Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Улучшение модели свинину инфаркт миокарда закрытой груди путем стандартизации процедур отбора проб крови и тканей

doi: 10.3791/56856 Published: March 12, 2018

Summary

Здесь мы показываем, протокол стандартизировать процедуры отбора проб установленным свинину модели острого инфаркта миокарда с целью увеличить ее поступательное значение в понимании повреждения миокарда ишемия/реперфузия патофизиологии и проверить роман наркотиков кандидатов.

Abstract

Миокардиальной ишемии-реперфузии (I / R) травмы способствует почти половина из области некротические после инфаркта миокарда. На сегодняшний день, есть нет утвержденной наркотиков для предотвращения или сокращения миокарда я / R травмы. Изучение и понимание патофизиологических механизмов миокарда я / R травмы необходимо разработать успешного лечения. Большие эксперименты на животных являются важным шагом в трансляционной методов. Установлены и описаны себя и других свинину модель острого инфаркта миокарда. Мы стремились улучшить значение модели, сосредоточив внимание в деталях на методы отбора проб для использования в будущих экспериментах. Кроме того мы подчеркиваем небольшие, но важные шаги, которые могут повлиять на качество конечных результатов. Чтобы имитировать клинических положение миокарда я / R травмы, катетер перкутанеус коронарным вмешательством (PCI) был вставлен в левой передней нисходящей коронарной артерии (LAD) наркотизированных свиньи. ° ° °, Эта модель имитирует острого инфаркта миокарда и PCI лечения людей с возможностью точного определения области на риск а также некротические- и жизнеспособной ишемии тканей. Здесь была использована модель, чтобы исследовать эффект ингибитор бициклических пептидные FXIIa. Модели также могут быть изменены чтобы позволить больше реперфузии раз изучить позднее последствия инфаркта миокарда.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ишемическая болезнь сердца, в частности острый инфаркт миокарда (MI), является основной причиной смерти в развитых странах 1. Сегодня стандартное лечение ми является перкутанеус коронарным вмешательством (PCI), лечение катетер шар. Одним из важных факторов, которые влияет на качество жизни и прогноз у пациентов после PCI-лечение острых ми является размер миокарда. Сокращение размера может иметь большое влияние на пациента выживания и прогноз 2. Миокарда ишемии/реперфузии (I / R) травмы имеет значительное влияние на размер миокарда, поэтому одна из главных целей в области сердечно-сосудистых исследований для предотвращения или сокращения миокарда я / R травмы 3. Точные механизмы I / R травмы находятся в стадии расследования 4. Активация плазмы каскады и эндотелиальных клеток являются отличительными чертами я / R травмы 5. Активация системы коагуляции является явно участвуют 6,7. Недавно была показана роль FXII, как ранние вверх по течению пептид, участвующих в контактная фаза активации коагуляционного каскада, в FXII выбить крысы модель мозга я / R травмы 8. Проверка этих результатов в свинину модели представляет собой важный шаг в клинической перевод. Таким образом, мы проводим тестирование ингибитор FXIIa Роман бициклических (80 кДа протеазы) в контексте миокарда я / R травмы в ходе экспериментального исследования.

Животные модели, которые имитируют клинической ситуации острой ми и PCI лечения, имеют важное значение для улучшения нашего понимания патофизиологии миокарда я / R травмы и опробовать новые методы лечения. Свиньи представляют собой хороший животных модель для клинических миокарда я / R травмы. Это не только потому, что их сердца очень похожи на человеческие сердца по анатомии и коронарное кровообращение, но они также показывают аналогичные патофизиологические реакции миокарда ишемии и реперфузии 9,10. Другие модели, такие как мыши и крысы не выполнить эти критерии и показывают существенные различия по сравнению с человеческого сердца 11,12, тогда как собаки например, имеют много больше залога коронарных сосудов по сравнению с людьми 13.

Свинину острого инфаркта миокарда модель широко используется в сердечно-сосудистых исследований расследовать, ишемическая болезнь сердца, включая миокарда я / R травмы 14,,1516,17. Последний является воспалительные состояния, из-за которых минимизации воспалительной реакции, относящиеся к стернотомии или торакотомии, используемых в открытом грудной хирургии имеет важное значение. Закрытые грудь модели, с помощью клинических условиях ангиографии C-рука преодолевает эту проблему. Кроме того одним из наиболее важных моментов является наш протокол обеспечивает точное различие между ишемической (зона риска, AAR) и не ИБС областей левого желудочка (площадь не риску, НРУ) таким образом, чтобы размер infarct (ишемический некротических тканей, НИТ) можно следует точно определить. Наша цель этого документа заключается в четко определить воспроизводимые методологии свинины миокарда я / R травмы модель, в частности в отношении выборки ткани миокарда, что позволит обеспечить более точный анализ молекулярных механизмов я / R травмы и четкое представление о последствиях новых лекарств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. животные:

Все животные были обработаны согласно руководящим принципам швейцарской национальных законов. Это исследование был одобрен Комитетом местных экспериментов на животных кантона Берн (разрешение нет. БУДЬТЕ 25/16).

Используйте большой белой свиньи обоих полов (~ 30 ± 5 кг). Разделить животных слепо на две группы, одна группа, получение ингибитор бициклических (80 кДа протеазы) FXIIa или лечения выбора и других неактивного элемента управления.

2. хирургическая процедура (рис. 1)

  1. Анестезия и подготовка животного:
    1. Быстро животных за 12 ч до начала эксперимента.
    2. Предварительно лечить животное с 20 мг/кг кетамин и 2 мг/кг Ксилазина через внутримышечной инъекции в горловину, используя шприц 10 мл. Запишите вес животного и секс.
    3. Вызвать обезболивание путем инъекций 0,5 мг/кг мидазолама и 0,05 мг/кг Atropin в аурикулярной Вену. Интубировать животное с эндотрахеальной трубки.
    4. Поддержание анестезии путем механической вентиляции с помощью искусственного дыхания (O2/air 1:3, Севоран 1,5%), 7-8 мм сократимость трубки и фильтр. Отрегулируйте фракция вдохновили кислорода (FiO2) до 35% и дыхательный объем до 6-10 мл/кг.
    5. Глубины анестезии оценивается как адекватные в отсутствие мотор или вегетативных реакций на щипал нос. Глазной рефлексов и челюсть тон осуществлялся непрерывно также ориентации челюсть расслабленной тон и отсутствие глазной рефлексов. Температура ядра постоянно контролируется и поддержание normothermia (38-38,5 ° C) было обеспечено с пассивной потепления (изоляция одеяла и теплой бутылки).
    6. Рассечь свободный, как описано в Koudstaal и его коллеги шаги 3-1-3-318, сонной артерии с обеих сторон и их иглу с оболочкой 7F. Иглу слева яремной вены с 7F оболочкой для забора венозной крови.
    7. Администрировать болюс дозе 250 мкг фентанила анальгетик через Центральный венозный линии следуют 250 мкг/ч как постоянное внутривенное вливание, используя Насос инфузионный. Мониторинг температуры тела, частоты пульса и ритм с 3-ведущий Электрокардиограмма (ЭКГ), артериальной и Центральное венозное давление в течение всего эксперимента.
    8. С помощью стандартной пробирки, вывести следующие базовые образцы крови от линии венозного: 5 мл citrated плазмы и 2.9 мл плазмы ЭДТА в соответствующие трубы. Центрифуга сразу на 2000 x g 15 мин при 4 ° C. Возьмите 2.9 мл крови в сыворотке трубку и позволяют свертывается на 30 минут при комнатной температуре до центрифугирования, как описано выше.
    9. Аликвота 200 мкл плазмы или сыворотки в 500 мкл трубки и хранить все образцы в-80 ° C для дальнейшего анализа.
    10. Вывести 0,5 мл крови из артериальной линии с помощью специальных крови газового анализа (BGA) шприцы для измерения BGA с помощью BGA машины в соответствии с инструкциями производителя.
    11. Вывести 0,5 мл крови из вен линии, используя стандартный 2 мл шприц и немедленно передать его в Закон патрон иглой 30 G. Вставьте заполненный картридж в акт машина для измерения время свертывания согласно инструкциям производителя. Смотрите Рисунок 2 для моментов времени.
    12. Позволяют животное, чтобы стабилизировать за 20 мин до начала эксперимента ми и администрировать 5000 МЕ нефракционированного гепарина в венозный линии, используя шприц 2 мл.
    13. Монитор действовать каждый 30-45 мин, как упомянуто в 2.1.11. Внутривенно вводить 2500 МЕ нефракционированного гепарина, если акт < 180 s.
  2. Инфаркт миокарда эксперимент
    1. Используйте стандартное оборудование рентгеноскопии рук C (программа коронарной ангиографии, угол 0°, 12 кадров в секунду, ~ 70 кв) - или же выделенный ангиографии системы - для выполнения коронарного вмешательства.
    2. Используйте флюорографическая руководство чтобы вставить катетер давления (5F, 120 см) через ранее установленный оболочка в левой сонной артерии. Продвиньте его в левый желудочек. Подключение давления катетер для приобретения системы для записи левого желудочка давления. Система сбора необходимо непрерывно вычисления и запись сердечного ритма, разработали давление, dP/dt максимум (сократимости левого желудочка) и dP/dt минимальный (релаксация левого желудочка) в течение всего эксперимента. Запись исходных значений для 10 мин.
    3. Вставьте 6F (100 см, EB3.75) руководящих катетер через оболочке ранее помещены в правой сонной артерии. Заранее его левой коронарной артерии для достижения левой передней нисходящей коронарной артерии (LAD) под руководством X-ray. Придать контрастного вещества с помощью 20 мл шприца через руководящие катетер для выполнения базовых коронарной ангиографии.
      Примечание: Инъекции контрастного вещества было сделано путем ручного давления но выделенной мощности инжекторная система может также использоваться.
    4. Оцените размер парень на рентгеновского монитора выберите соответствующий размер катетера перкутанеус коронарным вмешательством (PCI). Использование PCI шары с длиной 15-25 мм и диаметром от 2 до 3,5 мм в зависимости от размера лад. Соберите PCI катетера и коронарного проволочного проводника (F 014/J, 175 см). Соедините катетер PCI с устройством инфляции, предварительно заполнены с контрастным веществом.
      Примечание: Лад диаметр может измеряться непосредственно на откалиброванный монитор с помощью линейки и размер PCI шар затем выбирается соответственно.
    5. Вставьте собранный системы из 2.2.4 в Люмене руководящих катетера. Заранее проволочного проводника в лад, до тех пор, пока она выходит за рамки второй диагональной ветви парень.
    6. Используйте флюорографическая руководство для продвижения PCI катетер, пока он не достигнет примерно в середине парень. Выберите лад блокировки сайта в зависимости от анатомии coronaries, обычно после второго, иногда после первой диагональной ветви (рис. 3) для того чтобы иметь аналогичный процент AAR левого желудочка (LV).
      Примечание: Выбор блокировки сайта зависит от Длина диагонали ветвей и, таким образом, области ткани, который снабжается кровью через соответствующего подразделения. В случае продолжительной отделенные первый диагональной ветви блокировки сайта будет только после этого. В случае короче первый диагональной ветви блокирование осуществляется после второй диагонали.
    7. Извлеките проволочный проводник, а затем увеличить давление в устройстве инфляции в 7-10 бар, чтобы надуть шар PCI катетера и побудить ишемии миокарда, за 1 ч. постепенно увеличивать FiO2 до 50-60% от 15 до 40 мин ишемии. Держите дыхательный объем 6-10 мл/кг.
      Примечание: Эта процедура будет уменьшить возникновение экстрасистолы и уменьшить частоту вентрикулярные.
    8. Запись видео последовательности s 5-10 при инъекции контрастного вещества через руководящие катетер иметь Ангиограмма шар PCI катетер на месте только после запуска ишемии; Повторяйте после ишемии для проверки полной окклюзии лад, дистальнее шар PCI катетер в 10 минут.
    9. Мониторинг животных тесно для немедленно выявлять и лечить (2.2.10) сердечных аритмий. Экстрасистолы обычно происходят и увеличение частоты (> 3 / мин) от 20 до 40 мин после индукции ишемии миокарда. Если это происходит, мягко массаж шеи с обеих сторон под щеку. В большинстве случаев это будет достаточно для восстановления регулярного сердцебиение, вероятно, стимуляция блуждающего нерва барорецепторов, расположенный на общей сонной артерии.
    10. Если нарушения ритма сердца прогрессировать в фибрилляции желудочков, используйте внешний, двухфазный дефибриллятор восстановить синусовый ритм. Примените 5-10 компрессии грудной клетки с помощью дефибриллятора колодки непосредственно перед нанесением удара для того чтобы заполнить coronaries с кислородом кровь и затем шок с 150 J (для животных 30 кг).
    11. При необходимости повторите операцию и увеличение энергии до 175 J после 3rd шока. Используйте параметры повышенной энергии для тяжелее животных.
    12. Пять минут до конца времени ишемии повторить проб крови, упомянутых в 2.1.8-2.1.13. Придать испытываемого вещества (либо бициклические ингибитор FXIIa или управления 4 мг/кг, это делать это вслепую) внутривенно через Центральный венозный линии и скрытой линии с 20 мл физиологического раствора.
    13. Снимать один образец цитрат плазмы (как упомянуто в 2.1.8 и 2.1.9) 4 мин после парентерального введения вещества в 2.2.12.
    14. Выполните Ангиограмма (2.2.3) для подтверждения лад окклюзии, затем дефлирования шар катетер PCI и удалите этот катетер из руководящих катетер. Подтвердите перфузии лад дистального прикуса сайт, Ангиограмма сразу же после дефляции и удаления шара катетера PCI, 10 мин после этого, когда признаки ишемии миокарда были видны на ЭКГ для более чем 5 минут и непосредственно перед повторной окклюзии отрока.
    15. Разрешить реперфузии ишемии миокарда 2 h. Взять образцы сыворотки и плазмы в 10, 30, 60 и 115 мин реперфузии (2.1.8 и 2.1.9). Монитор BGA в 60 и 115 мин (2.1.10).
    16. Снова вставьте PCI катетер вместе с проволочного проводника в точно то же положение, как используется для ишемии. Надуть шар PCI катетер как раньше и подтвердите лад окклюзии, Ангиограмма (2.2.3). Удаление катетера давления из левого желудочка и остановить запись.
    17. Придать 100 мл 2% синий Эванс в фосфат буфер солевой раствор (PBS, рН 7,4) в Центральный венозный линии. Около 30 s позже, когда вся животное становится синим, придать 40 мл 20% KCl, чтобы усыпить животных. Смерть была подтверждена отсутствие сигналов ЭКГ и импульсных волн.

3. Определение выборки методы

  1. Извлечение, разбор и выборки сердца (рис. 4)
    1. Выполните стернотомии подвергать сердце. Следуйте ранее описанный Koudstaal и коллеги, шаги 8-2 и 8-318протокола. Разрежьте, перикарда при осмотре отклонений, которые могли бы вытекать из более ранних перикардит и исключить животное от дальнейшей оценки.
    2. Выкачать и удаление PCI, а также руководящих катетер. Акцизный сердца для дальнейшего анализа. Cut верхней полой вены и удаление крови с помощью всасывающий насос, а затем вырезать всех крупных сосудов, соединяющий сердце с телом.
    3. Промойте сердце внутри и снаружи с комнатной температуре физиологического раствора. Весят всего сердца.
    4. В течение 30-40 мин, сердце нарезать ломтиками около 3-5 мм от вершины к сосцевидными связки митрального клапана, перпендикулярно длинной оси, используя острый нож.
    5. Будьте внимательны и всегда место сердце в ту же ориентацию с брюшной стороной вверх, чтобы сохранить ориентацию вырезать образцы (рис. 5).
    6. Фотография ломтики сердца с помощью цифровых однообъективных зеркальный фотоаппарат.
    7. Отрежьте правого желудочка (отменить как не требуется). Сфотографировать ломтики левого желудочка и взвесить все срезы для общего веса левого желудочка.
    8. Различия между голубой Эванс позитивные и Эванс синий негативные ткани во всех разделах. Вскрыть ломтики отделить ишемического (Эванс синий негативные) от не ИБС ткани (синий Эванс положительным) с помощью скальпеля.
    9. Сначала проанализируйте Эванс синий негативные секций (ишемические области риска, AAR). Взвесить все их и поместить их всех в пластиковый контейнер.
    10. Обложка ломтики полностью с 100-150 мл (по данным Размер сердца) илидами tetrazolium хлорида раствор (2 g TTC, 16 g декстрана, молекулярный вес 48000-90000, 200 мл PBS, свежеприготовленные) так, что части сердца может свободно перемещаться внутри своего решения. Обложка контейнера и проинкубируйте 20 минут при 37 ° C во время нежно тряска.
    11. Во время этой 20 мин время инкубации весят Эванс синий позитивные штук (площадь не риску, НРУ), взять пробы для врезать ткани-Tek (выбрать наиболее дистальной части от травмы) и хранить при температуре-80 ° C для дальнейшего анализа. Перевести остальные на 4% раствор формальдегида и хранить при комнатной температуре для разделов гистологии.
    12. Удаление части AAR от TTC решения. Красный окрашенные ткани является жизнеспособным ишемии тканей (ВИТ) и -окрашенных тканей является ишемическая некротических тканей (НИТ). Вырезать 2 мелкие кусочки (блоки 2-3 мм) от так NIT и Вит, встраивать их в ткани - Tek хранения при температуре-80 ° C для дальнейшего анализа. Эти образцы должны иметь одинаковый вес.
    13. Исправьте остальные части (производный от AAR все срезы) путем закрепления их в контейнере из пенопласта и полностью охватывающих с 4% раствор формальдегида для 24 ч при комнатной температуре в зонта. Куски должен оставаться плоской для фотографической документации на следующем шаге.
    14. На следующий день фотография обе стороны куски с высоким разрешением камеры с же масштаб и расстояние от ткани (же увеличение). Добавьте автоматический масштаб баров для всех изображений. Все бары должны иметь одинаковую длину.
      Примечание: С высоким разрешением камеры должен быть подключен к программное обеспечение, которое автоматически добавляет линейку шкалы для каждой фотографии.
  2. Расчет AAR и размер infarct
    1. % AAR левого желудочка = (вес AAR в g / вес левого желудочка в g) * 100.
    2. Используйте программное обеспечение ImageJ вычислить площадь поверхности AAR и NIT (обе стороны каждого куска) на основе фотографии.
    3. Отрегулируйте линейки шкалы, выбрав бар длина шкалы, используя прямой линии от инструмент «угол». Выберите в меню Анализ > задать масштаб и вставить известные расстояние и единицы линейки шкалы. Выберите «глобальный» так же масштабе будет применяться ко всем изображениям.
    4. Марк всей поверхности ткани, используя инструмент выделения свободной рукой для вычисления AAR. Будьте осторожны, чтобы не включать на стороне (высота) ткани и/или жировой ткани (рис. 6-C).
    5. Значение измерения, выбрав «область» и «отображать метку «от анализ > меню задать измерения. Измерить площадь поверхности от анализ > мера.
    6. Повторите шаг 3.2.5 меру NIT (Марк только-окрашенных тканей). Примечание: Не включать жировой ткани (рис. 6 D) в расчет NIT. Повторите шаг на другой стороне ткани.
    7. Рассчитайте средний AAR и НИТ для каждый кусок ткани.
    8. Использовать значения, полученные из 3.2.7 для вычисления NIT в процентном отношении НИТ AAR AAR:% = (Σ средняя площадь поверхности NIT2см / Σ средняя площадь поверхности AAR см2) * 100.
    9. Две разные исследователи должны повторять выше метода. Приемлемые погрешность — < 10%.
  3. Ишемия маркеры
    1. Использовать образцы плазмы ЭДТА, которые были ранее сохранены на-80 ° C (2.1.9) для измерения уровня сердца тропонин-описанным ранее с помощью пробирного Luminex тип single-plex 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Одно животное преждевременно умер до отправления FXIIa ингибитор или управления пептид из-за технической ошибки (резкое падение артериального давления во время ишемии, перед добавлением испытываемого вещества). Одно животное был исключен из группы ингибиторов FXIIa, потому что не ишемии/реперфузии травмы наблюдалась вследствие ненормального анатомии левой передней нисходящей артерии (лад). Большая часть левого желудочка, включая вершины, был увлажненную диакритический артерии в этом животном. Животных, в конечном счете были n = 2 в группе бициклических FXIIa пептид ингибитора (средний вес 27,5 ± 2,5 кг) и n = 3, получающих неактивного элемента управления с бициклическими пептида (средний вес 29 ± 0,8 кг).

Рентгеновской видео изображений / коронарной ангиографии сердца свиньи используется для визуализации положение катетера давления и решить, где блокировать лад (рис. 3A). Рисунок 3B показывает положение катетера, блокирования кровообращения дистальнее второй диагональной ветви. Сравнение на рисунке 3а и 3B также позволяет оценки которого будет ишемического частью лад предоставленный миокарда. В конце периода реперфузии 2 h PCI катетер вновь и завышена в том же положении, как это было во время ишемии. Эванс, синий затем вводят внутривенно точно определить AAR (Рисунок 5A). После иссечения сердца левого желудочка является ломтиками толщиной разделов 3-5 мм от вершины до митрального клапана, перпендикулярно длинной оси. AAR и НРУ четко демаркированы, Эванс синего окрашивания на ломтики. AAR и НРУ выборки районов показаны на рисунке 5B.

AAR, выражается в процентах от LV, показывает никаких статистически значимых отличий между FXIIa лечение и группой управления (рис. 6A). Размер infarct (NIT/ААЖД) показывает никаких различий между группами либо (с использованием непараметрических Манна-Уитни тест, p > 0.05, Рисунок 6B). Эти данные позволяют предположить, что ингибитор FXIIa только, при употреблении концентрации и продолжительность применения, не смогли защитить сердце от миокарда я / R травмы. Рисунок 6 c и 6 D показано, как пометить AAR и NIT границ для герметизации и точно измерить соответствующие площади поверхности.

Стратегия выборки крови позволяет освобождение сердца тропонин маркер повреждения сердечной мышцы-я контролироваться с течением времени. Существует почти нет разницы после одного часа ишемии с базовой во время после реперфузии есть непрерывный рост с течением времени, как показано на рисунке 7. Для тропонин-я, межгрупповых различий также не были значимыми в этих экспериментах.

Figure 1
Рисунок 1 . Обзор экспериментальных timeline. Схематическая хронология за важные шаги в модель повреждения миокарда ишемии/реперфузии. Базовые коронарного визуализации, начиная время ишемии, мониторинг сердечного ритма и инъекционных испытываемого вещества являются важными шагами в эксперименте. Использование точных сроков всех экспериментов обеспечивает воспроизводимость. Euthanizing животное и иссечения сердца должно быть сделано в течение 15-20 мин после завершения этапа 2 часа реперфузии. Хлористого калия: хлорид калия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Хронология и анализа проб крови. Моменты времени для забора крови указаны вместе с типа антикоагулянта используется. Дополнительные образцы могут приниматься по данным эксперимента и аналитов измеряется. Закон: активации свертывания время, BGA: кровь газового анализа, RT: комнатной температуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Коронарография. Флюорографическая зрения (A левый coronaries на базовом, Желтые стрелки указывают на первой и второй диагональной ветви, белая стрелка указывает на верхушки сердца (B перекрытых лад, показаны не потока области левого желудочка (LV), красная стрелка указывает на ПК Я катетера (C) повторного закрытия отрока в конце реперфузии с баллоном катетера PCI, повторная установка на тот же сайт в лад, как во время ишемии. CX: диакритический коронарной артерии, лад: левой передней нисходящей коронарной артерии, MC: Миллар катетер, вставляется в левый желудочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Схематическая диаграмма ткани проб. Точные сроки сердце диссекции и выборки различных областей для дальнейшего анализа. Шкалы времени начинается в 205 мин после начала ишемии, 20 мин после окончания животного эксперимента. Это важно для инкубации разделов ткани в TTC в течение максимум 40 мин после euthanizing животное. Отбор проб НРУ, Вит и NIT обозначается как белые квадраты. Инкубации AAR на 4% формальдегида позволяет четкое различие между НИТ и вит для точного определения размер infarct. AAR: области риска, НРУ: площадь не риску, LV: левого желудочка, NIT: ишемическая некротических тканей, OTC: ткани-Tek, RV: правый желудочек, TTC: илидами tetrazolium хлорид, Вит: жизнеспособных ишемии ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 . In situ дифференциация между риску (AAR) и не риску НРУ. (A) представитель изображение всего сердца сразу после стернотомии в конце эксперимента. (B) представитель рисунок 3-5 мм ломтиками толщиной левого желудочка после вскрытия. AAR и НРУ четко определены, обозначается желтой стрелки, и белая стрелка показывает области выборки НРУ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 . Размер ишемии и инфаркта. (A) доля вес AAR левого желудочка (LV). (Б) процент площади поверхности NIT AAR. (C) представитель изображение расчета AAR. (D) представитель картина NIT вычисления. Белая стрелка показывает области Вит выборки и черная стрелка показывает области выборки NIT. Данные были рассчитаны с использованием ImageJ программного обеспечения. Значения отображаются как точек для каждого экспериментировать с указанием среднее ± SD. контрольной группы, n = 3 и FXIIa лечение ингибитором группы, n = 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 . Маркеров повреждения сердечной мышцы. Сердца тропонин-я концентрация со временем в ПГ/мл как управления, так и FXIIa ингибитор относились группы. Кровь была собрана от яремной вены в ЭДТА трубы плазмы на базовой линии, конце ишемии и несколько моментов времени во время реперфузии и сердечная тропонин-я был измерен сингл plex подвеска массив (био-Plex). Данные отображаются как точек для каждого экспериментировать с указанием среднее ± SD. контрольной группы, n = 3 и FXIIa лечение группы, n = 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Миокарда я / R травмы имеет значительное влияние на размер окончательного инфаркте, которая непосредственно переводится на прогноз пациента после острого инфаркта миокарда3. Понимание патофизиологии миокарда я / R травмы является первым шагом, чтобы уменьшить или предотвратить его. Миокарда я / R травмы является острый состояние, которое возникает непосредственно после реперфузии окклюзии сосудов. Я / R травма приводит к активации врожденного иммунного ответа и клеточных повреждений происходит на сайте реперфузии и окружающих тканях20. Недавнее исследование показало улучшение в неврологический исход в мышиной модели мозга я / R травмы при лечили ингибитором FXIIa8. Однако, в рамках нынешнего экспериментального исследования мы обнаружили никакого влияния ингибитора бициклических FXIIa на миокарда я / R травмы. Используемые ингибитор FXIIa — Роман и его фармакокинетики в свиней пока не известны. Таким образом наблюдаемое отсутствие эффекта может быть вызвана ненадлежащее дозирования или приложения. Это должно решаться в последующих исследованиях.

Стандартизация животную модель имеет важное значение для расследования в глубине патофизиологии миокарда я / R травмы и довести подходящие решения в клиниках. Изучения патофизиологии миокарда я / R травмы требует хороших и представительной выборки с целью изучения клеточных механизмов, лежащих в его основе. Свинину закрытых грудной клетки миокарда я / R травмы модель обеспечивает используется воспроизводимый метод, который недалеко от клинической ситуации и помочь понимание клеточных механизмов и тест Роман новых терапии. Были описаны варианты настоящей модели перед выше упомянутых целей14,17,18.

Наш протокол острого инфаркта миокарда в свиней не требуется предварительной обработки с амиодарон как описано18,21. Мы использовали массаж каротидного синуса для уменьшения сердечного ритма и двухфазный дефибриллятор для cardioconversion в случае фибрилляции желудочков. Использование массаж каротидного синуса клинически известно влияние фибрилляции22, но пока не доказано предотвратить или отсрочить наступление фибрилляции желудочков в ми, в организме человека или свиньи моделей. Кроме того использование севофлюран помогает уменьшить желудочковых аритмий, а также уровень смертности в свинину модели острого инфаркта миокарда23.

Для обеспечения воспроизводимости и уменьшить риск тромбоза во время эксперимента, несколько доз гепарина вводили, основанный на повторные измерения закона, а не с помощью фиксированной дозы гепарина как описано, например, Koudstaal et al18. Контролируемое количество гепарина администрации помогает расследовать каскада коагуляции в контексте I / R травмы. Эванс Blue позволяет точное определение AAR/LV. Внутривенные инъекции Эванс синий после повторной окклюзии лад в точное место во время ишемии индукции под fluoroscopic наведением приводит к голубой окраски целиком поросенок, включая не ИБС частью сердца с минимальным влиянием на НРА миокард и сосудистую. Эванс Blue является известный цитотоксическое вещество24. В текущем экспериментов, было чрезвычайно важно поддерживать жизнеспособность слоя эндотелиальных клеток в НРУ в сердце сосудистую для того, чтобы использовать его как индивидуал внутри управления так 100 мл синий Эванс был системно вводят и разбавляют цельной крови сокращения ее токсичность. Ранее в аналогичных условиях, 50 мл 2% синий Эванс был введен непосредственно в coronaries, увеличивая риск его цитотоксичность сердечной клетки25. Следующим важным шагом было вскрыть непосредственно ломтиками 3-5 мм от вершины до митрального клапана (точное положение в каждое животное) и с помощью этого метода, чтобы сделать точный расчет AAR как процент от левого желудочка сердца.

Текущее описание метода обеспечивает более мелкие детали, которые ранее не были описаны. Инкубации TTC окрашенных раздел 4% формальдегида для 24 часов обеспечивает четкое различие между жизнеспособным (красный) и некротических тканей (белый), который наконец увеличивает воспроизводимость выборки для молекулярной пятнать. Стратегия выборки крови свыше 2 h реперфузии позволяет обнаружение недавно выраженной молекул на самых ранних этапах (10 и 30 мин) реперфузии, а также позднее (60 и 120 мин). Правильные крови и тканей выборки и хранения также важны для анализа плазмы Каскад маркеров, такие как выражение дополнением и коагуляции белков.

Текущий протокол может быть изменен на длиннее время реперфузии, от нескольких часов до суток. Это позволяет исследователю расследовать позднее последствия I / R травмы на сердце и также позволяет тестирование новых наркотиков и оценки их воздействия. Ограничение нынешнего протокола является использование давления кончик катетера для оценки функции сердца. Более надежные данные о сердечной функции можно получить с помощью системы измерения давления объем цикла. Текущий метод обеспечивает подробные важные шаги, необходимые для увеличения воспроизводимость свинину закрытых грудной клетки миокарда я / R модель травмы, когда назначение модели является изучение клеточных и молекулярные изменения в контексте Изучая миокарда я / R патофизиологии травмы или изучения новых терапевтических возможностей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы отметить профессор Кристиан Heinis ингибитор FXIIa и соответствующего элемента управления. Мы также выражаем благодарность Ольгики Beslac, д-р Даниэль Mettler и Кей Nettelbeck от блока экспериментальной хирургии, Департамент биомедицинских исследований, Университет Берн для технической поддержки. Селин Guillod и Маттиас Rausch от Департамента для диагностики, Interventional и педиатрической рентгенологии, больницы университета Берн, Inselspital оказали поддержку с рентгеновского оборудования и техники. Этот проект финансировался Швейцарский Национальный научный фонд проекта № 320030_156193. Мы хотели бы также поблагодарить г-н Reto Haenni от коммуникации и маркетинга, госпиталь университета Берн, Inselspital для видеозаписи наш эксперимент.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABL 90 Flex, blood gas analyser Radiometer - Blood gas analysis (BGA)
ACT Plus Medtronic - Activated clotting time
Atropin Sintetica - Atropinum Sulfas, 0,5mg/ml
Balance (20-500 Kg) NAGATA Scale, Tiwan HTB/HTR Alternative products can be used
Balance (21-4200 g) Mettler toledo, Switzerland MS4002SDR Alternative products can be used
Blood collection tubes: EDTA, citrate and serum S-Monovette, Nuembrecht, Germany 05.1167.001,
05.1071.001
and
05.1557.001 respectively
Alternative products can be used
BV Pulsera mobile C-arm Philips - Alternative products can be used
Centrifuge Labcare, UK ALC PK120R Alternative products can be used
Defibrillator Lifepak 12 Medtronic - Alternative products can be used
Dextran from Leuconostoc mesenteroides Sigma-Aldrich, Germany D3759 Average M.wt 48000-90000
Digital single lens reflex camera Sony, Thailand DSLR-A500/A550 Alternative products can be used
Dissecting forceps Alternative products can be used
EMPIRA RX PCI dilatation catheter Cordis, Johnson&Johnson, USA 85R15300S Diameter 3 mm, length 15 mm, Alternative products can be used
EMPIRA RX PCI dilatation catheter Cordis, Johnson&Johnson, USA 85R15350S Diameter 3.5 mm, length 15 mm, Alternative products can be used
Evans Blue Sigma-Aldrich, Germany E2129 Toxic
Fabius GS premium respirator Dräger, Lübeck, Germany - Anesthesia work station, Alternative products can be used
Fentanyl Inselspital ISPI - Fentanyl 2500mcg/50ml
Formaldehyde Pathology Institute, Bern University SI148701 Alternative products can be used
FXIIa inhibitor Provided by Prof. Christian Heinis' laboratory in EPFL Novel bicyclic peptide
Galeo, coronary guidewire Biotronik, Germany 125497 Alternative products can be used
Guidance catheter Boston Scientific, Florida, USA 34356-06 6F (100 cm, EB3.75). Alternative products can be used
Heparin Sodium Drossapharm, Basel, Switzerland - Liquemin, 25000 U.I./5 ml
High end electrosurgery BOWA, Germany ARC 400 Electrical source for blood suction. Alternative products can be used
Hydro-Guardmini breathing filter Intersurgical, Lithuania 1745000 Filters
Image J National Institute of Health, USA 1.47v Alternative products can be used
Inflation device, Atrion QL2530 Atrion medical product, Alabama, USA 96402 Alternative products can be used
IntelliVue MP 70 Philips, Boeblingen, Germany - Monitor (ECG, heart rate, blood presure and body temperature). Alternative products can be used
KCl Sintetica SA - Potassium chloride 15%
Ketamine Vetoquinol - Narketan, 1ml/100mg
LR-ACT Medtronic 402-01 ACT special syringes
Midazolam Roche - Dormicum, 5mg/ml
Monopolar scalpel Alternative products can be used
Needle holder Alternative products can be used
High resolution camera, PathStand Macro Imaging Stand for Grossing Spotimaging, USA 1080 p HD resolution. Alternative products can be used
PBS In-house preparation - Alternative products can be used
Peripheral venous cannula, 18 G Alternative products can be used
PowerLab 4/35 data acquisition system Adinstruments, Spechbach, Germany -
Rotamax120T Heidolph, Germany 544-41200-00 Shaker. Alternative can be used
Rüschelit-Super Safety Clear Tube Teleflex, Dublin, Irland 112480 Air way tubing, Alternative products can be used
Safe Pico Aspirator Syringes Radiometer 956-622 BGA special syringes
Saline Sintetica Bioren - NaCl 0,9%. Alternative products can be used
Sevorane 1.5% AbbVie AG - Sevorane 250ml 100%
Sheath Cordis, Johnson&Johnson, USA 504-607 A AVANTI + / 7 F, Alternative products can be used
Space infusion pump B.Braun Medical AG, Germany - For infusion of fentanyl. Alternative products can be used
SPR-350 (Millar catheter) Adinstruments, Texas, USA 840-8166 MIKRO-TIP, 5F, 120 cm
Sternotomy saw Alternative products can be used
Sutures ETHICON, Johnson&Johnson, USA Y3110H Monocryl 3-0 SH-1 Plus. Alternative products can be used
Syringes (20, 10 and 5 mL) CODAN,Baar, Switzerland 62.7602,
62.6616,
62.5607
respectively
Used to inject anesthetic materials intramuscularly or directly into the central venous line. Also to inject heparin or FXIIa or the respective control. Alternative products can be used
Thorax spreader Alternative products can be used
Tissue-tek SAKURA, Netherlands 4583 O.C.T. compound
Vascular forceps Alternative products can be used
Xenetix 300 contrast media Guerbet, Zürich, Switzerland - Lobitridol, 300 mg iodide/ml
Xylazine Vetoquinol - Xylapan, 20mg/1 mL
2,3,5-Triphenyltetrazolium choride Sigma-Aldrich, Austria T8877
500 μL tubes (eppendorf) Trefflab, Switzerland 96.08185.9.03 Alternative products can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update. Circulation. 133, e338-e360 (2016).
  2. Miller, T. D., et al. Infarct size after acute myocardial infarction measured by quantitative tomographic 99mTc sestamibi imaging predicts subsequent mortality. Circulation. 92, 334-341 (1995).
  3. Ovize, M., et al. Postconditioning and protection from reperfusion injury: where do we stand? Position Paper from the Working Group of Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovasc Res. 87, 406-423 (2010).
  4. Neri, M., Riezzo, I., Pascale, N., Pomara, C., Turillazzi, E. Ischemia/Reperfusion Injury following Acute Myocardial Infarction: A Critical Issue for Clinicians and Forensic Pathologists. Mediators Inflamm. 2017, 1-14 (2017).
  5. Yang, Q., He, G. -W., Underwood, M. J., Yu, C. -M. Cellular and molecular mechanisms of endothelial ischemia/reperfusion injury: perspectives and implications for postischemic myocardial protection. Am J Transl Res. 8, 765-777 (2016).
  6. Massberg, S., et al. Platelet-Endothelial Cell Interactions During Ischemia/Reperfusion: The Role of P-Selectin. Blood. 92, 507-515 (1998).
  7. Wang, J., et al. Antithrombin is protective against myocardial ischemia and reperfusion injury. J Thromb and Haemost. 11, 1020-1028 (2013).
  8. Hopp, S., et al. Targeting coagulation factor XII as a novel therapeutic option in brain trauma. Ann Neurol. 79, 970-982 (2016).
  9. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193, (Pt 1), 105-119 (1998).
  10. Heusch, G., Skyschally, A., Schulz, R. The in-situ pig heart with regional ischemia/reperfusion - ready for translation. J Mol Cell Cardiol. 50, 951-963 (2011).
  11. Poirier, P. Exercise, heart rate variability, and longevity: the cocoon mystery? Circulation. 2085-2087 (2014).
  12. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacol Ther. 141, 235-249 (2014).
  13. Bloor, C. M., White, F. C. Functional development of the coronary collateral circulation during coronary artery occlusion in the conscious dog. Am J Pathol. 67, 483-500 (1972).
  14. Banz, Y. Locally targeted cytoprotection with dextran sulfate attenuates experimental porcine myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 26, 2334-2343 (2005).
  15. Krombach, G. A., Kinzel, S., Mahnken, A. H., Günther, R. W., Buecker, A. Minimally Invasive Close-Chest Method for Creating Reperfused or Occlusive Myocardial Infarction in Swine. Invest Radiol. 40, 14 (2005).
  16. Suzuki, Y., Lyons, J. K., Yeung, A. C., Ikeno, F. In vivo porcine model of reperfused myocardial infarction: in situ double staining to measure precise infarct area/area at risk. Catheter Cardiovasc Interv. 71, 100-107 (2008).
  17. McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nat Protoc. 7, 1479-1496 (2012).
  18. Koudstaal, S., et al. Myocardial infarction and functional outcome assessment in pigs. J Vis Exp. e51269 (2014).
  19. Kamat, P., et al. Dexrazoxane Shows No Protective Effect in the Acute Phase of Reperfusion during Myocardial Infarction in Pigs. PLoS One. 11, e0168541 (2016).
  20. Carden, D. L., Granger, D. N. Pathophysiology of ischaemia-reperfusion injury. J Pathol. 190, 255-266 (2000).
  21. Pérez de Prado, A., et al. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
  22. Lown, B., Levine, S. A. The carotid sinus. Clinical value of its stimulation. Circulation. 23, 766-789 (1961).
  23. Regueiro-Purriños, M., et al. Ventricular Arrhythmias and Mortality Associated with Isoflurane and Sevoflurane in a Porcine Model of Myocardial Infarction. J Am Assoc Lab Anim Sci. (2011).
  24. Roberts, L. N. Evans blue toxicity. Can Med Assoc J. 71, 489-491 (1954).
  25. Ellenbroek, G. H. J. M., et al. Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction. J Vis Exp. e54021 (2016).
Улучшение модели свинину инфаркт миокарда закрытой груди путем стандартизации процедур отбора проб крови и тканей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Abdelhafez, M. M., Shaw, J., Wilbs, J., Despont, A., Rieben, R. Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures. J. Vis. Exp. (133), e56856, doi:10.3791/56856 (2018).More

Abdelhafez, M. M., Shaw, J., Wilbs, J., Despont, A., Rieben, R. Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures. J. Vis. Exp. (133), e56856, doi:10.3791/56856 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter