यहाँ, हम अनुकूलित निष्क्रिय समाशोधन विधियों का उपयोग तीन आयामों (3 डी) में छवि मानव अग्ंयाशय वर्गों के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस पांडुलिपि निष्क्रिय ऑप्टिकल समाशोधन के लिए इन प्रक्रियाओं को दर्शाता है एकाधिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस के बाद स्वायत्त और संवेदी तंत्रिका नेटवर्क innervating मानव टाप के प्रमुख तत्वों की पहचान दाग ।
पारंपरिक ऊतकीय तरीकों का प्रयोग, शोधकर्ताओं ने अपनी छवि पूरे ऊतकों या बड़े पैमाने पर 3 डी में अंगों की क्षमता में बाधा है । ऊतकीय अनुभाग आमतौर पर शीशे की स्लाइड्स पर formalin निश्चित आयल अनुभाग के रूप में < 20 µm तक सीमित होते है या मुक्त-फ़्लोटिंग निश्चित अनुभागों के लिए 500 पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर µm के लिए आवश्यक हैं । इसके अलावा, ऊतकों, विशेष रूप से लिपिड के भीतर अणुओं से प्रकाश तितर बितर, एक गहराई के लिए इमेजिंग रोकता है > सबसे फोकल सूक्ष्मदर्शी के साथ 150 µm । प्रकाश तितर बितर कम करने के लिए और डीप टिशू इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए सरल फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग, विभिंन ऑप्टिकल समाशोधन विधियों कि कुतर और मानव ऊतक विसर्जन द्वारा तय नमूनों के लिए प्रासंगिक है विकसित किया गया है । कई तरीकों से संबंधित है और सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के साथ acrylamide और ऊतक समाशोधन के साथ प्रोटीन crosslinking का उपयोग करें । अंय ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक विभिंन सॉल्वैंट्स इस्तेमाल किया, हालांकि प्रत्येक संशोधन विभिंन फायदे और नुकसान था । यहां, एक अनुकूलित निष्क्रिय ऑप्टिकल क्लियरिंग विधि मानव अग्ंयाशय इन्नेर्वतिओन के अध्ययन के लिए और विशेष रूप से मानव टाप के इन्नेर्वतिओन के पूछताछ के लिए वर्णन किया गया है ।
हाल ही में जब तक, 3 आयामी (3 डी) बड़े ऊतकों या पूरे अंगों के पुनर्निर्माण श्रमसाध्य धारावाहिक के माध्यम से प्रदर्शन किया गया था, धुंधला, और कई वर्गों के छवि पुनर्निर्माण । इन तरीकों सीरियल वर्गों, एंटीबॉडी के साथ गरीब ऊतक पैठ की एक बड़ी संख्या पर निर्भरता सहित कई नुकसान था, और प्रकाश बिखरने ऊतकों के भीतर गहरी इमेजिंग को रोकने । अधिक से अधिक प्रकाश और एंटीबॉडी प्रवेश के लिए अनुमति देने के लिए, शोधकर्ताओं ने रासायनिक तरीकों को विकसित करने के लिए प्रोटीन एंटीजन संरक्षित जबकि प्रकाश बिखरने लिपिड के बहुमत को हटाने. कई संबंधित तरीकों से स्पष्ट लिपिड विमर्श Acrylamide-संकर कठोर इमेजिंग ऊतक hYdrogel (स्पष्टता), निष्क्रिय स्पष्टता तकनीक (संधि), और छिड़काव में सहायक एजेंट रिहाई सीटू (पार्स) (में समीक्षा की 1,2 ,3,4,5,6) । स्पष्टता विधि एक formaldehyde का उपयोग कर प्रोटीन के स्थिरीकरण पर आधारित है, acrylamide, और बीआईएस hydrogel एक एसडीएस समाधान में ट्रो का उपयोग कर लिपिड हटाने के द्वारा पीछा किया2. बाद में पेसिव समाशोधन और उन्नत इमेजिंग7के लिए इस approach संशोधित किया गया था । इसके अलावा अनुकूलन बीआईएस के उंमूलन के लिए नेतृत्व किया और hydrogel समाधान में paraformaldehyde के प्रतिशत अलग (1-4%) एक तकनीक के लिए सबसे कम समाशोधन समय के साथ इष्टतम प्रतिजन स्थिरीकरण प्राप्त करने के लिए समझौता8 । जल्दी इन ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक शामिल कार्बनिक या अंय यौगिकों कि मुश्किल के साथ काम करने के लिए और ट्रांसजेनिक माउस मॉडलों में अंतर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन बुझती विकसित करने का प्रयास करता है । इन अतिरिक्त तरीकों में शामिल तराजू, अबाधित मस्तिष्क/शरीर कॉकटेल और गणनात्मक विश्लेषण (घन), स्विच और विलायक मंजूरी दे दी अंगों (डिस्को) तरीकों के आयामी इमेजिंग, विभिंन लाभ और नुकसान के साथ सभी9, 10,11,12. मूल स्पष्टता विधि लिपिड में विकसित-रिच माउस मस्तिष्क ऊतक और ऑप्टिकल क्लियरिंग तरीकों मानव ऊतकों में सीमित परीक्षण किया था7,8,11,13,14 .
ऑप्टिकल समाशोधन विधियों बरकरार माउस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के रूप में लंबी दूरी पर नसों अनुरेखण के लिए आदर्श होते हैं । अग्ंयाशय अच्छी तरह से दोनों स्वायत्त और संवेदी तंत्रिका प्रणालियों द्वारा innervated है । अग्नाशय के अंत तक डिब्बे, आइलेट्स के टाप, पूरे अंग का एक बहुत छोटा सा हिस्सा शामिल (1-2%) और टाप आकार में विविधता जाना जाता है (५०-२५० µm), अंत में कोशिका अनुपात, और मधुमेह में विशेष रूप से घनत्व (15 में समीक्षित ,16). एक प्रोटोकॉल विकसित करने में, कई ऑप्टिकल समाशोधन विधियों मानव अग्ंयाशय और एक समझौता प्रक्रिया के लिए परीक्षण किया गया समय का सबसे अच्छा संतुलन प्रदान करने के लिए स्पष्ट (~ 2 सप्ताह) नसों और टाप के उत्कृष्ट रूपात्मक संरक्षण के साथ पाया गया था । अंतिम अनुकूलित प्रक्रिया यहाँ बड़े पैमाने पर (मिलीमीटर दूरी) और कई बरकरार अग्नाशय के टाप के उच्च संकल्प 3 डी इमेजिंग के लिए न्यूरो-द्वीपीय नेटवर्क के विरेखांकन में वर्णित है । तकनीक मानव अग्न्याशय के लिए उपयुक्त तुरंत निर्धारण के बाद या भंडारण के बाद के रूप में अच्छी तरह के रूप में तटस्थ बफर formalin में तय नमूनों और आयल मोम में एंबेडेड है । नमूने फोकल या lightsheet माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं ।
नए ऑप्टिकल क्लियरिंग पद्धतियों की उपलब्धता ने पशु मॉडलों में केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका प्रणालियों की अभूतपूर्व बड़े पैमाने पर परीक्षाओं की अनुमति दी है । मानव अग्ंयाशय के समग्र इन्नेर्वतिओन पैटर्न बड़े पैमाने पर उच्च गुणवत्ता वाले नमूनों को प्राप्त करने में ऊतक घनत्व और कठिनाइयों के कारण बेरोज़गार हैं । यह प्रोटोकॉल या तो फिक्स्ड या आयल-एंबेडेड अभिलेखीय नमूनों से मानव अग्ंयाशय के ऊतकों के लिए एक अनुकूलित ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल प्रदान करता है ।
समाशोधन समय नमूना आकार पर निर्भर करता है, निर्धारण प्रकार, अवधि, भंडारण की अवधि और 1-8 सप्ताह की आवश्यकता हो सकती है, तो निंनलिखित विचार महत्वपूर्ण हैं । यह 4% पीएफए निर्धारण के बाद जल्द ही ऊतकों को साफ करने के लिए सबसे अच्छा है यदि संभव हो तो क्योंकि लंबी अवधि के भंडारण समाशोधन समय बढ़ जाती है । समाशोधन समय को कम करने के लिए, hydrogel मोनोमर में पीएफए की मात्रा मानव अग्ंयाशय के लिए निर्धारण कदम में 1% के लिए इस्तेमाल के रूप में 4% से कम किया गया था । अन्य ऊतकों, विशेष रूप से माउस के ऊतकों के लिए, प्रतिजनों को संरक्षित करने के लिए पर्याप्त hydrogel कठोरता प्रदान करने के लिए आवश्यक पीएफए की मात्रा empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । पर्याप्त समाशोधन के बाद से भी आवश्यक है एंटीबॉडी प्रवेश खराब ऊतकों और माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा धुंधला सतह को मंजूरी दे दी है में कम हो गई है । समाशोधन समाधान हर दूसरे दिन बदलने (या, यहां तक कि दैनिक) सबसे अच्छा पीएच निरंतर और डिटर्जेंट ताजा रखने के लिए है । इसके विपरीत, अधिक समाशोधन नकारात्मक प्रभावों सेलुलर आकृति विज्ञान और बढ़ जाती है ऊतक friability । के बाद से कुछ अग्ंयाशय के नमूने असमान जीर्ण अग्नाशयशोथ या अंय विकृतियों से फाइब्रोसिस के क्षेत्रों जैसे अंतर्निहित विकृतियों के कारण स्पष्ट, यह अक्सर इस प्रक्रिया की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है । vibratome मोटी वर्गों का उपयोग भी वर्दी की मोटाई बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अभी तक आवश्यक नहीं हैं । समाशोधन प्रक्रिया की निगरानी, नमूने के माध्यम से आसानी से प्रकाश गुजरता के रूप में के रूप में जल्द ही डिटर्जेंट से हटा रहे हैं, नमूना पर्याप्त मंजूरी दे दी है कि यह सुनिश्चित करता है.
एंटीबॉडी प्रवेश और सतह धुंधला समझौता नमूनों के साथ विचार करने के लिए महत्वपूर्ण मुद्दे हैं । अच्छा एंटीबॉडी प्रवेश सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नमूने की मशीन कम 2 दिनों के लिए । विभिंन एंटीबॉडी अलग प्रसार दर है और व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित किया जाना चाहिए, लेकिन सबसे एंटीबॉडी के लिए, 4 दिन एक 1 मिमी3 नमूना में पूर्ण प्रवेश के लिए पर्याप्त अवधि थी । यदि सतह धुंधला एक समस्या है, विशेष रूप से Lightsheet इमेजिंग के लिए, नमूना आधे में कटौती की जा सकती है, या सतह धुंधला के बाद दूर विदारक । छोटे प्रारूप एंटीबॉडी जब उपलब्ध करने के लिए ऊतक प्रवेश8के साथ सहायता की उंमीद होगी । Preconjugated एंटीबॉडी के रूप में अच्छी तरह से काम करने के लिए प्रकट नहीं है एक ही unconjugated क्लोन और उच्च पृष्ठभूमि से विशिष्ट बाध्यकारी और गरीब ऊतक प्रवेश देखा जा सकता है अगर वे सब पर काम करते हैं । preconjugated एंटीबॉडी के साथ बेहतर सफलता के लिए, वृद्धि सीरम और TritonX-धुंधला बफर में १०० सांद्रता और अब (> 4 दिन) की गर्मी का उपयोग करें । दाग के बाद, रिम्स में कई दिनों के लिए नमूना की मशीन महत्वपूर्ण है । मंजूरी दे दी है पंजाब और रिम्स में सूजन ऊतकों उन्हें मूल आकार में वापस हटना करने के लिए कारण बनता है. विशेष रूप से lightsheet इमेजिंग के साथ, नमूना इमेजिंग से पहले पूरी तरह से equilibrated होना चाहिए ।
जब फोकल माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग नमूने, सुधार हर बार एक नई स्थिति चुना जाता है सेट किया जाना चाहिए । ऊतक के प्रत्येक क्षेत्र के लिए ऊतक आवश्यक समायोजन भर में तीव्रता धुंधला में विभिन्न अधिग्रहण गहराई और भिन्नता छवि बेहतर हो. इसी तरह, माध्यमिक इस्तेमाल किया एंटीबॉडी सावधानी से विचार किया जाना चाहिए । वर्णक्रमीय मिश्रण समझौता नमूनों में चुनौती दे रहा है, तो fluorophores उचित रूप से एक कम उत्तेजना या उत्सर्जन के लिए चुना जाना चाहिए एक उज्ज्वल संकेत है जब फोकल माइक्रोस्कोप पर उत्सर्जन को छानने के लिए ओवरलैप सुनिश्चित करें । प्रत्येक आवेदन के लिए, एक संतुलन संकल्प, इमेजिंग गति, और शोर में कमी के बीच मारा जाना चाहिए ताकि सबसे अच्छी गुणवत्ता की छवि फोटो ब्लीचिंग के बिना प्राप्त किया जा सकता है । संकल्प से अधिक १०२४ x १०२४ मानव आंख द्वारा detectable नहीं है, लेकिन कुछ अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हो सकता है अगर एक दाग की ठहराव की जरूरत है ।
वहां कई बातों पर विचार जब एक ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक का चयन कर रहे है और जब अंय अधिक परंपरागत तरीकों पर ऑप्टिकल समाशोधन चुनने । कम बहुतायत प्रतिजनों नहीं किया जा सकता है पता लगाने में इमानदारी विधि का उपयोग कर इस प्रकार वहां antigen पता लगाने पर सीमाएं हैं । कुछ एंटीजन जैसे प्रतिरक्षा एंटीजन (CD3, सीडी, सीडी, आदि) इमानदारी विधि से नष्ट हो जाते हैं और उन्हें पता लगाने के लिए उपलब्ध उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी के बावजूद undetectable होते हैं । इस विधि की एक और सीमा दाता अग्ंयाशय जो धुंधला समाशोधन के बाद जब तक विचार मुश्किल है के बीच अंतर्निहित परिवर्तनशीलता है । प्रत्येक दाता ऊतक स्पष्ट और प्रक्रियाओं के बीच इसी तरह दाग जाता है, लेकिन विभिंन दाता ऊतकों को साफ करने के बाद व्यापक रूप से समाशोधन बार और ऊतक आकृति विज्ञान की गुणवत्ता बदलती है । संग्रह ऊतक का उपयोग करने की क्षमता इस सीमा को कम कर सकते हैं अगर एक रोगी अग्ंयाशय नमूनों की एक बड़ी संख्या के लिए पर्याप्त उपयोग हो सकता है हालांकि यह अच्छी तरह से जांच नहीं की गई है । समझौता प्रोटोकॉल की सूचना के साथ साथ सस्ती और आसानी से मानक प्रयोगशाला उपकरणों के साथ लागू पाया गया था । मंजूरी दे दी नमूनों पारंपरिक फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से इमेजिंग के लिए उपयुक्त थे, साथ ही 2-फोटॉन और Lightsheet प्रौद्योगिकियों और मानव अग्ंयाशय के बड़े वर्गों में नसों और टाप के उच्च संकल्प 3 डी छवियों प्रदान की है । इस प्रक्रिया के भविष्य के अनुप्रयोगों दोनों रिसाव और अंत-स्रावी डिब्बों और प्रकार में टाप अध्ययन के लिए भ्रूण अग्न्याशय के विकास पर अध्ययन में शामिल 1 और प्रकार 2 मधुमेह.
The authors have nothing to disclose.
लेखक डॉ एन फू और यूसुफ Canzano तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद, अमूल्य सलाह के लिए डॉ जेनिफर Treweek, और डॉ क्रिस्टिन Overton और डॉ कार्ल Deisseroth स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय स्पष्टता कार्यशाला के माध्यम से MCT को प्रशिक्षण के लिए । JDRF nPOD और अंग खरीद संगठनों ने ऊतक के नमूने प्रदान किए. यह काम JDRF (47-2014-1), Helmsley चैरिटेबल ट्रस्ट (HCT २०१५-PG-T1D052) और NIDDK 1OT2 TR001773 को MCT द्वारा वित्तपोषित किया गया.
10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary Antibody | |||
CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
Secondary Antibody | |||
Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |