Vi præsenterer her, en protokol til billede menneskelige bugspytkirtlen sektioner i tre dimensioner (3D) ved hjælp af optimeret passiv clearing metoder. Dette manuskript viser disse procedurer for passiv optisk clearing efterfulgt af flere immunofluorescens farvning for at identificere nøgleelementerne i de autonome og sensoriske neurale netværk innerverer menneskelige Holme.
Ved hjælp af traditionelle histologiske metoder, forskere er hæmmet i deres evne til at billedet hele væv eller organer i storstilede 3D. Histologiske sektioner er generelt begrænset til < 20 µm som formalin fast paraffin afsnit på glas dias eller 500 µm ved hjælp af traditionelle metoder. Derudover lys scatters fra makromolekyler i væv, især lipider, forhindrer imaging til en dybde > 150 µm med mest Konfokal mikroskoper. At reducere lysspredningen og give mulighed for dybe væv imaging ved hjælp af simple konfokalmikroskopi har forskellige optiske clearing metoder udviklet, er relevante for gnavere og menneskelige vævsprøver fast ved nedsænkning. Flere metoder er relateret og bruge protein crosslinking med acrylamid og væv clearing med sodium dodecyl sulfat (SDS). Andre optiske clearing-teknikker, der anvendes forskellige opløsningsmidler selv hver ændring havde forskellige fordele og ulemper. Her, er en optimeret passiv optisk clearing metode beskrevet for undersøgelser af den menneskelige bugspytkirtlen innervation og specifikt for afhøring af innervation af menneskelige Holme.
Indtil for nylig, blev 3-dimensionelle (3D) genopbygning af store væv eller hele organer udført gennem besværlige seriel afsnitsinddeling, farvning og billede genopbygning af flere sektioner. Disse metoder havde flere ulemper, herunder afhængighed af et stort antal serielle sektioner, dårlig væv penetration med antistoffer, og lys spredning forhindrer dybe imaging inden for væv. For at give mulighed for større lys og antistof penetration, udviklet forskere kemiske metoder for at bevare protein antigener mens du fjerner fleste af lys-spredning lipider. Flere relaterede metoder er Clear Lipid-Exchanged acrylamid-hybridiseret stive Imaging væv hYdrogel (klarhed), passiv klarhed teknik (PAGTEN) og Perfusion-assisteret Agent Release in situ (PARS) (gennemgik i 1,2 ,3,4,5,6). Metoden klarhed er baseret på stabilisering af proteiner ved hjælp af en formaldehyd, acrylamid og bis hydrogel efterfulgt af lipid fjernelse ved hjælp af elektroforese i en SDS løsning2. Denne tilgang blev senere ændret til passiv clearing og avanceret billedbehandling7. Yderligere optimering førte til afskaffelsen af bis og forskellige procentdele af PARAFORMALDEHYD i hydrogel løsning (1-4%) at opnå optimal antigen stabilisering med den korteste clearing tid til en teknik kaldet PAGTEN 8. Tidlige forsøg på at udvikle disse teknikker, optisk clearing involveret økologisk eller andre forbindelser, der var svære at arbejde med og bratkølet endogene fluorescerende proteiner i transgene musemodeller. Disse supplerende metoder indgår skalaer, uhindret hjernen/kroppen Cocktails og numerisk analyse (CUBIC), SWITCH og Dimensional Imaging of Solvent-Cleared organer (diskotek) metoder, alle med forskellige fordele og ulemper9, 10,11,12. Den oprindelige klarhed metode blev udviklet i lipid-rige mus hjernevæv og optisk clearing metoder havde begrænset testning i humane væv7,8,11,13,14 .
Optisk clearing metoder er ideel til sporing nerver over lange afstande som i det intakte mus centralnervesystemet. Bugspytkirtlen er godt innerveres af både autonome og sensoriske nervesystem. Pancreas endokrine rummet, Holme af Langerhanske, udgør en meget lille del af hele orglet (1-2%) og holme har kendt heterogenitet i størrelser (50-250 µm), endokrine celle proportioner og tæthed især i diabetes (gennemgik i 15 ,16). Udvikle en protokol, flere optiske clearing metoder blev testet for menneskets bugspytkirtel og en PAGT procedure blev anset for at give den bedste balance af tid til at rydde (~ 2 uger) med fremragende morfologiske bevarelse af nerver og holme. Den endelige optimerede procedure er beskrevet her i afgrænsningen af det neuro-ø netværk for storstilet (millimeter afstande) og høj opløsning 3D imaging af flere intakt i bugspytkirtlen Holme. Teknikken er velegnet til menneskelig bugspytkirtlen umiddelbart efter optagelsen eller efter oplagring samt prøver fast i neutral bufferet formalin og indlejret i paraffin voks. Prøverne er egnet til billeddannelse af Konfokal eller lightsheet mikroskopi.
Tilgængeligheden af nye optiske clearing metoder har tilladt hidtil uset store undersøgelser af centralt og perifere nervesystem i dyremodeller. De samlede innervation mønstre af menneskelige bugspytkirtlen er stort set uudforskede væv tæthed og vanskeligheder med at erhverve høj kvalitet biospecimens. Denne protokol tilbyder en optimeret væv clearing protokol for menneskets bugspytkirtel væv fra faste eller paraffin-embedded arkivers prøver.
Clearing-tid afhænger af stikprøvestørrelse, Fikseringsvæske type, varighed, opbevaring varighed og kan kræve 1-8 uger, så de følgende betragtninger er kritisk. Det er bedst at rydde væv snart efter 4% PFA fiksering hvis det er muligt fordi langtidsopbevaring øger clearing tid. Du kan reducere clearing tid, var mængden af PFA i hydrogel monomer faldt fra 4% som anvendes i trinnet fiksering på 1% for den menneskelige bugspytkirtlen. For andre væv, især mus væv, skal mængden af PFA nødvendigt at give tilstrækkelig hydrogel stivhed at bevare antigener bestemmes empirisk. Passende clearing er også afgørende, da antistof penetration er reduceret i dårligt ryddet væv og overflade farvning af sekundære antistoffer er steget. Ændre opløsningen clearing er hver anden dag (eller endda daglige) bedst at holde pH konstant og vaskemiddel frisk. Omvendt, over clearing negativt påvirker cellulære morfologi og øger væv skørhed. Da nogle bugspytkirtlen prøver klare ujævnt på grund af iboende patologier såsom regioner af fibrose fra kronisk pancreatitis eller andre patologier, er det vigtigt at ofte overvåge denne proces. Brug af vibratome tykke sektioner kan også bruges til at lave ensartet tykkelser endnu er ikke påkrævet. Overvågning af clearing processen, så prøver er fjernet fra vaskemiddel som lys passerer let gennem prøven, sikrer, at stikprøven er tilstrækkeligt ryddet.
Antistof penetration og overflade farvning er vigtige spørgsmål at overveje med PAGTEN prøver. For at sikre god antistof penetration, er det kritisk at udruge prøver med de primære antistoffer i mindst 2 dage. Forskellige antistoffer har forskellige diffusion priser og bør optimeres individuelt, men for de fleste antistoffer, 4 dage var tilstrækkeligt varighed for fuld indtrængen i en 1 mm3 prøve. Hvis overfladen farvning er et problem, især for Lightsheet billeddannelse, prøven kan skæres i halve, eller overfladen dissekeret væk efter farvning. Lille format antistoffer når tilgængelige forventes at bistå med væv penetration8. Preconjugated antistoffer synes ikke at arbejde ud over den samme ukonjugeret klon og højere baggrund fra uspecifik bindende og fattigere væv penetration kan være overholdt, hvis de arbejder på alle. For forbedret succes med preconjugated antistoffer, øge serum og TritonX-100 koncentrationer i farvning buffer og bruge længere inkubationer (> 4 dage). Efter farvning, er inkubation af prøven i fælge i flere dage kritiske. Ryddet væv swell i PBS og fælge inkubation får dem til at vige tilbage til oprindelige størrelse. Især med lightsheet imaging, skal prøven være fuldt ekvilibreres før imaging.
Når imaging prøver på Konfokal mikroskop, angives korrektionen hver gang en ny stilling er valgt. Forskellige erhvervelse dybder og variation i farvning intensitet i hele vævet nødvendiggør justeringer for hvert område af væv til afbildning optimalt. Ligeledes, de sekundære antistoffer bruges skal overvejes nøje. Spectral urtåge udfordrende i PAGTEN prøver, så fluorophores skal være korrekt valgt for en lav excitation eller emission overlap til at sikre en lyse signal når filtrering emissioner på Konfokal mikroskop. For hvert program sikres en balance mellem opløsning, imaging hastighed og støjreduktion således at de bedste kvalitet billede kan erhverves uden foto-blegning. Opløsning større end 1024 x 1024 er ikke kan påvises ved det menneskelige øje, men kan være nødvendige for visse programmer, hvis kvantificering af en plet er nødvendig.
Der er mange ting at overveje, når du vælger en optisk clearing teknik, og når du vælger optisk clearing over andre mere traditionelle metoder. Lav overflod antigener må ikke kunne påvises ved hjælp af metoden PAGT findes således begrænsninger på antigen påvisning. Visse antigener såsom immunologiske antigener (CD3, CD4, CD8, etc.) er ødelagt af metoden PAGTEN og målbart trods høj kvalitet antistoffer tilgængelige til at registrere dem. En anden begrænsning ved denne metode er den iboende variabiliteten mellem donor bugspytkirtel, hvilket er vanskeligt at skelne indtil efter clearing farvning. Hver donorvæv tendens til at rydde og plet på samme måde mellem procedurer, men forskellige donor væv har meget varierende clearing-tid og væv morfologi kvalitet efter clearing. Evnen til at bruge arkivers væv kan afbøde denne begrænsning, hvis man kan have passende adgang til et stort antal patient bugspytkirtlen prøver, men dette ikke er blevet grundigt undersøgt. PAGTEN protokollen rapporteret heri fandtes for at være billig og let gennemføres med almindeligt laboratorieudstyr. Ryddet prøver var egnet til billeddannelse via traditionelle Konfokal mikroskopi, samt 2-foton og Lightsheet teknologier og forudsat høj opløsning 3D billeder af nerver og Holme i store dele af den menneskelige bugspytkirtlen. Fremtidige anvendelser af denne procedure omfatter undersøgelser af udviklingen af føtal bugspytkirtlen eksokrine og endokrine rum og Holmen undersøgelser i type 1 og type 2 diabetes.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Dr. Ann Fu og Joseph Canzano for teknisk bistand, Dr. Jennifer Treweek for uvurderlige råd, og Dr. Kristin Overton og Dr. Karl Deisseroth for uddannelse til MCT gennem Stanford University klarhed workshop. JDRF nPOD og orgel indkøb organisationer forudsat vævsprøver. Dette arbejde blev finansieret af JDRF (47-2014-1), Helmsley Charitable Trust (HCT 2015-PG-T1D052) og NIDDK 1OT2 TR001773 til MCT.
10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary Antibody | |||
CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
Secondary Antibody | |||
Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |