichen der linken vorderen absteigenden Koronararterie (LAD) unter Röntgen-Anleitung. Injizieren Sie Kontrastmittel mit einer 20 mL Spritze über den Führungskatheter eine Basislinie Koronarangiographie durchzuführen.
      Hinweis: Injektion von Kontrastmittel erfolgte durch manuellen Druck aber auch ein engagiertes Power Injektorsystem genutzt werden.
    4. Die Größe des Knaben auf dem x-ray Monitor wählen die entsprechende Größe des Katheters perkutane Koronarintervention (PCI) zu beurteilen. Verwenden Sie PCI-Sprechblasen mit einer Länge von 15-25 mm und Durchmesser zwischen 2 und 3,5 mm abhängig von der LAD-Größe. PCI-Katheter und koronare Führungsdraht (F 014/J, 175 cm) montieren. Verbinden Sie die PCI-Katheter mit der Aufblasvorrichtung vorausgefüllt mit Kontrastmittel.
      Hinweis: Der Bursche Durchmesser kann direkt auf einem kalibrierten Monitor mit einem Lineal gemessen werden und die Größe des PCI-Ballons wird dann entsprechend ausgewählt.
    5. Das montierte System aus 2.2.4 in das Lumen des Führungskatheters einfügen. Vorantreiben Sie der Führungsdraht in den Knaben, bis sie über die zweite Diagonale Verzweigung des Knaben erreicht.
    6. Verwenden Sie Röntgendurchleuchtung Anleitungen zu den PCI-Katheter vorschieben, bis sie etwa in der Mitte des Knaben erreicht. Wählen Sie die LAD blockierende Seite je nach Anatomie der Koronarien, in der Regel nach dem zweiten, manchmal nach dem ersten Diagonale Abzweig (Abbildung 3) um ähnliche Prozentsätze der AAR von der linke Ventrikel (LV) haben.
      Hinweis: Die Wahl des Standortes blockierende richtet sich nach der Länge der Diagonale Zweige und damit den Bereich des Gewebes, welches durch das Blut über die jeweiligen Branchen geliefert wird. Im Falle einer langen werden gegabelten erste Diagonale Zweig der blockierenden Website kurz danach. Im Falle der einen kürzeren ersten Diagonale Zweig erfolgt die Sperrung nach der zweiten Diagonale.
    7. Entfernen Sie den Führungsdraht und dann der Druck in der Aufblasvorrichtung 7-10 bar Pumpen Sie den Ballon des Katheters PCI und induzieren Myokardischämie für 1 h schrittweise Erhöhung FiO2 auf 50-60 % zwischen 15 und 40 min der Ischämie. Halten Sie Tidalvolumen bei 6 bis 10 mL/kg.
      Hinweis: Dieses Verfahren reduziert das Auftreten von Extrasystolen und verringern die Häufigkeit von Kammerflimmern zigarettenschachtelgroßen.
    8. Aufzeichnung einer 5-10 s Videosequenz während der Injektion von Kontrastmittel durch den Führungskatheter, ein Angiogramm der Ballon des Katheters PCI verfügen, nur nach dem Start Ischämie; Wiederholen Sie nach 10 min der Ischämie, vollständige Okklusion des distalen auf den Ballon des Katheters PCI Knaben zu überprüfen.
    9. Überwachen Sie das Tier sehr genau, um sofort zu erkennen und zu behandeln (2.2.10) Herzrhythmusstörungen. Extrasystolen in der Regel auftreten und Zunahme der Frequenz (> 3 / min.) zwischen 20 und 40 Minuten nach Induktion der myokardialen Ischämie. Tritt dies auf, massieren Sie sanft den Hals auf beiden Seiten unterhalb der Wange. In den meisten Fällen wird dies ausreichen, um einen regelmäßigen Herzschlag, wahrscheinlich durch Stimulation der Vagusnerv Barorezeptoren befindet sich auf der gemeinsamen Halsschlagader wieder herzustellen.
    10. Wenn Herzrhythmusstörungen in Kammerflimmern Fortschritt, verwenden Sie einen externen, biphasische Defibrillatoren ein Sinusrhythmus wieder herzustellen. Anwenden von 5-10 Herzdruckmassage mit den Defibrillator-Pads unmittelbar vor dem Auftragen des Schocks um die Koronarien mit sauerstoffreichem Blut zu füllen und dann Schock mit 150 J (für Tiere mit 30 kg).
    11. Gegebenenfalls wiederholen und erhöhen die Energie, um 175 J nach dem 3rd -Schock. Verwenden Sie höhere Energie-Einstellungen für schwerere Tiere.
    12. Fünf Minuten vor dem Ende der Ischämie-Zeit wiederholen die Blutentnahme in 2.1.8-2.1.13 erwähnt. Injizieren der Prüfsubstanz (entweder der bicyclischen FXIIa Inhibitor oder 4 mg/kg zu kontrollieren, dazu das Blind) intravenös über den zentralen Venenkatheter und Flush die Linie mit 20 mL Kochsalzlösung.
    13. Zurückziehen einer Plasma-Citrat-Probe (wie unter 2.1.8 und 2.1.9) 4 min nach der Injektion der Substanz im 2.2.12.
    14. Führen Sie ein Angiogramm (2.2.3) bestätigen LAD Okklusion, dann Luft aus dem Ballon des Katheters PCI und den Führungskatheter dieser Katheter entfernen. Perfusion des Knaben distal zum Ortsbild Okklusion durch Angiogramm unmittelbar nach Deflation und entfernen den Ballon des Katheters PCI, 10 min danach, zu bestätigen, wenn Anzeichen einer myokardialen Ischämie wurden durch EKG sichtbar, für mehr als 5 min und unmittelbar vor Re Okklusion des Knaben.
    15. Reperfusion des ischämischen Myokard für 2 h zu ermöglichen. Plasma und Serum Proben mit 10, 30, 60 und 115 min der Reperfusion (2.1.8 und 2.1.9) nehmen. BGA Monitor bei 60 bis 115 min (2.1.10).
    16. Setzen Sie die PCI-Katheter mit dem Führungsdraht auf genau die gleiche Position wie bei der Ischämie. Pumpen Sie den Ballon des Katheters PCI als vor und bestätigen Sie LAD Okklusion durch Angiogramm (2.2.3). Entfernen Sie den Druck-Katheter aus dem linken Ventrikel und stoppen Sie der Aufnahme.
    17. 100 mL 2 % zu injizieren Evans Blue in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) in der zentralen Venenkatheter. Ca. 30 s später, wenn das ganze Tier blau injizieren 40 mL 20 % KCl, das Tier einzuschläfern. Tod wurde durch das Fehlen von ECG Signale und Impulswellen bestätigt.

(3) Stichprobenverfahren

  1. Extrahieren, sezieren und sampling-Herzen (Abbildung 4)
    1. Führen Sie eine Sternotomie, die das Herz aussetzen. Folgen Sie das zuvor beschriebene von Koudstaal und Kollegen, die Schritte 8-2 und 8: 3-18Protokoll. Schneiden Sie das Perikard während der Inspektion für Anomalien, die stammen aus früheren Perikarditis und das Tier von weiteren Auswertung ausschließen könnten.
    2. Entleeren Sie und entfernen Sie die PCI-sowie den Führungskatheter. Schneiden Sie das Herz für die weitere Analyse. Schneiden Sie die untere Hohlvene und entfernen Sie Blut mit einer Saugpumpe, dann schneiden Sie die großen Gefäßen, die das Herz mit dem Körper verbindet.
    3. Spülen Sie das Herz innen und außen mit Raumtemperatur Kochsalzlösung. Wiegen Sie das ganze Herz.
    4. Innerhalb von 30-40 min, das Herz in Scheiben von etwa 3 bis 5 mm von der Spitze der Chorden Tendinae der Mitralklappe, senkrecht zur Längsachse mit einem scharfen Messer schneiden.
    5. Achten Sie darauf, immer das Herz in derselben Ausrichtung mit der Bauchseite nach oben um die Ausrichtung der geschnittenen Proben (Abbildung 5) zu platzieren.
    6. Fotografieren Sie die Scheiben des Herzens mit einer digitalen Spiegelreflexkamera.
    7. Schneiden Sie den rechten Ventrikel (verwerfen als nicht erforderlich). Fotografieren Sie die linke Herzkammer Scheiben zu und wiegen Sie alle Scheiben für das Gesamtgewicht des linken Ventrikels.
    8. Unterscheiden Sie zwischen dem Evans Blue positive und Evans Blue negative Gewebe in allen Abschnitten. Zerlegen Sie die Scheiben um die ischämische (Evans blau negativ) aus dem nicht-ischämischen Gewebe (Evans Blue positiv) mit einem Skalpell zu trennen.
    9. Zunächst analysieren Sie die Evans Blue negativen Abschnitte (der ischämischen Bereich gefährdet, AAR). Wiegen sie alle und steckte sie in einen Kunststoffbehälter.
    10. Decken Sie die Scheiben vollständig mit 100-150 mL (entsprechend der Größe des Herzens)-Triphenyl-Tetrazolium-Chlorid-Lösung (2 g TTC, 16 g Dextran, Molekulargewicht 48000-90000, in 200 mL PBS, frisch zubereitet), dass die Herz-Stücke innerhalb der Lösung frei bewegen können. Decken Sie den Container und 20 min bei 37 ° C inkubieren Sie, während sanft schütteln.
    11. Während dieser 20 min Inkubation Zeit wiegen die Evans Blue positive Stücke (Bereich nicht gefährdet, ANR), Proben für die Einbettung von Tissue-Tek nehmen (Wählen Sie die Verletzung den distalsten Teil) und bei-80 ° C zur weiteren Analyse zu speichern. Den Rest in 4 % Formaldehyd-Lösung und Lagerung bei Raumtemperatur für Histologie Abschnitte.
    12. Entfernen Sie die Stücke von der AAR von der TTC-Lösung. Die rote gefärbte Gewebe ist tragfähige ischämischen Gewebe (VIT) und das Gewebe nicht befleckt nekrotischen ischämischen Gewebe (NIT). Schneiden Sie 2 kleine Stücke (Blöcke von 2-3 mm) aus sowohl die NIT und VIT in Tissue - Tek einbetten und bei-80 ° C zur weiteren Analyse zu speichern. Diese Proben sollten das gleiche Gewicht haben.
    13. Befestigen Sie den Rest der Stücke (alle Scheiben von der AAR abgeleitet) durch Anheften nach unten in einem Styropor-Behälter und vollständig bedeckt mit 4 % Formaldehyd-Lösung für 24 h bei Raumtemperatur in einer Dampfhaube. Die Stücke sollten für die fotografische Dokumentation im nächsten Schritt flach bleiben.
    14. Am nächste Tag fotografieren beide Seiten der Stücke mit einer hochauflösenden Kamera mit den gleichen Zoom-Einstellung und die Entfernung aus dem Gewebe (gleiche Vergrößerung). Alle Bilder automatisch Maßstabsleisten hinzufügen. Alle Bars müssen die gleiche Länge haben.
      Hinweis: Die hochauflösende Kamera sollte mit Software verbunden sein, die jedes Foto automatisch die Maßstabsleiste hinzufügt.
  2. Berechnung der AAR und der Infarkt-Größe
    1. % AAR des linken Ventrikels = (Gewicht der AAR in g / Gewicht des linken Ventrikels in g) * 100.
    2. Verwenden Sie ImageJ-Software zur Berechnung der Gesamtfläche der AAR und NIT (beide Seiten eines jeden Stückes) anhand der Fotos.
    3. Einstellen Sie die Maßstabsleiste durch Auswahl der Mensur, Bar mit der geraden Linie vom Winkel Werkzeug. Wählen Sie im Menü analysieren > Maßstab gesetzt und legen Sie die bekannten Abstand und Einheit des Maßstabs. Wählen Sie "global", also der gleiche Maßstab auf alle Bilder angewendet werden sollen.
    4. Markieren Sie die gesamte Fläche des Gewebes mit der freien Hand-Auswahl-Werkzeug AAR zu berechnen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Seite (Höhe) des Gewebes und/oder das Fettgewebe (Abbildung 6 C) enthalten.
    5. Legen Sie die Messung durch Auswahl von "Bereich" und "Labels anzeigen" von Analyze > Menü Messungen festgelegt. Messen Sie die Fläche von Analyze > Messen.
    6. Wiederholen Sie Schritt 3.2.5 Maßnahme NIT (Mark nur die nicht-gefärbten Gewebe). Hinweis: Nicht das Fettgewebe (Abbildung 6-D) in die NIT-Berechnung einbeziehen. Wiederholen Sie den Schritt auf der anderen Seite des Gewebes.
    7. Berechnen Sie die durchschnittliche AAR und NIT für jedes Stück des Gewebes.
    8. Die Werte aus 3.2.7 verwenden, um die NIT als prozentualer Anteil der AAR:% NIT AAR berechnen = (durchschnittliche Fläche Σ nit cm2/ Σ durchschnittliche Fläche von AAR cm2) * 100.
    9. Zwei verschiedene Ermittler sollten die oben beschriebene Methode wiederholen. Die akzeptable Unterschied liegt < 10 %.
  3. Ischämie-Marker
    1. EDTA-Plasma-Proben, die zuvor bei-80 ° C (2.1.9) zur Messung des kardialen Troponin gespeichert wurden zu verwenden-Ich benutze eine Einzel-Plex Luminex-Typ-Test wie oben beschrieben 19.

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Representative Results

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Ein Tier starb vorzeitig vor der Verabreichung von FXIIa-Hemmer oder Kontrolle Peptid aufgrund eines technischen Fehlers (plötzlicher Abfall des Blutdrucks während Ischämie vor Zugabe der Prüfsubstanz). Ein Tier wurde aus der FXIIa-Hemmer Gruppe ausgeschlossen, da keine Ischämie/Reperfusion Verletzungen durch abnorme Anatomie des linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) beobachtet wurde. Ein großer Teil des linken Ventrikels, einschließlich der Spitze wurde durch den Zirkumflex Arterie in diesem Tier durchblutet. Die Tiere in der abschließenden Analyse einbezogen wurden n = 2 in der bicyclischen FXIIa Peptid-Hemmer Gruppe (bedeuten Gewicht 27,5 ± 2,5 kg) und n = 3 erhalten ein inaktives bicyclischen Steuerelement-Peptid (bedeuten Gewicht von 29 ± 0,8 kg).

X-ray video Imaging / Koronarangiographie die Schweineherz wird verwendet, um die Position des Katheters Druck zu visualisieren und zu entscheiden, wo der Knabe (Abbildung 3A) blockieren. Abbildung 3 b zeigt die Katheter-Position blockieren die Durchblutung distal der zweiten Diagonale Verzweigung. Vergleich der Abbildung 3A und 3 b ermöglicht auch eine Schätzung von der LAD geliefert Myokard ischämischen gehören werden. Am Ende der Periode 2 h Reperfusion ist der PCI-Katheter wieder eingeführt und aufgeblasen an derselben Position wie während Ischämie. Evans Blue ist dann intravenös injiziert, um genau festzustellen, die AAR (Abb. 5A). Nach Exzision des Herzens ist der linke Ventrikel in 3-5 mm dicke Schichten von der Spitze bis zu der Mitralklappe, senkrecht zur Längsachse in Scheiben geschnitten. AAR und ANR werden durch Evans blaue Färbung auf die Scheiben klar abgegrenzt. AAR und ANR Probenahme Bereiche sind in Abbildung 5 bgezeigt.

AAR, ausgedrückt als Prozentsatz der LV, zeigt keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den FXIIa behandelt und der Kontrollgruppe (Abb. 6A). Die Infarkt-Größe (NIT/AAR) zeigt keine Unterschiede zwischen den Gruppen entweder (mit nichtparametrischen Mann-Whitney-test, p > 0,05, Abbildung 6 b). Diese Daten deuten darauf hin, dass FXIIa Inhibitor allein, in der verwendeten Konzentration und Dauer der Anwendung, nicht das Herz von Herzinfarkt schützen könnte ich / R Verletzungen. Abbildung 6 und 6D zeigen, wie man die AAR und NIT Grenzen zu kennzeichnen, um die jeweiligen Flächen exakt und reproduzierbar zu messen.

Die Blut-Sampling-Strategie ermöglicht die Freigabe der Herzmuskel Schaden Marker kardiale Troponin-ich im Laufe der Zeit überwacht werden. Nach einer Stunde der Ischämie an der Grundlinie während gibt es fast keinen Unterschied, nach Reperfusion es ein kontinuierlicher Anstieg im Laufe der Zeit ist wie in Abbildung 7dargestellt. Für Troponin-I, konzerninternen Unterschiede waren auch nicht signifikant in diesen Experimenten.

Figure 1
Abbildung 1 . Überblick über die experimentelle Timeline. Schematische Timeline für die wichtigen Schritte in der myokardialen Ischämie/Reperfusion Verletzungen Modell. Grundlinie koronare Visualisierung, Startzeit von der Ischämie, Überwachung von Herzrhythmusstörungen und Injektion der Prüfsubstanz sind wichtige Schritte im Experiment. Die Verwendung der genauen Zeitmessung in allen Experimenten sichert Reproduzierbarkeit. Euthanizing der Tier- und Exzision des Herzens sollte innerhalb von 15-20 min. nach Abschluss der Phase 2 h Reperfusion erfolgen. KCl: Kaliumchlorid. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Zeitleiste der Blutentnahme und Analyse. Zeitpunkte für die Blutabnahme werden zusammen mit der Art der Gerinnungshemmer verwendet angezeigt. Zusätzliche Proben können je nach Experiment und Analyten entnommen werden, gemessen werden. ACT: aktiviert Gerinnungszeit, BGA: Gas Blutanalyse, RT: Raumtemperatur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 . Koronarangiographie. Röntgendurchleuchtung von (A) der linken Koronarien an der Basislinie, der gelbe Pfeil zeigt auf die erste und die zweite Diagonale Zweige Aussichtspunkte der weiße Pfeil zum Herz Apex (B) der okkludierte Bursche zeigt keine Flow-Bereich des linken Ventrikels (LV), der rote Pfeil zeigt auf den PC Ich Katheter (C) Wiederverschließen des Knaben am Ende der Reperfusion mit dem Ballon von der PCI-Katheter wieder auf dem gleichen Gelände in der Bursche während Ischämie. CX: Zirkumflex Koronararterie, LAD: Links vorderen absteigenden Koronararterie, MC: Millar Katheter in die linke Herzkammer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 . Schematische Karte der Gewebe Probenahme. Exaktes Timing der Herzen Dissektion und Probenahme für die verschiedenen Bereiche für weitere Analysen. Die Zeitachse startet bei 205 min nach Beginn der Ischämie, 20 min. nach Beendigung der Tierversuch. Es ist wichtig, die Gewebeschnitte in TTC innerhalb von maximal 40 min inkubieren nach euthanizing das Tier. Probenahme von ANR, VIT und NIT wird als weiße Quadrate angezeigt. Inkubation der AAR in 4 % Formaldehyd ermöglicht klare Unterscheidung zwischen NIT und VIT für die genaue Bestimmung der Infarkt Größe. AAR: Bereich gefährdet, ANR: Bereich nicht gefährdet, LV: linke Herzkammer, NIT: nekrotische ischämischen Gewebe, OTC: Tissue-Tek, RV: rechten Ventrikel, TTC: Triphenyl-Tetrazolium-Chlorid, VIT: tragfähige ischämischen Gewebe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 . In-Situ-Differenzierung zwischen gefährdet (AAR) und nicht in Gefahr ANR. (A) repräsentatives Bild des gesamten Herzens nur nach Sternotomie am Ende des Experiments. (B) repräsentatives Bild zeigt die 3-5 mm dicken linken Ventrikel Scheiben nach Dissektion. AAR und ANR sind klar definiert, durch gelbe Pfeile angedeutet und der weiße Pfeil zeigt den Stichprobenraum ANR. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 . Ischämie und Infarkt Größe. (A) der Gewichtsanteil der AAR der linke Ventrikel (LV). (B) die prozentuale Fläche von NIT von der AAR. (C) ein repräsentatives Bild von der AAR-Berechnung. (D) ein repräsentatives Bild der NIT Berechnung. Der weiße Pfeil zeigt den VIT Stichprobenraum und der schwarze Pfeil zeigt den Stichprobenraum NIT. Daten wurden mit ImageJ Software berechnet. Werte werden angezeigt, wie Punkte für jeden einzelnen mit Angabe der mittleren ±± SD Kontrollgruppe n experimentieren = 3 und FXIIa Inhibitor behandelt Gruppe, n = 2. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 . Herzmuskel Schaden Marker. Kardiale Troponin-ich Konzentration im Laufe der Zeit in Pg/ml des Kontroll- und FXIIa Inhibitor behandelten Gruppe. Blut wurde aus der Halsschlagader in EDTA-Plasma-Röhrchen an Grundlinie, Ende der Ischämie und mehreren Zeitpunkten während der Reperfusion und kardiale Troponin gesammelt-ich war Single-Plex Aussetzung Array (Bio-Plex) gemessen. Daten werden angezeigt, wie Punkte für jeden einzelnen mit Angabe der mittleren ±± SD Kontrollgruppe n experimentieren = 3 und FXIIa behandelt Gruppe, n = 2. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Myokardialen ich / R Verletzung hat einen signifikanten Einfluss auf die endgültige Infarkt-Größe, die Prognose der Patienten nach akutem Myokardinfarkt3direkt übersetzt wird. Verständnis der Pathophysiologie der myokardialen ich / R Verletzungen ist der erste Schritt zu reduzieren oder zu verhindern. Myokardialen ich / R Verletzungen ist eine akute Erkrankung, die direkt nach Reperfusion der verstopften Gefäße auftritt. Ich / R Verletzung führt zu einer Aktivierung der angeborenen Immunantwort und Zellschädigung tritt an der Stelle der Reperfusion und dem umliegenden Gewebe20. Eine aktuelle Studie ergab eine Verbesserung der neurologischen Ergebnis in einem Rattenmodell des Gehirns ich / R Verletzungen wenn mit FXIIa Inhibitor8behandelt. Jedoch in der aktuellen Pilotstudie wir fanden keinen Effekt des bicyclischen FXIIa Inhibitors auf myokardiale ich / R Verletzungen. Die verwendeten FXIIa Inhibitor ist Roman und seine Pharmakokinetik bei Schweinen sind noch nicht bekannt. Daher könnte die beobachteten fehlende Wirkung durch unsachgemäße Dosierung oder Anwendung verursacht werden. Dies muss in Nachfolgestudien angegangen werden.

Standardisierung von einem Tiermodell unbedingt eingehend zu untersuchen, die Pathophysiologie der myokardialen ich / R Verletzungen und passende Lösungen in Kliniken bringen. Untersuchung der Pathophysiologie der myokardialen ich / R Verletzung erfordert gute und repräsentative Probenahme um die zellulären Mechanismen zu untersuchen. Die Schweine geschlossenen Brust myokardialen ich / R-Verletzung-Modell bietet eine reproduzierbare Methode, die in der Nähe der klinischen Situation und nützlich sein, um die zellulären Mechanismen und Test neuer neue Therapeutika zu verstehen ist. Varianten des vorliegenden Modells wurden für die vorgenannten Zwecke14,17,18vor beschrieben.

Unser Protokoll eines akuten Myokardinfarkts bei Schweinen braucht nicht vor der Behandlung mit Amiodaron als zuvor beschriebenen18,21. Wir verwendeten Karotissinus Massage, um Herzrhythmusstörungen und eine biphasische Defibrillatoren für Cardioconversion bei Kammerflimmern zu reduzieren. Die Verwendung von Karotissinus Massage ist klinisch Vorhofflimmern22beeinflussen bekannt, aber es ist bisher nicht gezeigt worden, zu verhindern oder zu verzögern das Auftreten von Kammerflimmern in MI, entweder Mensch oder Schwein-Modelle. Darüber hinaus hilft die Verwendung von Sevofluran um ventrikuläre Arrhythmien sowie Sterblichkeit im porcinen Modell von akutem Myokardinfarkt23zu reduzieren.

Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten und das Risiko einer Thrombose während des Experiments, wurden Mehrfachdosen von Heparin injiziert, basierend auf der wiederholten Messung des Gesetzes, anstatt mit Heparin Dosen wie zum Beispiel von Koudstaal Et al.18beschrieben fixiert. Eine kontrollierte Menge Heparin Verwaltung hilft um zu untersuchen, die Gerinnung Kaskade im Rahmen von I / R Verletzungen. Evans Blue ermöglicht die genaue Bestimmung der AAR/LV Die intravenöse Injektion von Evans Blue nach Re Okklusion des Knaben an den genauen Ort während Ischämie Induktion unter Röntgendurchleuchtung Anleitung zur Blaufärbung der das ganze Schwein führt, einschließlich des nicht-ischämischen Teils des Herzens mit minimalen Auswirkungen für die ANR Herzmuskel und Gefäßsystem. Evans Blue ist eine bekannte zytotoxische Substanz24. In den aktuellen Experimenten war es wichtig, die Lebensfähigkeit der Endothelzellen Schicht im ANR in das Herz-Gefäßsystem aufrechtzuerhalten, um zu verwenden es als Individuum Intra steuern so 100 mL Evans Blau wurde systemisch injiziert und verdünnt mit Vollblut-Reduzierung seiner Toxizität. Zuvor, in einer ähnlichen Einrichtung Zellen 50 ml 2 %, die direkt in den Koronarien erhöht das Risiko von seiner Zytotoxizität zu kardialen Evans Blue injiziert wurde25. Der nächste wichtige Schritt war es, das Herz direkt in 3-5 mm Scheiben von der Spitze bis zu der Mitralklappe (die genaue Position in jedem Tier) und mit dieser Methode eine genaue Berechnung der AAR als Prozentsatz des linken Ventrikels zu sezieren.

Die aktuelle Beschreibung der Methode bietet feineren Details, die bisher nicht beschrieben worden. TTC befleckt Abschnitt in 4 % Formaldehyd für 24 Stunden Inkubation bietet eine klare Unterscheidung zwischen lebensfähig (rot) und nekrotische (weiß) Gewebe, das schließlich die Reproduzierbarkeit der Probenahme für weitere molekulare Färbung erhöht. Blut Probenahmestrategie über 2 h Reperfusion ermöglicht die Erkennung von neu exprimierten Moleküle in den Frühstadien (10-30 min) der Reperfusion sowie später (60 bis 120 min). Die richtige Blut und Gewebe Probenahme und Lagerung sind auch entscheidend für die Analyse von Plasma Kaskade Markierungen wie die Expression von Proteinen Ergänzung und Koagulation.

Das aktuelle Protokoll kann geändert werden, um eine längere Zeit der Reperfusion, von ein paar Stunden bis Tage haben. Dadurch kann den Forscher zu untersuchen, die späteren Folgen von I / R Verletzungen auf das Herz und ermöglicht auch das Testen von neuen Medikamenten und Bewertung ihrer Auswirkungen. Die Begrenzung des derzeitigen Protokolls ist die Verwendung von einem Druck-Tip-Katheter zur Messung der Herzfunktion. Zuverlässigere Daten auf die Herzfunktion können durch den Einsatz von einem Druck-Volumen-Schleife-Mess-System abgerufen werden. Zusammenfassend lässt sich die aktuelle Methode bietet detaillierte wichtige Schritte erforderlich, um die Reproduzierbarkeit der myokardialen porcinen geschlossenen Brust erhöhen ich / R Verletzungen Modell, wenn die bestimmungsgemäße Verwendung des Modells ist es, die zellulären und molekularen Veränderungen im Rahmen der Studie Studium der myokardialen ich / R Verletzungen Pathophysiologie oder neuartige Therapieoptionen zu studieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Professor Christian Heinis bestätigen für die Bereitstellung der FXIIa Inhibitor und das jeweilige Steuerelement. Wir erkennen auch dankbar Olgica Beslac, Dr. Daniel Mettler und Kay Nettelbeck aus der experimentellen Chirurgie-Einheit, Abteilung für biomedizinische Forschung, Universität Bern für den technischen Support. Celine Guillod und Matthias Rausch von der Abteilung für Diagnostik, Intervention und Pädiatrische Radiologie, Universitätsspital Bern, Inselspital unterstützte mit den x-ray Geräten und Techniken. Dieses Projekt wurde gefördert durch den Schweizerischen Nationalfonds, Projekt Nr. 320030_156193. Wir möchten auch Danke, Herr Reto Haenni von Kommunikation und Marketing, Universitätsspital Bern, Inselspital für Videoaufzeichnung unser Experiment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABL 90 Flex, blood gas analyser Radiometer - Blood gas analysis (BGA)
ACT Plus Medtronic - Activated clotting time
Atropin Sintetica - Atropinum Sulfas, 0,5mg/ml
Balance (20-500 Kg) NAGATA Scale, Tiwan HTB/HTR Alternative products can be used
Balance (21-4200 g) Mettler toledo, Switzerland MS4002SDR Alternative products can be used
Blood collection tubes: EDTA, citrate and serum S-Monovette, Nuembrecht, Germany 05.1167.001,
05.1071.001
and
05.1557.001 respectively
Alternative products can be used
BV Pulsera mobile C-arm Philips - Alternative products can be used
Centrifuge Labcare, UK ALC PK120R Alternative products can be used
Defibrillator Lifepak 12 Medtronic - Alternative products can be used
Dextran from Leuconostoc mesenteroides Sigma-Aldrich, Germany D3759 Average M.wt 48000-90000
Digital single lens reflex camera Sony, Thailand DSLR-A500/A550 Alternative products can be used
Dissecting forceps Alternative products can be used
EMPIRA RX PCI dilatation catheter Cordis, Johnson&Johnson, USA 85R15300S Diameter 3 mm, length 15 mm, Alternative products can be used
EMPIRA RX PCI dilatation catheter Cordis, Johnson&Johnson, USA 85R15350S Diameter 3.5 mm, length 15 mm, Alternative products can be used
Evans Blue Sigma-Aldrich, Germany E2129 Toxic
Fabius GS premium respirator Dräger, Lübeck, Germany - Anesthesia work station, Alternative products can be used
Fentanyl Inselspital ISPI - Fentanyl 2500mcg/50ml
Formaldehyde Pathology Institute, Bern University SI148701 Alternative products can be used
FXIIa inhibitor Provided by Prof. Christian Heinis' laboratory in EPFL Novel bicyclic peptide
Galeo, coronary guidewire Biotronik, Germany 125497 Alternative products can be used
Guidance catheter Boston Scientific, Florida, USA 34356-06 6F (100 cm, EB3.75). Alternative products can be used
Heparin Sodium Drossapharm, Basel, Switzerland - Liquemin, 25000 U.I./5 ml
High end electrosurgery BOWA, Germany ARC 400 Electrical source for blood suction. Alternative products can be used
Hydro-Guardmini breathing filter Intersurgical, Lithuania 1745000 Filters
Image J National Institute of Health, USA 1.47v Alternative products can be used
Inflation device, Atrion QL2530 Atrion medical product, Alabama, USA 96402 Alternative products can be used
IntelliVue MP 70 Philips, Boeblingen, Germany - Monitor (ECG, heart rate, blood presure and body temperature). Alternative products can be used
KCl Sintetica SA - Potassium chloride 15%
Ketamine Vetoquinol - Narketan, 1ml/100mg
LR-ACT Medtronic 402-01 ACT special syringes
Midazolam Roche - Dormicum, 5mg/ml
Monopolar scalpel Alternative products can be used
Needle holder Alternative products can be used
High resolution camera, PathStand Macro Imaging Stand for Grossing Spotimaging, USA 1080 p HD resolution. Alternative products can be used
PBS In-house preparation - Alternative products can be used
Peripheral venous cannula, 18 G Alternative products can be used
PowerLab 4/35 data acquisition system Adinstruments, Spechbach, Germany -
Rotamax120T Heidolph, Germany 544-41200-00 Shaker. Alternative can be used
Rüschelit-Super Safety Clear Tube Teleflex, Dublin, Irland 112480 Air way tubing, Alternative products can be used
Safe Pico Aspirator Syringes Radiometer 956-622 BGA special syringes
Saline Sintetica Bioren - NaCl 0,9%. Alternative products can be used
Sevorane 1.5% AbbVie AG - Sevorane 250ml 100%
Sheath Cordis, Johnson&Johnson, USA 504-607 A AVANTI + / 7 F, Alternative products can be used
Space infusion pump B.Braun Medical AG, Germany - For infusion of fentanyl. Alternative products can be used
SPR-350 (Millar catheter) Adinstruments, Texas, USA 840-8166 MIKRO-TIP, 5F, 120 cm
Sternotomy saw Alternative products can be used
Sutures ETHICON, Johnson&Johnson, USA Y3110H Monocryl 3-0 SH-1 Plus. Alternative products can be used
Syringes (20, 10 and 5 mL) CODAN,Baar, Switzerland 62.7602,
62.6616,
62.5607
respectively
Used to inject anesthetic materials intramuscularly or directly into the central venous line. Also to inject heparin or FXIIa or the respective control. Alternative products can be used
Thorax spreader Alternative products can be used
Tissue-tek SAKURA, Netherlands 4583 O.C.T. compound
Vascular forceps Alternative products can be used
Xenetix 300 contrast media Guerbet, Zürich, Switzerland - Lobitridol, 300 mg iodide/ml
Xylazine Vetoquinol - Xylapan, 20mg/1 mL
2,3,5-Triphenyltetrazolium choride Sigma-Aldrich, Austria T8877
500 μL tubes (eppendorf) Trefflab, Switzerland 96.08185.9.03 Alternative products can be used

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References

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Verbesserung der einen geschlossenen Kasten porcinen Myokardinfarkt Modell durch Standardisierung der Gewebe und Blut Stichprobenverfahren
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Abdelhafez, M. M., Shaw, J., Wilbs, J., Despont, A., Rieben, R. Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures. J. Vis. Exp. (133), e56856, doi:10.3791/56856 (2018).More

Abdelhafez, M. M., Shaw, J., Wilbs, J., Despont, A., Rieben, R. Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures. J. Vis. Exp. (133), e56856, doi:10.3791/56856 (2018).

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