Summary
Den menneskelige huden fungerer som en første forsvarslinje mot det ytre miljøet. Vi presenterer en metode for å isolere primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud. Disse isolerte keratinocytter er nyttig i flere eksperimentelle oppsett, og er en svært passende modell for å studere molekylære mekanismer i kutan biologi i vitro.
Abstract
Hovedfunksjonen til keratinocytter er å gi den strukturelle integriteten i overhuden, og dermed opprettholde en mekanisk barriere til verden utenfor. I tillegg spiller keratinocytter en viktig rolle i innvielsen, vedlikehold og regulering av epidermal immunreaksjoner å være del av det medfødte immunsystemet svarer på antigen stimuli i en rask, ikke-spesifikk måte. Her beskriver vi en protokoll for isolering av primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud, og at disse cellene reagerer kalsium-indusert terminal differensiering, målt ved det økt uttrykket for differensiering markør involucrin. I tillegg viser vi at de isolerte keratinocytter er mottakelig for IL-1β-indusert aktivering av intracellulær signalveier målt ved aktivering av p38 MAPK veien. Sammen beskriver vi en metode for isolasjon og dyrking av primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud. Fordi keratinocytter er den dominerende celle i overhuden, er denne metoden nyttig å studere molekylære mekanismer i kutan biologi i vitro.
Introduction
Huden er den største organet av kroppen og fungerer som en beskyttende barriere mot ytre miljø. Huden består av to hoveddeler lag: the dermis og epidermis, overhuden, hvor utgjør det ytterste laget av huden. Den rikeste celle typen i epidermis er keratinocytter består av mer enn 95% av cellen masse1,2. Keratinocytter opprettholdes på ulike stadier av differensiering i overhuden og organiseres i basale, spinous, granulerte og cornified lag som tilsvarer bestemte stadier av differensiering3. Hovedfunksjonen til keratinocytter er å gi den strukturelle integriteten i overhuden, og dermed produsere en intakt barriere til verden utenfor.
Keratinocytter representerer den første linjen i forsvaret mot patogener i huden, og derfor spiller en viktig rolle i medfødte immunforsvaret4,5. Eksponering for keratinocytter eksterne stimuli fører til aktivering av intracellulær signalveier og deretter produksjon av en rekke ulike inflammatoriske mediatorer inkludert cytokiner, chemokines og antimikrobielle peptider. Disse keratinocyte-avledet proteiner delta i inflammatorisk respons ved rekruttering og aktivere immunceller som dendrittiske celler, nøytrofile og bestemt T celler6,7. Dermed fordi keratinocytter spille en avgjørende rolle i mange biologiske prosesser, var begrunnelsen bak teknikken presenteres her å generere en i vitro modell for å studere huden biologi. Primære keratinocyte kulturer fra neonatal foreskin brukes ofte til å studere huden biologi8,9. Men med teknikken beskrevet her, er keratinocytter fra begge kjønn oppnådd som resulterer i en høyere biologisk mangfold av cellene.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for isolasjon og generasjon av primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud, inkludert vedlikehold og frysing av keratinocytter. Det overordnede målet med denne metoden er å generere primære menneskelige keratinocytter som kan brukes som en modell for å studere kutan biologi i vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samlingen av hud prøver fra friske voksne frivillige gjennomgå plastisk kirurgi krever godkjenning fra den etiske komiteen i vert institusjoner. Denne protokollen ble godkjent av den regionale etiske komiteen av Region Midtjylland, Danmark (M-20110027). Metoden beskrevet her er avledet fra lignende studier av Maciaq et al. 10 og Liu og Karasek11.
1. isolering av keratinocytter fra menneskelig hud
- Start ved å gjøre følgende: 50 mL løsningen av 0,25% trypsin og 0,1% glukose i DPBS. Blanding og filter sterilisere (0,2 µm) løsningen. Forberede 10 mL av RPMI-1640 + 2% FBS løsning, 50 mL av DPBS og keratinocyte serum-free medium (KSFM). Legge til KSFM kosttilskudd og 250 µL av gentamycin 500 mL KSFM. Forvarm løsningene på 37 ° C før bruk.
- Samle huden fra friske voksne frivillige gjennomgå plastisk kirurgi. Huden eksemplene brukes er ca 10 cm x 15 cm, men kan variere i størrelse. Hold huden kjølig under transport ved transport huden prøvene i en Styrofoam inneholder en kjøleelement. Eventuelt huden prøven lagres på 4 ° C over natten.
- Fjerne fett fra under delen hud bruke steriliserte saks, skalpeller og tang.
- Spenne ut huden delen (ca 10 cm x 15 cm) på en steril cover på en tallerken med nåler. Først rense huden med en tørr sterilisert gauze pute. Rengjør huden med en sterilisert gauze pute med 70% etanol.
- Bruker en fot planer, kuttet av det øvre laget (epidermis) i delen huden og putte den i en 9 cm Petriskål. Deretter umiddelbart legge 25 mL av DPBS/trypsin/glukose løsningen (forberedt i trinn 1.1) til Petriskål. Inkuber i 30 min på 37 ° C.
- Bruke en pipette Fjern DPBS/trypsin/glukose løsningen fra Petriskål og tilsett 10 mL av RPMI-1640 + 2% FBS å deaktivere trypsin.
- Bruker to tang, nå ut epidermal cellene til medium ved å forsiktig skrape og agitating både i epidermal og dermal rommet av huden.
- Filtrere epidermal celle suspensjon gjennom et metall filter (1 mm hull størrelse), og samle i en 50 mL tube. Legge de resterende hud delene til en 50 mL tube som inneholder 10 mL av RPMI-1640 uten FBS og vortex 10 s. filteret suspensjon gjennom metall filtrere i en 50 mL tube som inneholder epidermal celle suspensjon. Legg DPBS til et totalt volum på 50 mL.
- Sentrifuge celle suspensjon i 10 min 450 x g ved romtemperatur.
- Fjern nedbryting og resuspend epidermal celle pellet på ca 10 mL av 37 ° C KSFM avhengig av det cellen pellet. Telle celler ved hjelp av den Trypan blå flekker metode under mikroskop. Antall celler fra en 10 cm x 15 cm huden del er ca 50-100 x 106 celler. Hver 75 cm2 kultur kolbe, overføre 8 x 106 celler med 12 mL 37 ° C KSFM. Forsiktig risting kultur flasker for å sikre jevn fordeling av cellene.
- Inkuber keratinocytter i en 37 ° C inkubator med 100% luftfuktighet og 5% CO2. Endre mediet etter 2 dager og tre ganger ukentlig. Passasjen celler når kulturen er 70-80% confluent, som tar ca 2 uker avhengig spredning av keratinocytter.
2. passaging av keratinocytter
- Varme riktig mengde 0,05% Trypsin-EDTA løsning på 37 ° C i en inkubator. Bruk 4,5 mL 0,05% Trypsin-EDTA løsning for en 75 cm2 kultur kolbe.
- Fjerne mediet fra cellene, og legge 4,5 mL/75 cm2 kultur kolbe pre varmet 0,05% Trypsin-EDTA løsning til cellene. Plasser kultur kolbe i inkubator (37 ° C), og etter ca 5 min, sjekk under mikroskopet hvis cellene har startet løsne.
- Når ca 50% av cellene har løsnet, forsiktig traff kultur kolbe mot hånden til å løsne de gjenværende cellene. Deretter hvis du vil deaktivere trypsin, legge til 6 mL av RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) 75 cm2 kultur kolbe og overføre celle suspensjon til 50 mL rør.
- Skyll kultur flasker med 3 mL RPMI 1640 + 2% FBS og legge til 50 mL rør. Sentrifuge celler for 10 min 450 x g ved romtemperatur.
- Resuspend pelleted cellene i 10 mL av KSFM (37 ° C). Telle celler og overføre 3 x 106 celler til en 150 cm2 kultur kolbe med 20 mL KSFM (37 ° C). Forsiktig risting kultur flasken for å sikre jevn fordeling av cellene. Fryse cellene når kulturen er 80-90% confluent, som tar ca 4-6 dager avhengig spredning av keratinocytter (se avsnitt 3, frysing protokollen nedenfor). Utvid keratinocytter å generere riktige frosne aksjer.
3. frysing av keratinocytter
- Varme riktig mengde 0,05% Trypsin-EDTA løsning på 37 ° C i en inkubator. Bruk 9 mL 0,05% Trypsin-EDTA løsning for en 150 cm2 kultur kolbe.
- Fjerne mediet fra cellene, og legge 9 mL/150 cm2 kultur kolbe pre varmet 0,05% Trypsin-EDTA løsning til cellene. Plasser kultur kolbe i inkubator (37 ° C), og etter ca 5 min, sjekk under mikroskopet hvis cellene har startet løsne.
- Når ca 50% av cellene har løsnet, forsiktig traff kultur kolbe mot hånden for å løsne de gjenværende cellene. Deretter hvis du vil deaktivere trypsin, legge til 12 mL av RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) 150 cm2 kultur kolbe og Sug opp cellen suspensjon til 50 mL rør.
- Skyll kultur flasker med 6 mL av RPMI 1640 + 2% FBS og legge til 50 mL rør. Sentrifuge rør i 10 min 450 x g på 4 ° C. Forberede iskald celle frysing medium (KSFM + 10% DMSO).
- Resuspend celle pellet i KSFM + 10% DMSO telle celler og fryse cellene på en tetthet av 6 x 106 celler/mL bruker standard treg frysing kryonisk bevaring metoder12.
- Lagre keratinocytter i flytende nitrogen (damp fase) til klar til bruk.
4. tining og dyrking frosne keratinocytter
- Raskt tine riktig frosne ampullene i et 37 ° C vannbad. Bruk 70% etanol for å rengjøre utsiden av cryovial. Overføre riktig antall celler (ca 15000 celler/cm2) til en kultur kolbe og umiddelbart legge forvarmes oppblomstringen medium (KSFM) til kultur kolbe.
Alle størrelser av kultur kolber kan brukes avhengig av oppsettet av eksperimentet. - Bruke 5 mL kultur medium for en 25 cm2 kultur kolbe.
Merk: Våre data har vist at gjennomsnittlig 95% av celler isolert av protokollen beskrevet her er positivt for keratinocyte-markør cytokeratine-1413.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kalsium-indusert Terminal differensiering
Menneskelige keratinocytter gjennomgår terminal differensiering på behandling med kalsium14,15,16. Primære menneskelige keratinocytter ble isolert og kultivert som beskrevet i over protokollen. Når ca 50-60% confluent, cellene ble stimulert med kalsium (1,2 mM) eller kjøretøy og bilder av cellene ble tatt dagen 0, 1 og 2. Figur 1 viser morfologiske endringer av keratinocytter observert på kalsium stimulering.
Uttrykket Involucrin er økt på kalsium stimulering
Kultivert menneskelig keratinocytter var vokst til ca 50-60% confluent etter som cellene ble stimulert med kalsium (1,2 mM) eller et redskap for 24 og 48 h. Vi viste at parallelt med økt differensiering cellene som observert av morfologiske endringene av keratinocytter, mRNA uttrykk for differensiering markør involucrin økt betydelig på kalsium stimulering. Etter 24 og 48 h stimulering, ble involucrin mRNA uttrykket økt ca 5.5-fold og 3.5-fold, henholdsvis sammenlignet med kjøretøy (figur 2).
IL-1β-indusert fosforylering av p38 MAPK
Å avgjøre hvis de isolerte menneskelige keratinocytter var lydhør overfor cytokin-indusert aktivering av intracellulær signalveier, kultivert keratinocytter ble stimulert med IL-1β (10 ng/mL) for ulike tidspunkt. Innen 5 min, IL-1β stimulering førte til en rask aktivering/fosforylering av p38 MAPK, som bestemmes av vestlige blotting. Etter 1 h, hadde IL-1β-indusert p38 MAPK fosforylering returnert til basale nivå (Figur 3). Bare phosphorylated form av p38 MAPK ble økt, som IL-1β stimulering hadde ingen effekt på det totale protein nivået av p38 MAPK (Figur 3).
Figur 1 : Representant bilder av kalsium-indusert differensiering av keratinocytter. Kultivert primære menneskelige keratinocytter ble stimulert med kjøretøy (dH2O) eller kalsium (1,2 mM) for de angitte tidspunkt. (A - E) Fase kontrast bilder av keratinocytter dag 0 (A), dag 1 (B og C) og dag 2 (D og E) etter kalsium stimulering. Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Økt mRNA uttrykk for involucrin på kalsium stimulering. Kalsium (1,2 mM) eller kjøretøy (dH2O) ble lagt til kulturperler primære menneskelige keratinocytter for de angitte tidspunkt (n = 3). RNA ble isolert og uttrykk for differensiering markør involucrin analysert av qPCR. RPLP0 (Ribosomal Protein store P0) mRNA uttrykket ble brukt for normalisering. Resultatene representerer gjennomsnittlig ± SD fra tre forskjellige eksperimenter. p < 0,05 sammenlignet med kjøretøy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : IL-1β-indusert fosforylering av p38 MAPK. Kultivert primære menneskelige keratinocytter ble stimulert med kjøretøy (PBS + 0,15% BSA) eller IL-1β (10 ng/mL) for de angitte tidspunkt. Protein ekstrakter ble isolert og vestlige blotting analyse brukes til å måle phosphorylated nivået på p38 MAPK og totalt p38 MAPK. Lik lasting ble bekreftet av inkubasjon med et anti-β-utgangen antistoff. Data fra en representativ prøve av tre vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi hvordan lett isolere primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud, og kultur dem i vitro. Denne modellen kan ha et bredt program for undersøkelse av epidermal cellebiologi, og kan være nyttig for forskere interessert i å studere kutan sykdommer.
Noen av fordelene av protokollen beskrevet her er at i motsetning til keratinocytter isolert fra neonatal foreskin fra nyfødte menn under omskjæring, primære menneskelige keratinocytter fra voksne pasienter er isolert fra både menn og kvinner og kan inkludere noen alder ≥18 år. Dermed er biologiske mangfoldet mye større i disse cellene sammenlignet med keratinocytter fra neonatal foreskin. Videre kan relativt store biter av huden prøver oppnås fra pasienter som gjennomgår plastisk kirurgi, som brystreduksjon eller vekttap kirurgi.
Som nevnt ovenfor er overhuden organisert i ulike lag tilsvarer spesifikke differensiering scenen keratinocytter. For å studere huden biologi, er modellen beskrevet her begrenset av mangel på en tredimensjonal microenvironment. Ulike lag av overhuden samt de ulike celletyper i huden er ikke etterlignet i denne modellen. For å overvinne dette, menneskelig hud tilsvarende modeller kan brukes som består av et flerlags epitel der keratinocytter skille ved eksponering til en luft-væske-grensesnittet, og dermed mer tett etterligne de innfødte overhuden17, 18,19. En annen modell som kan oppnås for å studere huden biologi er ex vivo huden modellen, der hud biopsies holdes i kulturer på en luft-flytende interphase som beskrevet tidligere20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. Forfatteren har noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatteren ønsker å takke Annette Blak Rasmussen og Kristine Moeller deres kundestøtte
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | - |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | - |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | - | - | Forceps from any company can be used |
| Scissors | - | - | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | - | - | - |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | - | - | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | - |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | - |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J.
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A.
- Fuchs, E., Raghavan, S.
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G.
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
