Summary
جلد الإنسان يعمل كخط أول للدفاع ضد البيئة الخارجية. نحن نقدم طريقة لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار. هذه الخلايا الكيراتينيه معزولة هي مفيدة في الأجهزة التجريبية العديدة، وهي نموذج مناسب جداً لدراسة الآليات الجزيئية في البيولوجيا الجلدي في المختبر.
Abstract
والوظيفة الرئيسية للخلايا الكيراتينيه توفير السلامة الهيكلية للبشرة، وبالتالي الحفاظ على حاجز ميكانيكية على العالم الخارجي. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا الكيراتينيه تلعب دوراً أساسيا في البدء، والصيانة، وتنظيم الاستجابات المناعية البشرة بكونها جزءا من نظام المناعة الفطرية الاستجابة للمحفزات مستضدي بطريقة سريعة وغير محدد. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار، وتبين أن هذه الخلايا تستجيب للتمايز المحطة الطرفية المستحثة بالكالسيوم، الذي يقاس بتعبير زيادة من إينفولوكرين علامة تمييز. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تبين أن الخلايا الكيراتينيه معزولة تستجيب لتفعيل مسارات الإشارات داخل الخلايا التي يسببها 1β إيل مقاسا بتنشيط p38 MAPK المسار. أخذت معا، يصف لنا طريقة للعزل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار. لأن الخلايا الكيراتينيه نوع الخلية الغالبة في البشرة، يعد هذا الأسلوب مفيداً لدراسة الآليات الجزيئية في البيولوجيا الجلدي في المختبر.
Introduction
الجلد هو أكبر جهاز في جسم الإنسان، ويعمل كحاجز وقائي ضد البيئة الخارجية. ويتألف الجلد من طبقتين الرئيسية: الأدمة والبشرة، حيث يشكل البشرة الطبقة الخارجية من الجلد. نوع الخلية الأكثر وفرة في البشرة من الخلايا الكيراتينيه تتألف من أكثر من 95% من الخلية الجماعية1،2. يتم الاحتفاظ بمراحل مختلفة من التمايز في البشرة الخلايا الكيراتينيه ويتم تنظيمها في الطبقات القاعدية والشائكة والحبيبية، وكورنيفيد التي تتوافق مع مراحل محددة من التمايز3. الوظيفة الأساسية للخلايا الكيراتينيه لتوفير السلامة الهيكلية للبشرة، وبالتالي إنتاج حاجز سليمة للعالم الخارجي.
الخلايا الكيراتينيه أيضا تمثل الخط الأول للدفاع ضد العوامل الممرضة في الجلد، وذلك دوراً هاما في الاستجابة المناعية الفطرية4،5. تعرض الخلايا الكيراتينيه للمنبهات الخارجية يؤدي إلى تفعيل مسارات الإشارات داخل الخلايا، وفي وقت لاحق، إنتاج عدد من الوسطاء التهابات مختلفة بما في ذلك السيتوكينات والمستقطبات الببتيدات المضادة للميكروبات. هذه البروتينات المشتقة من keratinocyte المشاركة في الاستجابة الالتهابية عن طريق تجنيد وتفعيل الخلايا المناعية مثل الخلايا الجذعية، العَدلات، وخلايا T محددة6،7. وهكذا، لأن الخلايا الكيراتينيه تلعب دوراً حاسما في العديد من العمليات البيولوجية، كان الأساس المنطقي لهذه التقنية المقدمة هنا لإنشاء نموذج في المختبر لدراسة البيولوجيا الجلد. كثيرا ما تستخدم الثقافات keratinocyte الأولية التي تم الحصول عليها من حديثي الولادة القلفة لدراسة البيولوجيا الجلد8،9. ومع ذلك، مع الأسلوب الموصوفة هنا، الكيراتينيه من كلا الجنسين يتم الحصول عليها أدى تنوع البيولوجي أعلى من الخلايا.
نقدم هنا، بروتوكول مفصل لعزله وجيل من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار، بما في ذلك الصيانة وتجميد الخلايا الكيراتينيه. والهدف العام لهذا الأسلوب هو توليد الكيراتينيه البشرية الأساسية التي يمكن استخدامها كنموذج لدراسة البيولوجيا الجلدي في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جمع عينات الجلد من المتطوعين البالغين صحية خضوعه لجراحة التجميل يتطلب موافقة من اللجنة الأخلاقية في المؤسسات المضيفة. وأقر هذا البروتوكول الإقليمية الأخلاقية اللجنة من منطقة Midtjylland، الدانمرك (M-20110027). الأسلوب الموصوفة هنا هي المستمدة من دراسات مماثلة من ماسياق et al. ليو وكاراسيك11و 10 .
1-عزل الخلايا الكيراتينيه من جلد الإنسان
- ابدأ بتقديم الحلول التالية: حل 50 مل من 0.25% جلوكوز التربسين و 0.1 في المائة في دببس. ميكس وتصفية تعقيم (0.2 ميكرومتر) الحل. إعداد 10 مل ربمي-1640 + 2% FBS الحل، 50 مل من دببس و keratinocyte خالية من المصل المتوسطة (كسفم). إضافة ملاحق كسفم و 250 ميليلتر مع الجنتامايسين إلى 500 مل كسفم. قبل الحارة الحلول إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- جمع الجلد من المتطوعين البالغين صحية خضوعه لجراحة التجميل. عينات الجلد المستخدمة هي حوالي 10 سم × 15 سم، ولكن يمكن أن تختلف في الحجم. الحفاظ على الجلد باردة تحت بند النقل بنقل عينات الجلد في مربع الستايروفوم التي تحتوي على عنصر تبريد. إذا لزم الأمر، يمكن تخزين العينة الجلد عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- إزالة الدهون من أسفل المقطع الجلد باستخدام مقص معقم والمشارط، وملقط.
- مشبك بالمقطع الجلد (حوالي 10 × 15 سم) على غلاف عقيمة على رأس لوحة باستخدام الإبر. أولاً، قم بتنظيف الجلد بوسادة شاش معقم جاف. ثم قم بتنظيف الجلد باستخدام وسادة شاش معقم مع الإيثانول 70%.
- استخدام استواء سيرا على أقدام، قطع من الطبقة العليا (البشرة) قسم الجلد ووضعها في سم 9 طبق بيتري. ثم فورا إضافة 25 مل الحل دببس/التربسين/الجلوكوز (إعداد في الخطوة 1، 1) إلى طبق بيتري. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- استخدام ماصة إزالة الحل دببس/التربسين/الجلوكوز من طبق بيتري وإضافة 10 مل من RPMI 1640 + 2% FBS لإلغاء تنشيط التربسين.
- استخدام الملقط اثنين، الآن إطلاق خلايا البشرة في المتوسط بلطف كشط والتحريض البشرة والمقصورة الجلد من أقسام الجلد.
- تصفية تعليق خلية البشرة من خلال عامل تصفية معادن (حجم فجوة 1 ملم)، وجمع في أنبوب 50 مل. إضافة المقاطع الجلد المتبقية إلى أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل 1640 RPMI دون FBS ودوامه لتصفية س. 10 التعليق من خلال المعدن تصفية في أنبوب 50 مل الذي يحتوي على تعليق خلية البشرة. إضافة دببس إلى إجمالي حجم 50 مل.
- الطرد المركزي بتعليق خلية لمدة 10 دقيقة في 450 x ز في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه خلية البشرة في حوالي 10 مل من 37 درجة مئوية كسفم تبعاً لحجم الخلية بيليه. عد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق تلطيخ الأسلوب تحت المجهر. عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من قسم جلد 10 × 15 سم من حوالي 50-100 × 106 خلايا. لكل قارورة الثقافة2 75 سم، نقل 8 × 106 خلايا جنبا إلى جنب مع 12 مل 37 درجة مئوية كسفم. بلطف يهز قوارير الثقافة لضمان التوزيع الموحد للخلايا.
- احتضان الخلايا الكيراتينيه في حاضنة 37 درجة مئوية مع 100% رطوبة و 5% CO2. تغيير في المتوسط بعد يومين وثلاث مرات أسبوعيا. مرور الخلايا عند الثقافة روافد 70-80 ٪، التي تستغرق حوالي 2 أسابيع تبعاً لمعدل انتشار الخلايا الكيراتينيه.
2-باساجينج من الخلايا الكيراتينيه
- الحرارة المبلغ المناسب لحل يدتا التربسين 0.05% إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. استخدام 4.5 مل من محلول يدتا التربسين 0.05% قارورة ثقافة2 75 سم.
- إزالة المتوسطة من الخلايا، وإضافة 4.5 مل/75 سم2 الثقافة قارورة استعد قبل حل يدتا التربسين 0.05% للخلايا. ضع قارورة الثقافة في الحاضنة (37 درجة مئوية) وبعد حوالي 5 دقائق، تحقق تحت المجهر إذا كانت الخلايا قد بدأ تفكك.
- عندما قد خففت حوالي 50% الخلايا، بلطف ضرب قارورة الثقافة ضد اليد لتخفيف الخلايا المتبقية. لإلغاء تنشيط التربسين، إضافة 6 مل ربمي-1640 + 2% FBS (37 درجة مئوية) إلى قارورة الثقافة2 75 سم ثم نقل تعليق خلية لأنابيب 50 مل.
- شطف قوارير الثقافة مع 3 مل من RPMI 1640 + 2% FBS وإضافة إلى أنابيب 50 مل. الطرد المركزي خلايا لمدة 10 دقيقة في 450 x ز في درجة حرارة الغرفة.
- ريسوسبيند الخلايا الأعلاف في 10 مل كسفم (37 درجة مئوية). عد الخلايا ونقل 3 × 106 خلايا 150 سم2 ثقافة قارورة جنبا إلى جنب مع 20 مل كسفم (37 درجة مئوية). بلطف يهز قارورة الثقافة لضمان التوزيع الموحد للخلايا. تجميد الخلايا عند الثقافة روافد 80-90 ٪، الذي يستغرق حوالي 4-6 أيام تبعاً لمعدل انتشار الخلايا الكيراتينيه (انظر القسم 3، تجميد البروتوكول أدناه). توسيع نطاق الخلايا الكيراتينيه لتوليد الأرصدة المجمدة المناسبة.
3-تجميد الخلايا الكيراتينيه
- الحرارة المبلغ المناسب لحل يدتا التربسين 0.05% إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. استخدام 9 مل من محلول يدتا التربسين 0.05% 150 سم2 ثقافة قارورة.
- إزالة المتوسطة من الخلايا، وإضافة2 مل 9/150 سم الثقافة قارورة استعد قبل 0.05% يدتا التربسين حل للخلايا. ضع قارورة الثقافة في الحاضنة (37 درجة مئوية) وبعد حوالي 5 دقائق، تحقق تحت المجهر إذا كانت الخلايا قد بدأ تفكك.
- عندما قد خففت حوالي 50% الخلايا، بلطف ضرب قارورة الثقافة ضد اليد من أجل تخفيف الخلايا المتبقية. لإلغاء تنشيط التربسين، إضافة 12 مل ربمي-1640 + 2% FBS (37 درجة مئوية) إلى قارورة الثقافة2 150 سم ثم نضح تعليق خلية لأنابيب 50 مل.
- شطف قوارير الثقافة مع 6 مل من RPMI 1640 + 2% FBS وإضافة إلى أنابيب 50 مل. الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 10 دقيقة في 450 غ س في 4 درجات مئوية. تعد الخلية المثلج تجميد المتوسطة (كسفم + 10% [دمس]).
- ريسوسبيند بيليه الخلية في كسفم + 10% [دمس]، عد الخلايا، وتجميد الخلايا في كثافة 6 × 106 خلايا/مل باستخدام أساليب تجميد تجميد بطيء القياسية12.
- تخزين الخلايا الكيراتينيه في النتروجين السائل (مرحلة البخار) حتى جاهزة للاستخدام.
4-ذوبان الجليد واستزراع الخلايا الكيراتينيه المجمدة
- سرعة ذوبان الجليد القنينات المجمدة المناسبة في حمام مائي 37 درجة مئوية. استخدام الإيثانول 70% لتنظيف الجزء الخارجي من كريوفيال. نقل العدد المناسب من الخلايا (خلايا/سم تقريبا 15,0002) قارورة ثقافة وفورا إضافة النمو قبل حرارة متوسطة (كسفم) إلى قارورة الثقافة.
ويمكن استخدام أي حجم من قوارير الثقافة تبعاً للإعداد للتجربة. - استخدام 5 مل الثقافة المتوسطة قارورة ثقافة 25 سم2 .
ملاحظة: البيانات المتوفرة لدينا قد أثبتت أن 95% الخلايا المعزولة ببروتوكول الموصوفة هنا إيجابية بالنسبة لل 14 سيتوكيراتيني keratinocyte ماركر13في المتوسط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تمايز المحطة الطرفية المستحثة بالكالسيوم
الكيراتينيه البشرية تخضع للتمايز المحطة الطرفية عند المعاملة بالكالسيوم14،،من1516. الكيراتينيه البشرية الأولية كانت معزولة ومثقف كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. عندما حفز الخلايا مع الكالسيوم (1.2 مم) حوالي 50-60% روافد، أو أخذت السيارة وصور للخلايا في اليوم 0 و 1 و 2. ويبين الشكل 1 التغيرات المورفولوجية للخلايا الكيراتينيه ولاحظ عند تنشيط الكالسيوم.
التعبير إينفولوكرين هو "زيادة على تحفيز الكالسيوم"
وكانت الكيراتينيه البشرية مثقف نمت حتى حوالي 50-60% روافد بعد الذي حفز الخلايا مع الكالسيوم (1.2 مم) أو وسيلة ل 24 و 48 ساعة. أظهرنا أن بالتوازي مع ازدياد التمايز للخلايا كما لاحظ التغييرات الشكلية من الخلايا الكيراتينيه، ارتفعت كثيرا التعبير مرناً من إينفولوكرين علامة التمايز عند تنشيط الكالسيوم. بعد 24 و 48 ساعة من التحفيز، زيادة حوالي 5.5-fold التعبير مرناً إينفولوكرين و 3.5-fold، على التوالي، بالمقارنة مع مركبة (الشكل 2).
إيل 1β--المستحثة الفسفرة من p38 MAPK
لتحديد ولو استجابة للتنشيط التي يسببها سيتوكين من مسارات الإشارات داخل الخلايا الكيراتينيه البشرية المعزولة، حفز الخلايا الكيراتينيه مثقف مع إيل-1β (10 نانوغرام/مل) لنقاط زمنية مختلفة. ضمن 5 دقائق، تحفيز إيل-1β أدى إلى تنشيط سريع/الفسفرة من p38 MAPK، كما يحددها النشاف الغربية. بعد ح 1، عاد 1β المستحثة إيل p38 MAPK الفسفرة على المستوى القاعدي (الشكل 3). وزيد فقط على شكل فوسفوريلاتيد p38 MAPK، كما قد حفز إيل-1β أي تأثير على مستوى مجموع البروتين p38 MAPK (الشكل 3).
الشكل 1 : صور الممثل للتمايز المستحثة بالكالسيوم من الخلايا الكيراتينيه. حفز مثقف الكيراتينيه البشرية الأولية مع مركبة (dH2س) أو الكالسيوم (1.2 مم) للنقاط الزمنية المشار إليها. (ألف-هاء) المرحلة الصور على النقيض من الخلايا الكيراتينيه في يوم 0 (A)، 1 (باء و جيم)، واليوم 2 (د وه) بعد تنشيط الكالسيوم. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : زيادة التعبير مرناً من إينفولوكرين عند تنشيط الكالسيوم. الكالسيوم (1.2 مم) أو مركبة (dH2س) أضيفت إلى مثقف الكيراتينيه البشرية الأولية للنقاط الزمنية المشار إليها (n = 3). الجيش الملكي النيبالي كانت معزولة والتعبير عن إينفولوكرين علامة التمايز تحليلها بواسطة qPCR. RPLP0 كان يستخدم التعبير مرناً (P0 ريبوسومال البروتين الكبيرة) للتطبيع. وتمثل النتائج يعني ± التنمية المستدامة من ثلاث تجارب مختلفة. ف < 0.05 مقارنة بالسيارة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : 1β المستحثة إيل الفسفرة من p38 MAPK. حفز مثقف الكيراتينيه البشرية الأولية مع مركبة (برنامج تلفزيوني + 0.15% جيش صرب البوسنة) أو إيل-1β (10 نانوغرام/مل) للنقاط الزمنية المشار إليها. مقتطفات البروتين بتحليل النشاف معزولة والغربية المستخدمة لقياس مستوى p38 MAPK فوسفوريلاتيد ومجموع p38 MAPK. تم التحقق من تحميل متساوية بالحضانة مع جسم المضادة-β-أكتين. وترد البيانات المستمدة من تجربة ممثل واحد من كل ثلاثة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحن تصف كيفية عزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار بسهولة، وكيف أن الثقافة لهم في المختبر. هذا النموذج يمكن أن يكون أحد تطبيقات واسعة للتحقيق في بيولوجيا الخلايا البشرة، ويمكن أن يكون مفيداً للباحثين المهتمين بدراسة الأمراض الجلدية.
بعض المزايا للبروتوكول هو موضح هنا على النقيض من الخلايا الكيراتينيه معزولة عن الولدان القلفة التي تم الحصول عليها من الذكور حديثي الولادة تمر بالختان، الكيراتينيه البشرية الأولية من المرضى البالغين معزولة من الرجال والنساء على حد سواء ويمكن أن تشمل أي سنوات العمر إيه وان إيت. وهكذا، التنوع البيولوجي أكبر بكثير في هذه الخلايا بالمقارنة مع الخلايا الكيراتينيه من القلفة الأطفال حديثي الولادة. وعلاوة على ذلك، يمكن الحصول على قطع كبيرة نسبيا من عينات الجلد من المرضى الذين يخضعون لجراحة التجميل، مثل جراحة الثدي الحد أو جراحة فقدان الوزن.
كما هو مذكور أعلاه هو تنظيم البشرة في طبقات مختلفة المقابلة لمرحلة محددة تمايز الخلايا الكيراتينيه. من أجل دراسة البيولوجيا الجلد، يقتصر النموذج الموصوف هنا بعدم المكروية ثلاثي الأبعاد. لا هي تحاكي مختلف طبقات البشرة، فضلا عن أنواع مختلفة من خلية موجودة في الجلد في هذا النموذج. للتغلب على هذا، جلد الإنسان يعادل يمكن استخدام النماذج، التي تتكون من ظهارة متعدد الطبقات حيث الكيراتينيه التفريق عند التعرض إلى واجهة الهواء السائل، وبالتالي، أكثر عن كثب محاكاة البشرة الأصلية17، 18،19. هو نموذج آخر يمكن الحصول عليه من أجل دراسة البيولوجيا الجلد السابقين فيفو الجلد النموذج، والذي يتم الاحتفاظ خزعات الجلد في الثقافات الطور البيني الهواء السائل كما هو موضح سابقا20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. وقد صاحب البلاغ لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر أنيت بلاك راسموسن ومولر كريستين على دعمها التقني
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | - |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | - |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | - | - | Forceps from any company can be used |
| Scissors | - | - | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | - | - | - |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | - | - | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | - |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | - |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J.
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A.
- Fuchs, E., Raghavan, S.
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G.
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
