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Medicine

조직 및 혈액 샘플링 절차의 표준화에 의해 닫힌된 가슴 돼지 심근 경색 모델의 개선

doi: 10.3791/56856 Published: March 12, 2018

Summary

여기 심근 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해의 병 태 생리학의 이해에 변환 값을 증가 하기 위하여 급성 심근 경색의 설립된 돼지 모델의 샘플링 절차를 표준화 프로토콜 설명 그리고 새로운 약 후보자를 테스트 합니다.

Abstract

심근 국 소 빈 혈 reperfusion (I / R) 심근 경색 후 괴 면적의 거의 절반에 기여 하는 부상. 날짜 심근을 방지 하거나 감소 승인 된 약은 I / R 상해. 연구와 심근의 병 태 생리 메커니즘의 이해 I / R 상해 성공적인 치료를 개발 하는 필수적 이다. 큰 동물 실험 변환 방법에서 중요 한 단계는. 급성 심근 경색의 돼지 모델 설립 되었고 자신과 다른 사람에 의해 설명. 우리는 더 세부 사항에 미래 실험에 사용 하기 위해 샘플링 기법에 집중 하 여 모델의 가치를 향상 목적. 또한, 우리는 최종 결과의 품질에 영향을 미칠 수 있는 작지만 중요 한 단계를 강조. 심근의 임상 상황을 모방 하기 위해 I / R 상해, 경 피 적인 관상 동맥 내정간섭 (PCI) 카 테 터는 왼쪽된 앞쪽 내림차순 관상 동맥 (젊은이)의 마 취 돼지에 삽입 되었습니다. ° ° °는 괴 사 성 뿐만 아니라이 모델 모방 급성 심근 경색 및 PCI 치료에서 영역을 정확 하 게 결정의 가능성을 가진 인간 위험-가능한 허 혈 성 조직. 여기 모델은 FXIIa의 bicyclic 펩타이드 억제제의 효과 조사 하기 위해 사용 되었다. 모델은 또한 심근 경색의 나중 효과 공부 하 긴 reperfusion 시간 수 있도록 수정할 수 있습니다.

Introduction

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허 혈 성 심장 질환, 특히 급성 심근 경색 (MI), 선진국 1에서 죽음의 주요 원인입니다. 오늘, 미의 표준 치료 경 피 적인 관상 동맥 내정간섭 (PCI), 풍선 카 테 터 치료 이다. 급성 미 PCI 치료 후 환자의 예 후 및 삶의 질에 영향을 미치는 중요 한 요소 중 하나는 경색 크기입니다. 크기의 감소는 환자 생존 및 예 지 2에 큰 영향을 가질 수 있습니다. 심근 국 소 빈 혈 또는 reperfusion (I / R) 부상 그래서 심장 혈관 연구의 주요 목표 중 하나를 방지 하거나 감소 심근 경색 크기에 큰 영향 있다 내가 / R 상해 3. 나의 정확한 메커니즘 / R 상해 조사 4의 밑에 아직도 있다. 플라즈마 폭포와 내 피 세포의 활성화는 나의 / R 상해 5. 응고 체계의 활성화는 명확 하 게 관련 된 6,7입니다. 최근, 응고 캐스케이드의 접촉 단계 활성화에 관여 한 초기 업스트림 펩타이드로 FXII의 역할은 FXII에 표시 되었습니다 나 대뇌의 쥐 모델 노크 / R 부상 8. 돼지 모델에서 이러한 결과의 유효성 검사 임상 번역으로 중요 한 단계는 이다. 따라서, 우리는 테스트 소설 bicyclic (80 kDa protease) FXIIa 억제제 심근의 맥락에서 I / R 상해 파일럿 연구에서.

심각한 MI와 PCI 치료의 임상 상황을 모방, 동물 모델은 우리의 이해의 심근의 이상 난 개선 필수 / R 상해 및 새로운 치료 옵션을 테스트 하기. 돼지에 대 한 좋은 동물 모델 대표 임상 심근 I / R 상해. 이건만 있기 때문에 그들의 마음 매우 해부학 및 관상 동맥 순환, 인간의 마음에 유사 하지만 그들은 또한 유사한 병 태 생리 응답 심근 국 소 빈 혈과 reperfusion 9,10을 보여줍니다. 쥐와 쥐 같은 다른 모델 하지 이러한 기준을 충족 하 고 반면 개 인간 에 비해 많은 더 많은 부수적인 관상 동맥 혈관 등 인간의 마음 11,12를 비교할 때 상당한 차이 보여 13.

돼지 급성 심근 경색 모델 널리 이용 되는 심장 혈관 연구에서 심근 허 혈 성 심장 질환 등 조사 I / R 상해 14,15,,1617. 후자는 sternotomy를 최소화 하는 것 때문에 염증 반응 관련 염증 성 상태 또는 thoracotomy 오픈-가슴 수술에 사용 되는 필수적 이다. 닫힌된 가슴 모델 임상 C 팔 혈관 설정을 사용 하 여이 문제를 극복 한다. 또한, 가장 중요 한 포인트 중 하나는 우리의 프로토콜은 위험, AAR에 허 혈 성 (지역)와 비-허 혈 성 좌 심 실 (위험, ANR에 영역) 영역 간의 정확한 구별 경색 크기 (괴 사 성 허 혈 성 조직, 니트) 수은 정확 하 게 결정 될. 이 문서에 대 한 우리의 목표는 심근는 돼지의 재현 방법론을 명확 하 게 정의 하는 나 / R 부상 모델, 특히 심근 조직 샘플링, I의 분자 메커니즘의 더 정확한 분석에 대 한 수에 관하여 / R 상해와 새로운 약물 치료의 효과의 명확 하 게 그림.

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Protocol

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1입니다. 동물:

모든 동물 스위스 국가 법률의 지침에 따라 치료 했다. 연구는 구획 베른의 로컬 동물 실험 위원회에 의해 승인 되었다 (권한이 없습니다. 25/16 수).

남녀의 큰 흰 돼지를 사용 하 여 (~ 30 ± 5 k g). 두 그룹으로 동물을 맹목적으로 나누어 한 그룹 FXIIa의 bicyclic (80 kDa 효소) 억제제 또는 선택과 다른 비활성 컨트롤의 치료.

2. 수술 (그림 1)

  1. 마 취와 동물의 준비:
    1. 12 h에 대 한 동물 실험을 시작 하기 전에 빠른.
    2. 전 의료를 베 풀 20 mg/kg 케 타 민 및 2 mg/kg Xylazine 10 mL 주사기를 사용 하 여 목에 근육 주사를 통해 동물. 동물의 무게와 섹스를 기록 합니다.
    3. 0.5 mg/kg Midazolam와 0.05 mg/kg Atropin 귀의 정 맥으로 주입 하 여 마 취를 유도. Endotracheal 튜브 동물 넣어야
    4. 기계 환기는 인공 호흡기를 사용 하 여 마 취를 유지 (O2/air 1:3, Sevorane 1.5%), 7-8 m m 기도 튜브와 필터. 6-10 mL/kg를 해 볼륨을 35% 영감된 산소 (FiO2)의 일부를 조정 합니다.
    5. 마 취의 깊이 모터 또는 자율 응답 코 곤란의 부재로 적절 한 평가. 종을 반사 및 턱 톤은 또한 지속적으로 편안한 턱 색조와 종을 반사의 부재를 대상으로 하는 것을 감시 되었다. 코어 온도 지속적으로 모니터링 하 고 수동 온난화 (격리 담요와 따뜻한 병)와 normothermia (38-38.5 ° C)의 유지 보수 보장 했다.
    6. 무료, 이전 설명한 Koudstaal와 그의 동료 1 단계 단계 3-3-318, 양쪽에 경 동맥 해 부 고 7 층 칼 집과 cannulate. 왼쪽된 경 정 맥 정 맥 혈액 샘플링에 대 한 7 층 칼 집과 cannulate
    7. 250 µ g/h는 주입 펌프를 사용 하 여 지속적인 정 맥 주입으로 뒤 중앙 정 맥 라인을 통해 250 µ g 펜타닐 진통제의 큰 알 약 복용량을 관리 합니다. 체온, 심장 박동과 리듬 3 리드 심전도 (ECG), 전체 실험 동안 동맥 및 중앙 정 맥 압력을 모니터링 합니다.
    8. 정 맥 라인에서 다음 기준선 혈액 샘플을 철회 표준 혈액 컬렉션 튜브를 사용 하 여: 5 mL citrated 플라즈마와 각각 튜브에 2.9 mL EDTA 플라스마. 4 ° c.에 15 분 동안 2000 x g에서 즉시 원심 2.9 mL 혈액 혈 청 관으로 고 위에서 설명한 대로 centrifuging 전에 실 온에서 30 분 동안 응고를 허용.
    9. 플라스마 또는 혈 청 500 µ L로 aliquot 200 µ L 튜브 고 추가 분석에 대 한-80 ° C에서 모든 샘플을 저장 합니다.
    10. 특별 한 혈액 가스 분석 (BGA) 주사기 BGA 제조 업체의 지침에 따라 BGA 기계를 사용 하 여 측정을 사용 하 여 간선에서 혈액의 0.5 mL를 철수.
    11. 표준 2 mL 주사기를 사용 하 여 정 맥에서 혈액의 0.5 mL를 철회 하 고 즉시 30g 바늘을 사용 하 여 ACT 카트리지로 전송. 제조업체의 지침에 따라 응고 시간을 측정 행위 기계로 채워진된 카트리지를 삽입 합니다. 시간 포인트 그림 2 를 참조 하십시오.
    12. 2 mL 주사기를 사용 하 여 정 맥 라인으로 5000 IU unfractionated 헤 파 린을 관리 하 고 미 실험을 시작 하기 전에 20 분 동안 안정화 동물 허용.
    13. 2.1.11 듯이 모니터 모든 30-45 분 행동. 법 < 180 s 경우 2500 IU unfractionated 헤 파 린을 정 맥 주사.
  2. 심근 경색 실험
    1. 표준 C 팔 fluoroscopy 장비를 사용 하 여 (관상 동맥 혈관 프로그램, 각도 0 °, 두 번째, ~ 70 초당 12 프레임 kV) 또는 전용된 제품은 시스템 또는 관상 동맥 내정간섭을 수행 하려면.
    2. (5 층, 120 c m) 압력 카 테 터를 삽입 하려면 왼쪽된 경 동맥에 이전 배치 칼 집 통해 fluoroscopic 가이드를 사용 합니다. 좌 심 실에 사전. 왼쪽된 심 실 압력 기록 수집 시스템에 압력 카 테 터를 연결 합니다. 수집 시스템은 지속적으로 계산 하 고 개발 하는 심장 박동을 기록 필요 압력, dP/dt 최대 (좌 심 실 수축)와 dP/dt 최소 (좌 심 실 이완) 전체 실험 기간 동안. 10 분에 대 한 초기 계획 값을 기록 합니다.
    3. 6F (100 cm, EB3.75) 삽입 오른쪽 경 동맥으로 이전 배치 칼 집 통해 인도 카 테 테 르. X 선 지도 왼쪽된 앞쪽 내림차순 관상 동맥 (젊은이) 도달 왼쪽된 관상 동맥에 진출. 유도 카 테 터를 통해 20 mL 주사기를 사용 하 여 초기 관상동맥 혈관을 수행 하는 대조 매체 주입.
      참고: 대조 매체 주입 수동 압력에 의해 수행 됐다 하지만 전용된 파워 인젝터 시스템 뿐만 아니라 사용 될 수 있습니다.
    4. 경 피 적인 관상 동맥 내정간섭 (PCI) 카 테 테 르의 적절 한 크기 선택 x 선 모니터에 젊은이의 크기를 평가 합니다. 15-25 m m 2와 3.5 m m 젊은이 크기에 따라 직경의 길이와 PCI 풍선을 사용 합니다. 조립 PCI 카 테 터와 관상 동맥 guidewire (F 014/J, 175 cm). 대조 매체와 pre-filled 인플레이션 장치와 PCI 카 테 터를 연결 합니다.
      참고: 젊은이 직경은 통치자를 사용 하 여 보정된 모니터에 직접 측정 될 수 있다 고 PCI 풍선의 크기에 따라 선택 다음.
    5. 인도 카 테 테 르의 루멘에 2.2.4에서 조립된 시스템을 삽입 합니다. 젊은이의 두 번째 대각선 지점 넘어 도달할 때까지 젊은이에 있는 guidewire를 사전.
    6. 그것에 대 한 젊은이의 중간에 도달할 때까지 PCI 카 테 터를 fluoroscopic 가이드를 사용 합니다. 일반적으로 좌 심 실 (LV)의 AAR의 유사한 비율이 있기 위하여 첫 번째 대각선 지점 (그림 3) 때로는 후 두 번째 후 coronaries, 해부학에 따라 젊은이 차단 사이트를 선택 합니다.
      참고: 차단 사이트의 대각선의 길이에 따라서 각 분기를 통해 혈액에 의해 제공 되는 조직의 지역 따라 달라 집니다. 오래, 경우 분기 첫 번째 대각선 지점 차단 사이트 직후이 될 것입니다. 짧은 첫 번째 대각선 지점 경우 차단 두 번째 대각선 후 수행 됩니다.
    7. guidewire를 제거 하 고 PCI 카 테 터의 풍선을 부 풀 려 1 h. 점차적으로 증가 FiO2 허 혈의 15 그리고 40 분 사이 50-60%에 대 한 심근 허 혈을 유발 하는 7-10 바 인플레이션 장치에 압력을 증가. 6-10 mL/kg에서 해 볼륨을 유지.
      참고:이 절차 extrasystoles의 발생 하는 심 fibrillations의 주파수를 감소 하십시오.
    8. 기록 장소에 허 혈; 시작 직후 PCI 테의 풍선의 혈관 촬영을 인도 카 테 테 르 통해 대조 매체 주입 하는 동안 5-10 s 비디오 시퀀스 PCI 테의 풍선에 원심 젊은이의 완전 한 폐색을 확인 허 혈의 10 분 후 반복 합니다.
    9. 밀접 하 게 즉시 감지 하 고 치료 (2.2.10) 동물 모니터링 심장 부정맥. Extrasystoles는 일반적으로 발생 하 고 주파수에서 증가 (> 분 당 3) 심근 허 혈의 유도 후 20, 40 분 사이. 이 경우, 부드럽게 바로 뺨 아래 양쪽에 목 마사지. 대부분의 경우에서이 다시 일반적인 경 동맥에 있는 vagal 신경 baroreceptors의 자극에 의해 아마 일반 하트 비트 설정에 충분할 것 이다.
    10. 심장 부정맥 심 동으로 진행을 하는 경우는 외부, 복 형 제 세 동기를 사용 하 여 다시 부 비 동 리듬을 설정 하려면. 5-10 가슴 압축 산소를 혈액은 coronaries 채워 고 다음 150 J (30 kg 동물)에 대 한 충격 충격을 적용 하기 전에 즉시 제 세 동기 패드를 사용 하 여 적용 됩니다.
    11. 필요한 경우 반복 하 고 175 J 3rd 충격 후에 에너지의 증가. 더 무거운 동물에 대 한 높은 에너지 설정을 사용 합니다.
    12. 허 혈 시간 끝나기 전에 5 분 2.1.8-2.1.13에서 언급 한 혈액 샘플링을 반복 합니다. 시험 물질을 주입 (중 bicyclic FXIIa 억제제 또는 제어 4 mg/kg, 이렇게이 맹목적으로) 중앙 정 맥 라인 플러시 라인 20 mL 염 분을 통해 정 맥.
    13. (설명 했 듯이 2.1.8에 2.1.9) 한 플라즈마 시트르산 샘플을 철회 2.2.12에 물질을 주입 후 4 분.
    14. 젊은이 폐색을 확인 다음 PCI 테의 풍선 폐 인도 카 테 테 르에서이 카 테이 터를 제거 하는 혈관 촬영 (2.2.3)을 수행 합니다. 심근 허 혈의 흔적 직전 5 분 이상 한 ECG에 의해 표시 되었다 때마다 디플레이션과 PCI 카 테 터, 10 분 후, 풍선의 제거 후 즉시 폐색 사이트에 원심 젊은이의 관류 혈관 촬영으로 확인 젊은이의 오 하 클 다시 루
    15. 2 시간에 대 한 허 혈 성 심근의 reperfusion 허용. Reperfusion (2.1.8 및 2.1.9)의 10, 30, 60, 115 분 플라스마와 혈 청 샘플을 가져가 라. 60, 115 분 (2.1.10) 모니터 BGA.
    16. 허 혈에 대 한 사용으로 정확 하 게 동일한 위치로 guidewire 함께 PCI 카 테 터를 다시 넣습니다. 앞으로 PCI 카 테 터의 풍선을 부 풀 려 고 젊은이 폐색 혈관 (2.2.3) 촬영 합니다. 좌 심 실에서 압력 카 테 터를 제거 하 고 녹음을 중지.
    17. 주사 100 mL 2% 에반스 블루 인산에 중심 정 맥 라인에 식 염 수 (PBS, pH 7.4) 버퍼링. 약 30 s 후, 전체 동물 블루 때 주사 40 mL 20 %KCl 동물 안락사를. 죽음은 ECG 신호 및 펄스 파의 부재에 의해 확인 되었다.

3. 샘플링 기법

  1. 추출, 해 부 및 심장 (그림 4)
    1. 마음을 노출 sternotomy를 수행 합니다. 앞에서 설명한 Koudstaal 및 동료, 단계 8-2 8-318프로토콜을 따릅니다. 잘라 오픈 심 낭 종양, 이전 pericarditis에서 줄기 수 있습니다 추가 평가에서 동물을 제외 하 고는 검사 하는 동안.
    2. 폐 고 PCI 인도 카 테 테 르 제거. 추가 분석을 위해 심장 삭제하시오 베 나 정 맥을 잘라 고 혈액 흡입 펌프를 사용 하 여 다음 신체와 마음을 연결 하는 모든 큰 배를 잘라 제거 합니다.
    3. 실 온 식 염 수와 심장을 내부와 밖으로 헹 구 십시오. 온 마음을 무게.
    4. 30-40 분 이내 심장의 승 모 판, 날카로운 칼을 사용 하 여 긴 축에 수직인 Chordae tendinae 를 꼭대기에서 약 3-5 mm의 조각으로 잘라.
    5. 항상 복 부 면이 컷된 샘플 (그림 5)의 방향을 유지 하기 위해 동일한 방향에서 마음을 배치에 주의 해야 합니다.
    6. 디지털 싱글 렌즈 리 플렉스 카메라를 사용 하 여 심장의 조각 사진.
    7. 컷 멀리 오른쪽 심 실 (필요 하지 않습니다으로 삭제). 왼쪽된 심 실 조각 사진와 좌 심 실의 총 무게에 대 한 모든 조각 무게.
    8. 에반스 블루 긍정적인 하 고 모든 섹션에 에반스 블루 부정적인 조직 구분. 메스를 사용 하 여 비-허 혈 성 조직 (에반스 블루 긍정적인)에서 허 혈 성 (에반스 블루 부정적인)을 조각 해 부.
    9. 먼저 에반스 블루 부정적인 섹션 (위험, AAR에 허 혈 성 지역) 분석. 그들 모두의 무게와 모든 플라스틱 용기에 넣어.
    10. (심장 크기)에 따라 100-150 mL triphenyl tetrazolium 염화 솔루션 (TTC, 16 g Dextran, 분자량 48000-90000, 200 mL PBS, 갓 준비 2 세대)와 완전히 조각 커버 심장 조각 솔루션 안에 자유롭게 이동할 수 있다 그래야. 컨테이너를 커버 하 고 부드럽게 흔들어 동안 37 ° C에서 20 분 동안 품 어.
    11. 이 분 보육 시간 무게 에반스 블루 동안 긍정적인 조각 (위험, ANR에 지역), 포함 하는 조직-테크에 대 한 샘플을 채취 (부상에서 가장 말 초 부분 선택) 추가 분석을 위해-80 ° C에서 저장. 나머지 4% 포름알데히드 솔루션에 전송 하 고 조직학 단면도 위한 실내 온도에 저장 합니다.
    12. TTC 솔루션에서는 AAR의 조각을 제거 합니다. 빨간 얼룩진된 조직 가능한 허 혈 성 조직 (VIT) 이며 비 얼룩진 조직 괴 사 성 허 혈 성 조직 (니트)는. 2 작은 조각 (2-3 m m의 블록)에서 잘라 두 니트와 VIT, 조직-테크에 그들을 포함 하 고 추가 분석을 위해-80 ° C에서 저장. 이러한 샘플에는 동일한 무게가 있어야 합니다.
    13. 스티로폼 용기에 그들을 고정 하 고 증기 두건에서 실 온에서 24 h에 대 한 4% 포름알데히드 솔루션과 완전히 덮고 하 여 조각 (AAR는에서 파생 된 모든 분할 영역)의 나머지를 해결. 조각 플랫 다음 단계에서 사진 설명서에 대 한 있어야 합니다.
    14. 다음 날 사진 고해상도 카메라는 동일한 확대/축소 설정 및 조직 (동일한 확대)에서 거리와 함께 조각의 양쪽. 모든 사진에 자동 눈금 막대를 추가 합니다. 모든 바 같은 길이 필요 합니다.
      참고: 고해상도 카메라는 자동으로 각 사진에 눈금 막대를 추가 하는 소프트웨어에 연결 되어야 합니다.
  2. AAR 및 경색 크기의 계산
    1. 좌 심 실의 AAR % = (g에서 AAR의 무게 / 무게 g에서 좌 심 실의) * 100.
    2. ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 AAR 니트 (각 조각의 양쪽 모두)는 사진에 따라의 총 면적을 계산.
    3. 각 도구에서 직선을 사용 하 여 눈금 막대 길이 선택 하 여 눈금 막대를 조정 합니다. 분석 메뉴에서 선택 > 설정 규모 알려진된 거리 눈금 막대의 단위를 삽입 하 고. 그래서 같은 규모는 모든 사진에 적용 됩니다 "글로벌"을 선택 하십시오.
    4. AAR 계산 무료 손을 선택 도구를 사용 하 여 조직의 전체 면적을 표시 합니다. 수는 조직 및 지방 조직 (그림 6-C) 측면 (높이)를 포함 하지 않도록 주의 하십시오.
    5. "지역" 및 분석에서 "레이블 표시"를 선택 하 여 측정을 설정 > 설정 측정 메뉴. 분석에서 표면적 측정 > 측정.
    6. 3.2.5 측정 니트 (마크 비 얼룩진 조직) 단계를 반복 합니다. 참고: 알 계산에서 지방 조직 (그림 6-D)를 포함 하지 마십시오. 조직의 다른 쪽에 있는 단계를 반복 합니다.
    7. 평균 AAR 및 니트 직물의 각 조각을 위해 계산 합니다.
    8. 3.2.7에서 가져온 값을 사용 하 여 니트 AAR:% 니트 AAR의 계산 = (Σ 평균 면적 니트의 cm2/ Σ는 cm2AAR의 표면적 평균) * 100.
    9. 두 개의 다른 조사 위의 방법을 반복 해야 합니다. 차이의 허용 한계 < 10%입니다.
  3. 허 혈 마커
    1. EDTA 플라스마 견본, 이전 심장 분의 수준을 측정 하-80 ° C (2.1.9)에 저장 된를 사용 하 여-단일-플렉스 Luminex 형 분석 결과 사용 하 여 이전 설명한 19.

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Representative Results

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1 동물 FXIIa 억제제 또는 제어 펩 티 드의 기술적 오류 (시험 물질의 추가 하기 전에 허 혈 시간 동안 혈압의 급강하) 관리 전에 성급 하 게 사망 했다. 한 동물 때문에 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해 없음 왼쪽된 앞쪽 하강 동맥 (젊은이)의 비정상적인 해부학 때문에 관찰 되었다 FXIIa 억제제 그룹에서 제외 했다. 정점를 포함 하 여 좌 심 실의 큰 부분 이었다이 동물에 곡절 동맥에 의해 끼얹는다. 최종 분석에 포함 하는 동물 들이 n = bicyclic FXIIa 펩 티 드 억제 물 그룹에서 2 (27.5 ±의 무게를 의미 2.5 k g)와 n = 3는 비활성 bicyclic 제어 펩 티 드를 받고 (29 ±의 무게를 의미 0.8 k g).

X 선 영상 이미징/돼지 심장의 관상 동맥 혈관 압력 카 테 터의 위치를 시각화 하 고 젊은이 (그림 3A)을 차단 하도록 결정 하는 데 사용 됩니다. 그림 3B 는 두 번째 대각선 지점에 말 초 혈액의 흐름 차단 테 위치를 보여준다. 그림 3A 3B 의 비교는 또한의 부분은 젊은이 제공 심근의 허 혈 성 될 것입니다 추정 수 있습니다. 2 h reperfusion 기간의 끝에 PCI 테 재 이며 같은 위치에서 비정상적으로 국 소 빈 혈. 에반스 블루는 다음 주입 정 맥 AAR (그림 5A)를 정확 하 게 결정. 심장의 절단, 후 좌 심 실 승 모 판, 긴 축에 수직인 최대 정점에서 3-5 m m 두꺼운 부분으로 슬라이스입니다. AAR 및 ANR는 에반스 블루 조각에 얼룩에 의해 명확 하 게 구분 됩니다. AAR 및 ANR 샘플링 분야는 그림 5B에서 표시 됩니다.

AAR, 라스베가스의 비율로 표시 FXIIa 대우 그룹 및 제어 그룹 (그림 6A) 사이 통계적으로 유의 한 차이가 표시 됩니다. 경색 크기 (니트/AAR) 중 그룹 간의 차이가 보여줍니다 (비패라메트릭 맨-휘트니를 사용 하 여 테스트, p > 0.05, 그림 6B). 이러한 데이터는 FXIIa 억제제 사용된 농도 및 응용 프로그램의 기간에 혼자 심근에서 마음을 보호 하지 수 것이 좋습니다 I / R 상해. 그림 6 c 와 6 D 정확 하 게 그리고 reproducibly 각각 표면 영역을 측정 하기 위하여 AAR 및 니트 테두리를 표시 하는 방법을 보여 줍니다.

혈액 샘플링 전략 심장 근육 손상 마커 심장 분의 릴리스 수 있습니다-시간이 지남에 따라 모니터링할 난. Reperfusion 거기는 그림 7에서 같이 시간이 지남에 지속적인 증가 후에 국 소 빈 혈 동안 기준선의 1 시간 후 거의 차이가 있다. 분에 대 한-난, 남북 그룹의 차이 했다 또한이 실험에서 중요 한.

Figure 1
그림 1 . 실험 시간 표시 막대의 개요. 도식 시간에 표시 한 막대 심근 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해 모델에서 중요 한 단계에 대 한 기준선 관상 시각화, 시작은 허 혈의 시간, 심장 부정맥 모니터링 및 테스트 물질을 주입 실험에서 중요 한 단계가 있습니다. 모든 실험에 정확한 타이밍의 사용 재현성을 보장합니다. 동물 및 심장의 절단을 euthanizing 2 h reperfusion 단계의 완료 후 15-20 분 내에서 수행 되어야 합니다. KCl: 칼륨 염화입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . 혈액 샘플링 및 분석의 타임 라인. 혈액 샘플링 시간 포인트 응고 제 사용의 종류와 함께 표시 됩니다. 추가 샘플 측정 실험 및 analytes에 따라 취할 수 있습니다. 법: 응고 시간, BGA 활성화: 혈액 가스 분석, RT: 실 온. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 . 관상 동맥 혈관. 기준선에서 (A) 왼쪽된 coronaries fluoroscopic 볼, 노란색 화살표는 첫 번째 및 두 번째 대각선 가지 포인트 흰색 화살표를 가리키는 심장 꼭대기 왼쪽된 심 실 (LV)의 아무 흐름 영역을 보여주는 (B) 폐색된 젊은이 PC에 빨간색 화살표가 가리키는 나 카 테 터 (C) 다시는 reperfusion의 끝에 다시 국 소 빈 혈 동안 젊은이 있는 동일한 사이트에 삽입 된 PCI 테의 풍선에 젊은이의 폐쇄. CX: 곡절 관상 동맥, 젊은이: 왼쪽 앞쪽 내림차순 관상 동맥, MC: 밀러 카 테 터, 좌 심 실에 삽입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . 조직 샘플링의 도식 차트. 심장 해 부의 정확한 타이밍 그리고 추가 분석을 위해 여러 분야의 샘플링. 타임 라인 205 분 초의 허 혈, 동물 실험의 종료 후 20 분 후 시작 됩니다. 그것은 동물을 euthanizing 후 최대 40 분 내에서 TTC에 조직 단면도 품 어 해야 합니다. ANR, VIT 알의 샘플링 흰색 사각형으로 표시 됩니다. 4% 포름알데히드에 AAR 잠복기 경색 크기의 정확한 결정에 대 한 니트와 VIT 사이 명확한 구별을 허용 한다. AAR: 위험, ANR에 영역: 위험, LV에 지역: 좌 심 실, 니트: 괴 사 성 허 혈 성 조직, OTC: 조직-테크, RV: 우 심 실, TTC: triphenyl tetrazolium 염화, VIT: 가능한 허 혈 성 조직. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 . 위험 (AAR)에 지역 및 위험 ANR에 지역 사이 제자리 차별화. (실험의 끝에 sternotomy 직후 온 마음 A) 대표 그림. (절 개 후 3-5 m m 두꺼운 왼쪽된 심 실 분할 영역을 보여주는 B) 대표 사진입니다. AAR ANR은 명확 하 게 정의 노란색 화살표로 표시 하 고 흰색 화살표 ANR 샘플링 영역 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 . 허 혈 및 경색 크기입니다. (A) 왼쪽된 심 실 (LV)의 AAR의 백분율 무게. (는 AAR의 니트 B)는 백분율 표면 영역. AAR 계산 (C) A 대표 그림. (D) 니트 계산의 대표 사진. 흰색 화살표는 VIT 샘플링 영역을 표시 하 고 검은색 화살표 니트 샘플링 영역 표시. 데이터는 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 계산 했다. 값은 점 각각에 대 한 실험 평균 ±±의 표시와 함께 sd. 컨트롤 그룹, n으로 표시 됩니다 3와 FXIIa 억제제 치료 그룹, n = = 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7 . 심장 근육 손상 표식입니다. 심장 분-내가 제어 및 FXIIa 억제제의 pg/ml에서 시간이 지남에 따라 농도 처리 그룹. 혈액 reperfusion 및 심장 분 중 기준, 국 소 빈 혈의 끝과 여러 시간 지점에서 EDTA 플라즈마 튜브로 경 정 맥에서 수집 된-단일-플렉스 서 스 펜 션 배열 (바이오 플렉스)에 의해 측정 되었다. 데이터 점 들 각각에 대 한 실험 평균 ±±의 표시와 함께 sd. 컨트롤 그룹, n으로 표시 됩니다 3와 FXIIa 처리 그룹, n = = 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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심근 I / R 상해는 급성 심근 경색3후 환자의 예 후에 직접 번역 최종 경색 크기에 큰 영향. 심근의 이상 이해 I / R 상해 감소 하거나 그것을 방지 하는 첫 단계입니다. 심근 I / R 상해 폐색된 혈관의 reperfusion 후 직접 발생 하는 심각한 상태입니다. I / R 상해 타고 난 면역 반응의 활성화 고 세포 손상을 reperfusion와 주변 조직20의 사이트에서 발생 합니다. 최근 연구 결과 뇌의 쥐 모델에서 신경 결과에 개선 보여 I / R 상해 FXIIa 억제제8로 치료 하면. 그러나, 현재 파일럿 연구에서 우리가 발견 bicyclic FXIIa 억제제의 영향을 주지 않습니다에 심근 I / R 상해. 사용된 FXIIa 억제제 소설 이며 돼지에서의 약 동학 아직 알려져 있지 않습니다. 따라서, 효과의 관찰된 부족은 부적절 한 주입 또는 응용 프로그램에 의해 원인일 수 있습니다. 이 후속 연구에서 해결 될 필요가 있다.

심근의 이상 심층에서 조사 필수적 이다 동물 모델을 표준화 I / R 상해 클리닉에 적합 한 솔루션을가지고. 심근의 이상 조사 I / R 상해 좋고 대표 샘플링 그것을 기본 세포 메커니즘 연구 필요. 돼지 닫힌된 가슴 심근 I / R 상해 모델은 임상 상황, 그리고 수 있도록 유용한 세포 메커니즘 및 이해 테스트 소설 새로운 치료제 재현 방법 제공. 위에서 언급 한 목적14,,1718현재 모델의 변종 전에 설명 되어 있다.

돼지에서 급성 심근 경색의 우리의 프로토콜 앞에서 설명한18,21로 amiodarone 사전 치료를 필요 하지 않습니다. 우리는 경 동맥 부 비 동 마사지 심장 부정맥과 심 동과 경우 cardioconversion에 대 한 복 형 제 세 동기를 줄이기 위해 사용. 심 방 세 동22, 영향을 경 동맥 부 비 동 마사지의 사용 알려져 임상 하지만 지금까지 그것은 표시 되지 방지 또는 심 동 미, 인간 또는 돼지 모델에서에서의 발병을 지연. 또한, sevoflurane 사용 하 여 심 실 부정맥으로 급성 심근 경색23의 돼지 모델에서 사망률을 줄일 수 있습니다.

재현성을 보장 하 고 실험 기간 동안 혈전 증의 위험을 감소, 헤 파 린의 여러 복용 법, 반복된 측정에 따라 주입 했다 보다는 헤 파 린 복용량 Koudstaal 외18여 예를 들어 설명 하는 대로 고정을 사용 하 여. 헤 파 린 관리 제어 양의 응고 캐스케이드의 맥락에서 조사 하는 데 도움이 / R 상해. 에반스 블루 AAR/라스베가스의 정확한 결심을 허용 한다. 에반스 블루 fluoroscopic 지도 허 혈 유도 중 정확한 사이트에서 젊은이의 재 폐색 리드는 ANR에 최소 영향 심장의 허 혈 성 비 부분을 포함 하 여 전체 돼지의 블루 얼룩 후의 정 맥 주입 심근 및 맥 관 구조입니다. 에반스 블루는24알려진된 세포 독성 물질 이다. 사용 하려면 심장 맥 관 구조에 ANR에 내 피 세포 층의 생존 능력을 유지 하기 위해 중요 한 그것이 현재 실험에서 내 개인으로 서 그것은 너무 100ml 에반스 블루 체계적으로 주입 되었고 전체 혈액 감소와 함께 희석 제어의 독성입니다. 이전에 비슷한 설정에서 50 ml 2% 에반스 블루 심장에는 세포 독성의 위험이 증가 coronaries에 직접 주입 했다25세포. 다음 중요 한 단계는 심장 승 모 판 (모든 동물에서 정확한 위치)와 좌 심 실의 백분율은 AAR의 정확한 계산을 만들기 위해이 메서드를 사용 하 여 정점에서 3-5 m m 조각으로 직접 해 부 했다.

메서드의 현재 설명 설명 하지 이전 미세한 세부 정보를 제공 합니다. 24 시간 동안 4% 포름알데히드에 섹션을 스테인드 TTC 잠복기 제공 가능한 (레드) 사이 명확한 구별 및 마지막으로 더 분자 얼룩에 대 한 샘플링의 재현성을 증가 하는 괴 (흰색) 조직. 혈액 샘플링 전략 reperfusion의 이상의 2 시간 나중 (60와 120 분)으로 reperfusion의 아주 초기 (10, 30 분) 단계에서 새로 표현된 분자의 검색 수 있습니다. 정확한 혈액 및 조직 샘플링 및 저장소 플라즈마 캐스케이드 마커 보완 및 응고 단백질의 표현 등의 분석에 대 한 중요 한 있습니다.

현재 프로토콜 일 몇 시간에서 더 이상 reperfusion 시간을 수정할 수 있습니다. 그러면 나의 나중 결과 조사 하는 연구원 / R 부상 마음에도 새로운 약물과 그들의 효과의 평가의 테스트 수 있습니다. 현재 프로토콜의 제한 심장 기능 측정에 대 한 압력-팁 카 테 터의 사용 이다. 심장 기능에 더 신뢰할 수 있는 데이터는 압력-볼륨 루프 측정 시스템의 사용에 의해 얻어질 수 있다. 요약에는 현재 제공 합니다 돼지 닫힌된 가슴 심근의 재현성을 증가 하는 데 필요한 자세한 중요 한 단계 I / R 상해 모델은 모델의 용도의 맥락에서 세포질이 고 분자 변화를 공부 하는 심근 공부 I / R 상해 이상 또는 새로운 치료 옵션을 공부.

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Disclosures

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

Acknowledgments

저자는 FXIIa 억제제 및 해당 제어를 제공 하기 위한 교수 기독교 Heinis를 인정 하 고 싶습니다. 우리는 또한 기꺼이 Olgica Beslac, 박사 다니엘 Mettler 및 실험적인 수술 단위, 생물 의학 연구, 기술 지원에 대 한 베른 대학에 대 한 부서에서에서 케이 Nettelbeck를 인정합니다. 셀 린 느 Guillod와 진단, Interventional 및 소아 방사선과, 베른 대학 병원에 대 한 부서에서 마 티아 스 Rausch Inselspital x 선 장비 및 기술 지원 제공. 이 프로젝트는 스위스 국립 과학 재단, 프로젝트 no. 320030_156193에 의해 투자 되었다. 우리 또한 커뮤니케이션 및 마케팅, 베른 대학 병원, 비디오 녹화 우리의 실험에 대 한 Inselspital에서 씨 Reto Haenni를 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABL 90 Flex, blood gas analyser Radiometer - Blood gas analysis (BGA)
ACT Plus Medtronic - Activated clotting time
Atropin Sintetica - Atropinum Sulfas, 0,5mg/ml
Balance (20-500 Kg) NAGATA Scale, Tiwan HTB/HTR Alternative products can be used
Balance (21-4200 g) Mettler toledo, Switzerland MS4002SDR Alternative products can be used
Blood collection tubes: EDTA, citrate and serum S-Monovette, Nuembrecht, Germany 05.1167.001,
05.1071.001
and
05.1557.001 respectively
Alternative products can be used
BV Pulsera mobile C-arm Philips - Alternative products can be used
Centrifuge Labcare, UK ALC PK120R Alternative products can be used
Defibrillator Lifepak 12 Medtronic - Alternative products can be used
Dextran from Leuconostoc mesenteroides Sigma-Aldrich, Germany D3759 Average M.wt 48000-90000
Digital single lens reflex camera Sony, Thailand DSLR-A500/A550 Alternative products can be used
Dissecting forceps Alternative products can be used
EMPIRA RX PCI dilatation catheter Cordis, Johnson&Johnson, USA 85R15300S Diameter 3 mm, length 15 mm, Alternative products can be used
EMPIRA RX PCI dilatation catheter Cordis, Johnson&Johnson, USA 85R15350S Diameter 3.5 mm, length 15 mm, Alternative products can be used
Evans Blue Sigma-Aldrich, Germany E2129 Toxic
Fabius GS premium respirator Dräger, Lübeck, Germany - Anesthesia work station, Alternative products can be used
Fentanyl Inselspital ISPI - Fentanyl 2500mcg/50ml
Formaldehyde Pathology Institute, Bern University SI148701 Alternative products can be used
FXIIa inhibitor Provided by Prof. Christian Heinis' laboratory in EPFL Novel bicyclic peptide
Galeo, coronary guidewire Biotronik, Germany 125497 Alternative products can be used
Guidance catheter Boston Scientific, Florida, USA 34356-06 6F (100 cm, EB3.75). Alternative products can be used
Heparin Sodium Drossapharm, Basel, Switzerland - Liquemin, 25000 U.I./5 ml
High end electrosurgery BOWA, Germany ARC 400 Electrical source for blood suction. Alternative products can be used
Hydro-Guardmini breathing filter Intersurgical, Lithuania 1745000 Filters
Image J National Institute of Health, USA 1.47v Alternative products can be used
Inflation device, Atrion QL2530 Atrion medical product, Alabama, USA 96402 Alternative products can be used
IntelliVue MP 70 Philips, Boeblingen, Germany - Monitor (ECG, heart rate, blood presure and body temperature). Alternative products can be used
KCl Sintetica SA - Potassium chloride 15%
Ketamine Vetoquinol - Narketan, 1ml/100mg
LR-ACT Medtronic 402-01 ACT special syringes
Midazolam Roche - Dormicum, 5mg/ml
Monopolar scalpel Alternative products can be used
Needle holder Alternative products can be used
High resolution camera, PathStand Macro Imaging Stand for Grossing Spotimaging, USA 1080 p HD resolution. Alternative products can be used
PBS In-house preparation - Alternative products can be used
Peripheral venous cannula, 18 G Alternative products can be used
PowerLab 4/35 data acquisition system Adinstruments, Spechbach, Germany -
Rotamax120T Heidolph, Germany 544-41200-00 Shaker. Alternative can be used
Rüschelit-Super Safety Clear Tube Teleflex, Dublin, Irland 112480 Air way tubing, Alternative products can be used
Safe Pico Aspirator Syringes Radiometer 956-622 BGA special syringes
Saline Sintetica Bioren - NaCl 0,9%. Alternative products can be used
Sevorane 1.5% AbbVie AG - Sevorane 250ml 100%
Sheath Cordis, Johnson&Johnson, USA 504-607 A AVANTI + / 7 F, Alternative products can be used
Space infusion pump B.Braun Medical AG, Germany - For infusion of fentanyl. Alternative products can be used
SPR-350 (Millar catheter) Adinstruments, Texas, USA 840-8166 MIKRO-TIP, 5F, 120 cm
Sternotomy saw Alternative products can be used
Sutures ETHICON, Johnson&Johnson, USA Y3110H Monocryl 3-0 SH-1 Plus. Alternative products can be used
Syringes (20, 10 and 5 mL) CODAN,Baar, Switzerland 62.7602,
62.6616,
62.5607
respectively
Used to inject anesthetic materials intramuscularly or directly into the central venous line. Also to inject heparin or FXIIa or the respective control. Alternative products can be used
Thorax spreader Alternative products can be used
Tissue-tek SAKURA, Netherlands 4583 O.C.T. compound
Vascular forceps Alternative products can be used
Xenetix 300 contrast media Guerbet, Zürich, Switzerland - Lobitridol, 300 mg iodide/ml
Xylazine Vetoquinol - Xylapan, 20mg/1 mL
2,3,5-Triphenyltetrazolium choride Sigma-Aldrich, Austria T8877
500 μL tubes (eppendorf) Trefflab, Switzerland 96.08185.9.03 Alternative products can be used

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References

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조직 및 혈액 샘플링 절차의 표준화에 의해 닫힌된 가슴 돼지 심근 경색 모델의 개선
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Abdelhafez, M. M., Shaw, J., Wilbs, J., Despont, A., Rieben, R. Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures. J. Vis. Exp. (133), e56856, doi:10.3791/56856 (2018).More

Abdelhafez, M. M., Shaw, J., Wilbs, J., Despont, A., Rieben, R. Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures. J. Vis. Exp. (133), e56856, doi:10.3791/56856 (2018).

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