Här presenterar vi en protokoll bild mänskliga bukspottkörteln avsnitten i tre dimensioner (3D) med optimerad passiv clearing metoder. Detta manuskript visar dessa förfaranden för passiva optiska clearing följt av flera immunofluorescens färgning för att identifiera viktiga delar av de autonoma och sensoriska neuronnät innervating mänskliga holmar.
Med traditionella histologiska metoder, forskare hämmas i sin förmåga att bilden hela vävnader eller organ i storskaliga 3D. Histologiska sektioner är vanligen begränsade till < 20 µm som formalin fast paraffin avsnitt på glasskivor eller 500 µm med traditionella metoder. Dessutom lätta scatters från makromolekyler i vävnader, särskilt lipider, förhindrar imaging djup > 150 µm med mest confocal Mikroskop. Att minska ljusspridning och som möjliggör djup vävnad bildåtergivning med enkel konfokalmikroskopi, har det utvecklats olika optiska röjningmetoder att relevanta för gnagare och mänskliga vävnadsprover korrigeras genom nedsänkning. Flera metoder är relaterade och använda protein crosslinking med akrylamid och vävnad röjning med sodium dodecyl sulfate (SDS). Andra optiska clearing tekniker används olika lösningsmedel om varje ändring hade olika fördelar och nackdelar. Här, beskrivs en optimerad passiva optiska clearing-metoden för studier av den mänskliga bukspottkörtel innervationen och specifikt för förhör av innervationen av mänskliga holmar.
Tills nyligen utfördes 3-dimensionell (3D) rekonstruktion av stora vävnader eller hela organ genom mödosamma seriell snittning, färgning och bildrekonstruktion av flera avsnitt. Dessa metoder hade flera nackdelar inklusive beroendet av ett stort antal seriella sektioner, dålig vävnad penetration med antikroppar och ljus spridning förebygga djupa imaging inom vävnader. För att möjliggöra större ljus och antikropp penetration har utvecklat forskare kemiska metoder för att bevara proteinantigener medan du tar bort majoriteten av ljus-scattering lipider. Flera relaterade metoder är Clear Lipid-Exchanged akrylamid-hybridiserad styv Imaging vävnad hYdrogel (klarhet), passiv tydlighet teknik (PACT) och Perfusion-assisted Agent Release i situ (PARS) (recenserade i 1,2 ,3,4,5,6). Metoden klarhet är baserad på stabilisering av proteiner med hjälp av en formaldehyd, akrylamid och bis hydrogel följt av lipid borttagning med hjälp av elektrofores i en SDS lösning2. Detta synsätt ändrades senare för passiv clearing och avancerad bildbehandling7. Ytterligare optimering ledde till avskaffandet av bis och varierande procentandelar av PARAFORMALDEHYD i hydrogel lösningen (1-4%) att erhålla optimala antigen stabilisering med kortast clearing tid för en teknik som kallas pakten 8. Tidiga försök att utveckla dessa optiska clearing tekniker inblandade organiska eller andra föreningar som var svåra att arbeta med och kylda endogena fluorescerande proteiner i transgena musmodeller. Dessa ytterligare metoder ingår skalor, obehindrad hjärnan/kroppen Cocktails och Computational analys (kubik), växel och Dimensional Imaging of Solvent-Cleared organ (DISCO) metoder, alla med olika fördelar och nackdelar9, 10,11,12. Den ursprungliga tydlighet-metoden utvecklades i lipid-rika mus hjärnvävnad och optiska röjningmetoder hade begränsad testning i mänskliga vävnader7,8,11,13,14 .
Optiska röjningmetoder är idealiska för spårning nerver över långa avstånd som intakt mus centrala nervsystemet. Bukspottkörteln är väl innerveras av både sensorisk och autonom nervsystem. Pankreas endokrina facket, Langerhanska öar, utgör en mycket liten del av hela orgeln (1-2%) och holmar har känt heterogenitet i storlekar (50-250 µm), endokrina cellen proportioner och densitet särskilt vid diabetes (recenserade i 15 ,16). Utveckla ett protokoll, flera optiska röjningmetoder testades för mänskliga bukspottkörteln och en pakt förfarande konstaterades för att tillhandahålla den bästa balansen mellan tid att rensa (~ 2 veckor) med utmärkta morfologiska bevarandet av nerver och holmar. Den slutliga optimerad beskrivs här i avgränsningen av neuro-trångsynt nätverket för storskaliga (millimeters avstånd) och högupplösta 3D imaging av flera intakt Langerhanska. Tekniken är lämplig för mänskliga bukspottkörteln direkt efter upptagning eller efter lagring samt prover fast i neutral buffrad formalin och inbäddade i paraffin vax. Proven är lämplig för avbildning av confocal eller lightsheet mikroskopi.
Tillgången på nya optiska röjningmetoder har tillåtit exempellösa storskaliga undersökningar av centrala och perifera nervsystemet i djurmodeller. Den övergripande innervation mönstren av mänskliga bukspottkörteln är till stora delar outforskat på grund av vävnad densitet och svårigheter att förvärva hög kvalitet biospecimens. Detta protokoll erbjuder en optimerad vävnad clearing protokoll för mänskliga bukspottkörteln vävnad från antingen fasta eller paraffin-inbäddat arkivens prover.
Klarnande tid beror på stickprovsstorleken, fixativ typ, längd, lagring varaktighet och kan kräva 1-8 veckor, så följande överväganden är kritiska. Det är bäst att rensa vävnader snart efter 4% PFA fixering om möjligt eftersom långsiktig lagring ökar avfärgningstiden. För att minimera avfärgningstiden, minskade mängden PFA i hydrogel monomeren från 4% som används i fixering steg 1% för mänskliga bukspottkörteln. För andra vävnader, särskilt mus vävnader, bestämmas mängden PFA nödvändigt att tillhandahålla tillräcklig hydrogel styvhet att bevara antigenerna empiriskt. Adekvat clearing är också viktigt eftersom antikropp penetration reduceras i dåligt rensade vävnader och ytan färgning av sekundära antikroppar ökas. Ändra den röjning lösningen är varannan dag (eller, även dagligen) bäst att hålla pH konstant och rengöringsmedel färska. Omvänt över clearing negativt påverkar cellernas morfologi och ökar vävnad sprödhet. Eftersom vissa bukspottkörteln prover rensa ojämnt på grund av inneboende patologier såsom regionerna fibros från kronisk pankreatit eller andra sjukdomar, är det viktigt att ofta övervaka denna process. Användning av vibratome tjocka sektioner kan också användas för att göra enhetliga tjocklekar men krävs inte. Övervakning clearingen, så prover tas bort från tvättmedel så snart ljuset passerar enkelt genom provet, garanterar att provet tillräckligt är avmarkerad.
Antikropp penetration och ytan färgning är viktiga frågor att överväga med pakten prover. För att säkerställa bra antikropp penetration, är det viktigt att Inkubera prover med de primära antikropparna i minst 2 dagar. Olika antikroppar har olika diffusion priser och bör optimeras individuellt, men för de flesta antikroppar, 4 dagar var tillräcklig varaktighet för full genomträngning i ett 1 mm3 prov. Om surface färgning är ett problem, särskilt för Lightsheet imaging, provet kan skäras i hälften eller ytan dissekeras bort efter färgning. Litet format antikroppar när tillgängliga skulle förväntas bistå med vävnad penetration8. Preconjugated antikroppar verkar inte fungerar samt samma okonjugerat klonen och högre bakgrund från ospecifik bindning och fattigare vävnad penetration kan observeras om de fungerar alls. För förbättrad framgång med preconjugated antikroppar, öka serum och TritonX-100 koncentrationer i färgningen buffert och använda längre inkubationer (> 4 dagar). Efter färgning, är inkubation av provet i fälgar i flera dagar kritisk. Rensas vävnader svälla i PBS och fälgar inkubation orsakar dem att krympa tillbaka till den ursprungliga storleken. Speciellt med lightsheet imaging, bör provet vara fullt jämviktas innan imaging.
När imaging prover på confocal mikroskopet, måste korrigeringen ställas in varje gång en ny position väljs. Olika förvärv djup och variation i färgning intensitet under hela vävnaden kräver justeringar för varje område av vävnad att avbildas optimalt. Likaså måste de sekundära antikroppar används övervägas noggrant. Spektral minoriteter är utmanande i pakten prover, så fluorophores måste väljas på lämpligt sätt för en låg excitation eller utsläpp överlappning för en ljus signal när du filtrerar på mikroskopet confocal utsläppen. För varje ansökan, måste en balans uppnås mellan upplösning, bildbehandling hastighet och brusreducering så att den bästa bildkvalitet kan förvärvas utan foto-blekning. Högre upplösning än 1024 x 1024 är inte upptäckas av det mänskliga ögat, men kan vara nödvändigt för vissa applikationer om kvantifiering av en fläck behövs.
I området i närheten finns det många saker att tänka på när du väljer en optisk clearing teknik och när du väljer optisk clearing över andra mer traditionella metoder. Antigener som låg överflöd kan inte upptäckas med metoden pakten således finns det begränsningar på antigen detection. Vissa antigener såsom immunologiska antigener (CD3, CD4, CD8, etc.) förstörs av metoden pakten och är påvisas trots hög kvalitet antikroppar tillgängliga att upptäcka dem. En annan begränsning med denna metod är det inneboende variabilitet mellan givare bukspottkörtlar som är svåra att urskilja förrän efter clearing färgning. Varje givare vävnad tenderar att rensa och fläcken likaså mellan förfaranden, men olika givare vävnader har mycket varierande röjning gånger och vävnad morfologi kvalitet efter röjningen. Förmågan att använda arkivbeständigt vävnad kan mildra denna begränsning om man kan ha tillräcklig tillgång till ett stort antal patientens bukspottkörtel prover även om detta inte har undersökts grundligt. PAKTEN protokollet rapporteras häri konstaterades vara billig och lätt genomförs med vanlig laboratorieutrustning. Rensas prover var lämpliga för imaging via traditionella konfokalmikroskopi, samt 2-photon och Lightsheet teknik och förutsatt högupplösta 3D-bilder av nerver och skär i stora delar av mänskliga bukspottkörteln. Framtida tillämpningar av detta förfarande omfattar studier om utvecklingen av fostrets bukspottkörteln för både exokrina och endokrina fack och holme studier i typ 1 och typ 2-diabetes.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Dr. Ann Fu och Joseph Canzano för tekniskt bistånd, Dr. Jennifer Treweek för ovärderliga råd och Dr. Kristin Overton och Dr. Karl Deisseroth för utbildning för MCT: er via Stanford University tydlighet verkstaden. JDRF nPOD och orgel upphandling organisationer också vävnadsprover. Detta arbete finansierades av JDRF (47-2014-1), Helmsley Charitable Trust (HCT 2015-PG-T1D052) och NIDDK 1OT2 TR001773 för MCT: er.
10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary Antibody | |||
CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
Secondary Antibody | |||
Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |