여기, 우리는 프로토콜 사용 하 여 3 차원 (3D) 이미지 인간의 췌 섹션을 최적화 수동 삭제 방법 제시. 이 원고에서는 수동 광 비운 뒤에 여러 면역 형광 인간의 독도 innervating 자율 고 감각 신경 네트워크의 핵심 요소를 식별 하기 위해 얼룩에 대 한이 절차를 보여 줍니다.
전통적인 조직학 방법을 사용 하 여, 연구원은 그들의 능력을 이미지 전체에 방해는 조직이 나 장기 대규모 3d에서. 조직학 단면도 일반적으로 < 20 µ m로 포 르 말린 고정 파라핀 섹션 유리 슬라이드에 또는 전통적인 방법을 사용 하 여 500 µ m. 또한, 내 조직, 특히 지질, 고분자에서 빛 없앤다 방지 깊이 영상 > 가장 confocal 현미경으로 150 µ m. 빛 분산을 줄이고 간단한 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 깊은 조직 이미징 수 있도록, 다양 한 광학 개간 방법 그는 설치류와 인간의 조직 샘플에 대 한 관련 고정 침수에 의해 개발 되어 왔다. 여러 가지 방법을 관련 고 아크릴 아 미드와 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)와 지우기 조직 단백질 가교를 사용 합니다. 다른 광학 개간 기술 사용 다양 한 용 매 다양 한 장점과 단점 각 수정 했다. 여기, 인간의 췌 장 신경 분포의 연구와 인간의 독도의 신경 분포의 심문을 위해 특별히 최적화 된 수동 광 개간 방법 설명 되어 있습니다.
최근까지, 큰 조직 또는 전체 장기의 3 차원 (3D) 재건 힘 드는 직렬 단면, 얼룩, 및 여러 섹션의 이미지 재건을 통해 수행 되었다. 이러한 방법은 직렬 섹션, 항 체, 및 비 산 방지 조직 내의 깊은 이미징 빛 가난한 조직 침투의 많은 수에 대 한 신뢰를 포함 하 여 몇 불리가 있었다. 있도록 큰 빛과 항 체 침투, 연구원 지질 빛 산란의 대부분을 제거 하는 동안 단백질 항 원을 보존 하기 위해 화학 방법을 개발. 여러 메서드는 엄밀한 이미징 조직 Clear Lipid-Exchanged 아크릴 때 교배 히드로 (선명도), 수동 선명도 기법 (협정), 및 관류 기반 에이전트 출시 원래의 (동위) ( 1,2 검토 관련 ,,34,,56). 선명도 메서드는 포름알데히드, 아크릴, 및 두번째 히드로 지질 제거 SDS 솔루션2전기 이동 법을 사용 하 여 다음을 사용 하 여 단백질의 안정화를 기반으로 합니다. 이 방법은 수동 삭제에 대 한 수정 나중 되었고 고급 이미징7. 추가 최적화 주도하 고 두번째의 paraformaldehyde 히드로 솔루션 (1-4%)의 다양 한 비율로 최적의 항 안정화를 협정 8이라는 기법에 대 한 짧은 청소 시간. 이러한 광학 개간 기술을 개발 초기 시도 관련 작업을 담금질된 생 형광 단백질 유전자 변형 마우스 모델에서 어려운 유기 또는 다른 화합물. 이러한 추가 메서드 포함 비늘, 가리지 두뇌/신체 칵테일과 Computational 분석 (큐빅), 스위치 및 Dimensional Imaging of Solvent-Cleared 기관 (디스코) 방법, 모두와 함께 다양 한 장점과 단점9, 10,,1112. 원래 선명도 방법은 지질이 풍부한 마우스 뇌 조직에서 개발 되었다 및 광학 개간 방법 인간의 조직7,,811,13,14에서에서 테스트 제한 했다 .
광학 개간 방법 그대로 마우스 중앙 신경 시스템에서 긴 거리 추적 신경에 이상적입니다. 췌 잘 자율 신경 및 감각 신경 시스템에 의해 innervated입니다. 전체 기관 (1-2%)의 아주 작은 부분을 구성 하는 췌 장 내 분 비 실, 독도 Langerhans 및 독도 크기 (50-250 µ m), 내 분 비 세포 비율, 및 ( 15에서에서 검토 한 결과 당뇨병에 특히 밀도에 알고 있다 ,16). 프로토콜 개발, 인간의 췌 장에 대 한 여러 가지 광학 개간 방법을 테스트 하 고 협정 절차 신경 및 독도의 우수한 형태 보존 시간 (~ 2 주)를 최고의 균형을 발견. 여기에 설명 된 마지막 최적화 절차는 대 한 신경 섬 네트워크의 묘사에 대규모 (밀리미터 거리) 및 여러 그대로 췌 장 독도의 고해상도 3D 이미징. 후 샘플으로 저장 중립 버퍼링 된 포 르 말린 고정 파라핀 왁 스에 포함 된 기술은 인간의 췌 장 바로 다음 고정 또는 적당 하다. 샘플은 여 confocal 영상에 대 한 적합 한 또는 lightsheet 현미경 검사 법.
새로운 광학 개간 방법의 동물 모델에는 중앙의 전례 없는 대규모 시험 및 주변 신경 시스템을 허용 하고있다. 인간의 췌 장의 전반적인 신경 분포 패턴 조직 밀도 높은 품질 biospecimens 인수에 어려움으로 인해 크게 탐험 되지 않습니다. 이 프로토콜은 고정 또는 파라핀 끼워 넣어진 보관 샘플에서 인간의 췌 장 조직에 대 한 프로토콜을 삭제 하는 최적화 된 조직에 제공 합니다.
시간을 지우기 샘플 크기, 통 유형, 기간, 저장 기간에 따라 달라 집니다 고 다음 고려 사항은 중요 한 그래서 1-8 주를 요구할 수 있습니다. 가능 하면 장기 보관 개간 시간 증가 하기 때문에 4 %PFA 고정 후 곧 조직을 지우려면 최상 이다. 청소 시간을 최소화 하기 위해 하이드로 겔 단위체에 PFA의 금액 1%로 고정 단계에서 사용 되는 인간의 췌 장 4%에서 감소 했다. 다른 조직, 특히 마우스 조직에 대 한 PFA 항을 유지 하기 위해 충분 한 하이드로 겔 강성을 제공 하기 위해 필요한 금액은 실험적으로 결정 되어야 합니다. 적절 한 개간 때문에 항 체 침투 제대로 삭제 된 조직에 감소 되 고 2 차 항 체에 의해 얼룩 표면 증가 또한 필수적 이다. 청소 솔루션을 변경 모든 다른 일 (또는, 심지어 매일)이 pH 상수와 세제를 신선한 유지 좋습니다. 반대로, 부정적인-지우기 세포 형태에 미치는 영향 및 조직 friability 증가. 이후 일부 췌 장 샘플 취소 하지 섬유 증 만성 췌 장 염에서의 지역 등 고유한 병 리 또는 다른 병 리 균등 하 게, 그것은 자주이 프로세스를 모니터링 하는 것이 중요. Vibratome 두꺼운 섹션의 사용 하 여 균일 한 두께 만들기 위해 사용할 수 있습니다 아직 필요 하지 않습니다. 최대한 빨리 빛 샘플, 쉽게 통과 샘플 세제에서 제거 됩니다 개간 과정 모니터링 샘플 충분히 지워집니다 보장 합니다.
항 체 침투 및 표면 얼룩 협정 예제와 함께 고려해 야 할 중요 한 문제가 있습니다. 좋은 항 체 침투를 위해, 그것은 적어도 2 일 동안 1 차 항 체와 함께 샘플을 품 어 중요입니다. 다양 한 항 체 다른 보급률 있고 개별적으로 최적화 해야 하지만 대부분 항 체, 4 일 1 m m3 샘플에서 전체 침투에 대 한 충분 한 기간. 표면 얼룩이 지는 문제는, 특히 Lightsheet 이미징에 대 한 샘플, 절반 절단 될 수 있습니다 또는 표면 얼룩 후 멀리 해 부. 작은 형식 항 체 사용 가능한 경우 조직 침투8을 지원 하기 위해 예상 될 것 이다. Preconjugated 항 체 같은 결합형된 복제 뿐만 아니라 작동 표시 되지 않습니다 및 일반적인 바인딩 및 빈약한 조직 침투에서 높은 배경 수 만약 그들이 모든 일을 관찰. Preconjugated 항 체와 함께 향상 된 성공, 증가 혈 청 및 TritonX-100 농도 얼룩이 지기에서 버퍼 긴 외피를 사용 (> 4 일). 얼룩, 후 몇 일 동안 바퀴에 샘플의 인큐베이션이 중요 합니다. PBS 및 테두리 외피에 허가 조직 팽창 발생 다시 원래 크기로 축소 합니다. Lightsheet 영상와 특히 샘플 완전히 이미징 하기 전에 equilibrated 되어야 한다.
Confocal 현미경에 샘플 이미지 때 수정에 새 위치를 선택 때마다가 설정 해야 합니다. 다양 한 수집 깊이 강도 조직 전체를 얼룩에 최적의 이미지를 조직의 각 영역에 대 한 조정이 필요로 합니다. 마찬가지로, 사용 하는 2 차 항 체는 신중 하 게 고려 되어야 한다. 스펙트럼 unmixing fluorophores 밝은 신호를 필터링 하는 confocal 현미경에 방출 되도록 낮은 여기 또는 오버랩 적절 하 게 선택 되어야 한다 그래서 협정 샘플, 도전 이다. 사진-표백 하지 않고 최고의 품질 이미지를 얻을 수 있다 그래야 각 응용 프로그램에 대 한 균형 해상도, 이미징 속도 및 소음 감소 사이 삼진 해야 합니다. 해상도 1024 x 1024 보다 큰 인간의 눈으로 감지 하지만 얼룩의 정량화는 필요한 경우 특정 응용 프로그램에 필요한 있을 수 있습니다.
광학 개간 기술을 선택할 때 그리고 다른 전통적인 방법을 통해 광학 개간을 선택할 때 고려해 야 할 많은 것 들이 있다. 낮은 풍부 항 따라서 있다 항 원 탐지에 대 한 제한 협정 방법을 사용 하 여 감지 하지 않을 수 있습니다. 특정 항 원 면역 항 원 (CD3, CD4, CD8, 등) 같은 협정 방법으로 파괴 하 고 그들을 감지 사용할 수 있는 고품질 항 체에도 불구 하 고 감지 되지 않습니다. 이 방법의 또 다른 한계는 기증자 췌 얼룩을 지운 후 때까지 분별 하기 어려운 사이 고유의 가변성. 각 기증자 조직 명확 하 고 절차, 사이 유사 하 게 얼룩 경향이 있다 하지만 다른 기증자 조직 널리 다양 한 청소 시간 및 조직의 형태학 품질 개간 후. 비록이 철저 하 게 조사 하지는 하나 환자 췌 샘플의 많은 수에 대 한 적절 한 액세스를 가질 수 있다면 보관 조직을 사용 하는 능력이이 제한을 완화 수 있습니다. 여기 보고 협정 프로토콜 저렴 하 고 쉽게 표준 실험실 장비로 구현 될 발견 됐다. 선택된 샘플 전통적인 confocal 현미경 검사 법, 2 광자 및 Lightsheet 기술을 통해 영상에 적합 되었고 고해상도 신경 및 인간의 췌의 큰 섹션에 독도의 3D 이미지를 제공. 이 절차의 미래 응용 프로그램 태아 췌 장 외 분 비 및 내 분 비 구획 및 타입-1에에서 섬 연구 및 2 형 당뇨병의 개발에 대 한 연구를 포함합니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 박사 앤 푸와 기술 지원에 대 한 조셉 Canzano, 박사 제니퍼 Treweek 귀중 한 조언, 그리고 닥터 크리스틴 Overton 및 MCT 스탠포드 대학 선명도 워크샵을 통해 교육에 대 한 박사 칼 Deisseroth 감사합니다. JDRF nPOD 및 장기 조달 조직 조직 샘플을 제공합니다. 이 작품은 JDRF (47-2014-1), 헴 슬 리 자선 신탁 (HCT 2015-PG-T1D052) 및 MCT에 NIDDK 1OT2 TR001773에 의해 투자 되었다.
10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary Antibody | |||
CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
Secondary Antibody | |||
Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |