Summary
人間の皮膚は外部環境に対する防御の最初の行として機能します。大人の皮膚から人間ケラチノ サイト主を分離する手法を提案します。これらの孤立したケラチノ サイトは、多数の実験のセットアップに便利、皮膚の生物学の in vitroの分子機構を研究するための非常に適してモデル
Abstract
ケラチノ サイトの主な機能は、それにより外の世界に機械的な障壁を維持する表皮の構造的な整合性を提供することです。加えて、ケラチノ サイトは、高速、非特異的に抗原刺激に応答する生得の免疫組織の部分であることによって開始、保守、および表皮の免疫応答の調節に重要な役割を再生します。ここで、成人の皮膚から人間ケラチノ サイト主の隔離のためのプロトコルを記述し、これらの細胞はカルシウム誘発性分化、分化マーカー involucrin の発現の増加によって測定されるように応答を示します。さらに、分離のケラチノ サイトが p38 MAPK 経路の活性化による細胞内シグナル伝達経路の IL 1 β による活性化に敏感であることを示します。一緒に取られて、分離、成人の皮膚からプライマリ ヒト角化培養するための方法について述べる。優勢な細胞型表皮ケラチノ サイトであるために、このメソッドは皮膚の生物学体外の分子メカニズムの研究に有用です。
Introduction
皮膚は人体の最大の臓器であり、外部環境に対する保護バリアとして機能します。皮膚は 2 つの主要な層で構成される: 真皮と表皮が皮膚の最外層を構成する表皮。表皮の最も豊富なセル型はケラチノ サイト細胞質量1,2の 95% 以上を構成します。ケラチノ サイトは、表皮の分化の各段階で維持され、分化3の特定の段階に対応する基底、棘、粒状、角質層に分類されます。ケラチノ サイトの主な機能は、それにより外の世界にそのままバリアを作り出す表皮の構造的な整合性を提供することです。
ケラチノ サイトも皮膚の病原体に対する防御の最初の行を表す、したがって自然免疫応答4,5で重要な役割を果たします。ケラチノ サイトの外部からの刺激への暴露は、サイトカイン、ケモカイン、および抗菌ペプチドを含む様々 な炎症性メディエーターの数の生産をその後、細胞内のシグナル伝達経路の活性化につながります。これら表皮細胞由来のタンパク質は募集し、特定の T 細胞6、7好中球、樹状細胞などの免疫細胞を活性化して炎症反応に参加します。したがって、ケラチノ サイトは、多数の生物学的プロセスに重要な役割を果たす、ので、ここで示した手法の背後にある理論的根拠は皮膚生物学を勉強するための in vitroモデルを生成します。新生児包皮から得られるプライマリ ケラチノ サイト培養皮膚生物学8,9の研究に使われます。ただし、ここで説明する手法に男女両方からケラチノ サイトは、細胞の高い生物学的多様性の結果取得されます。
ここでは、メンテナンスを含むとケラチノ サイトの凍結分離と大人の皮膚からプライマリ ヒト角化世代の詳細なプロトコルを提案します。このメソッドの全体的な目標は、 in vitro皮膚の生物学を研究するモデルとして使用することができますプライマリの人間ケラチノ サイトを生成することです。
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Protocol
プラスチック製の手術健康な成人ボランティアの皮膚のサンプルのコレクションには、ホスト機関の倫理委員会の承認が必要です。このプロトコルは、地域倫理委員会の地域中央ユラン地域、デンマーク (M-20110027) によって承認されました。ここで説明したメソッドが Maciaqらによって同様の研究から派生します。10劉と Karasek11。
1. 人間の皮膚からケラチノ サイトの分離
- 次の解決策をすることから始めます: DPBS 0.25% トリプシンと 0.1% ブドウ糖 50 mL ソリューション。ミックスとフィルターは殺菌ソリューション (0.2 μ m) です。RPMI 1640 + 2 %fbs ソリューション、DPBS と表皮細胞無血清培地 (KSFM) の 50 mL の 10 mL を準備します。KSFM 500 mL に KSFM サプリメントとゲンタマイシンの 250 μ L を追加します。あらかじめ使用前に 37 ° C への解決策を温めます。
- プラスチック製の手術健康な成人ボランティアから皮膚を収集します。皮膚の試料約 10 cm × 15 cm がサイズが異なります。冷却要素を含む発泡スチロール ボックスで皮膚検体の移送によって交通機関の下で、皮膚を冷却を保ちます。必要な場合、皮膚のサンプルと一晩 4 ° C で保存できます。
- 滅菌ハサミ、メス、鉗子を使用して皮膚のセクションの下にから脂肪を除去します。
- 針を使用して板の上に滅菌カバーの肌のセクション (約 10 cm × 15 cm) をバックルします。まず、乾燥滅菌ガーゼのパッドと肌をきれい。その後、70% エタノールで滅菌ガーゼのパッドを使用して肌をきれい。
- 足の平面を使用して、皮膚のセクションの上部層 (表皮) のカットし、9 cm シャーレに入れてください。ペトリ皿に (手順 1.1 で準備) DPBS/トリプシン/グルコース溶液の 25 mL をすぐに追加します。37 ° C で 30 分間インキュベートします。
- ピペットを使用して DPBS/トリプシン/グルコース溶液をペトリ皿から削除し、RPMI 1640 + 2% トリプシンを不活化する政府短期証券の 10 mL を追加します。
- 2 つの鉗子を使用して、表皮の細胞の優しくこすると、表皮と皮膚部分の皮膚のコンパートメントを攪拌によって今媒体に解放します。
- 金属フィルター (1 mm 穴の大きさ) を介して表皮細胞懸濁液をフィルタ リングし、50 mL のチューブで収集します。表皮細胞懸濁液を含む 50 の mL の管に金属を介して懸濁液フィルター 10 s. フィルターの FBS と渦なし RPMI 1640 の 10 mL を含む 50 mL のチューブに残りの皮膚セクションを追加します。50 mL の容量に DPBS を追加します。
- 室温で 450 x g で 10 分間の細胞懸濁液を遠心します。
- 上澄みを除去し、37 ° C KSFM 細胞ペレットのサイズによって約 10 mL で表皮細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー染色顕微鏡法を使用してセルをカウントします。10 cm x 15 cm 肌セクションから得られた細胞の数は約 50-100 x 10 の6セルです。各 75 cm2培養フラスコに一緒に 12 mL 37 ° C KSFM の 8 x 10 の6セルを転送します。細胞の均一な分布を確実に培養フラスコを軽く振る。
- 100% 湿度と 5% CO2と 37 ° C の定温器でケラチノ サイトを孵化させなさい。2 日間、週 3 回後に媒体を変更します。通路細胞文化が 70-80% 合流するケラチノ サイトの増殖率によって約 2 週間かかります。
2. ケラチノ サイトの継
- インキュベーターの 37 ° C に 0.05% トリプシン EDTA 溶液の適切な量の熱。75 cm2培養用フラスコの 4.5 mL の 0.05% トリプシン-EDTA 溶液を使用します。
- 細胞からメディアを削除し、4.5 mL/75 cm2培養用フラスコ、細胞に 0.05% トリプシン EDTA 溶液で加温を追加します。インキュベーター (37 ° C) で培養用フラスコを置き、約 5 分後に顕微鏡下で細胞が緩み始めている場合を確認します。
- ときに細胞の約 50% は消え、残りのセルを緩める手に対する培養用フラスコは優しくヒットします。トリプシンを不活化できる、75 cm2フラスコに RPMI 1640 + 2 %fbs (37 ° C) の 6 mL を追加し、50 mL のチューブに細胞懸濁液を転送します。
- RPMI 1640 + 2% の 3 ml 培養フラスコを洗い FBS 50 mL チューブに追加。室温で 450 x g で 10 分の細胞を遠心します。
- KSFM (37 ° C) の 10 mL の小球形にされた細胞を再懸濁します。セルをカウントし、3 x 10 の6セルを KSFM (37 ° C) の 20 mL と 150 cm2培養用フラスコに転送します。細胞の均一な分布を確実に培養用フラスコを軽く振る。合流を文化が 80-90% の場合、細胞を凍結、(セクション 3、凍結プロトコル下記参照) ケラチノ サイトの増殖率によって約 4-6 日かかります。適切な凍結する在庫を生成するケラチノ サイトを展開します。
3. ケラチノ サイトの凍結
- インキュベーターの 37 ° C に 0.05% トリプシン EDTA 溶液の適切な量の熱。150 cm2培養用フラスコに 0.05% トリプシン-EDTA 溶液 9 mL を使用します。
- 細胞からメディアを削除し、9 mL/150 cm2培養用フラスコ、細胞に 0.05% トリプシン EDTA 溶液で加温を追加します。インキュベーター (37 ° C) で培養用フラスコを置き、約 5 分後に顕微鏡下で細胞が緩み始めている場合を確認します。
- 細胞の約 50% は消え、残りのセルを緩める手に対する培養用フラスコ ヒット優しく。トリプシンを不活化できる、150 cm2フラスコに RPMI 1640 + 2 %fbs (37 ° C) の 12 の mL を追加し、50 mL のチューブに細胞懸濁液を吸引します。
- RPMI 1640 + 2% の 6 mL の培養フラスコを洗い FBS 50 mL チューブに追加。4 ° C で 450 x g で 10 分間のチューブを遠心分離します。冷たいセルフリーズの媒体 (KSFM + 10 %dmso) を準備します。
- KSFM + 10 %dmso 細胞ペレットを再懸濁します、セルをカウントし、標準的な遅く凍結凍結保存方法12を使用して 6 × 106セル/mL の濃度で細胞を凍結します。
- 使用する準備ができるまでには、液体窒素 (気相) のケラチノ サイトを格納します。
4. 解凍・冷凍ケラチノ サイトを培養
- 37 ° C の水浴の適切な凍結バイアルを急速に解凍します。70% エタノールを使用、クリオバイアルの外側をきれいにします。培養用フラスコ細胞 (約 15,000 のセル/cm2) の適切な番号を転送し、すぐに培養用フラスコに予め温めておいた培 (KSFM) を追加します。
実験のセットアップによっては、培養フラスコの任意のサイズを使用できます。 - 25 cm2培養用フラスコの培地 5 mL を使用します。
注: 我々 のデータは、平均でここで説明したプロトコルによって分離した細胞の 95% が陽性表皮細胞マーカー cytokeratine 1413を実証しています。
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Representative Results
カルシウム誘発性分化
ヒト角は、カルシウム14,,1516と分化を受けます。プライマリ ヒト角が分離・培養上のプロトコルで説明されているようです。約 50-60% 合流がカルシウム (1.2 mM) と細胞が刺激され、車両とセルの写真は、0、1、および 2 の日に撮影されました。カルシウム刺激時に観察されるケラチノ サイトの形態変化を図 1に示します。
Involucrin 式はカルシウム刺激時に増加
ひと培養ケラチノ サイトは、カルシウム (1.2 mM) または 24、48 h のための車両とその後セルが刺激された約 50-60% 合流まで栽培しました。我々 は、ケラチノ サイトの形態学的変化によって観測された細胞の増加の分化と並行して、分化マーカー involucrin の mRNA 発現増加大幅カルシウム刺激を示した。刺激の 24 と 48 時間後 involucrin の mRNA 発現は約 5.5-fold 増加し、3.5、車両 (図 2) と比較して、それぞれだった。
P38 MAPK のリン酸化を IL 1 β 誘導
Il-1 培養ケラチノ サイトが刺激された分離ヒト角はサイトカインが細胞内シグナル伝達経路の活性化に対応した場合を決定する (10 ng/mL) 時間の様々 なポイント。5 分以内 il-1 β 刺激は、西部にしみが付くことにより p38 MAPK の急速な活性化/リン酸化につながった。1 時間後 IL 1 β による p38 MAPK のリン酸化は、基底レベル (図 3) に戻っていた。Il-1 β 刺激は p38 MAPK (図 3) の総蛋白濃度に影響を与えなかったよう、p38 MAPK のリン酸化のみが増加しました。
図 1: ケラチノ サイトの分化をカルシウム誘発性の代表的なイメージです。主なひと培養ケラチノ サイト車両 (dH2O) または指定された時点のカルシウム (1.2 mM) と刺激を受けました。(A ・ E)ケラチノ サイト日 0 (A)、(BとC) の 1 日目と 2 日目の (DおよびE) カルシウム刺激後の位相コントラスト画像。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: カルシウム刺激 involucrin の mRNA 発現が増加します。カルシウム (1.2 mM) または車両 (dH2O) 示された時点の主なひと培養ケラチノ サイトに登録されました (n = 3)。RNA が分離され、qPCR による分化マーカー involucrin の表現を分析しました。RPLP0 (リボソーム蛋白質大きい P0) mRNA の発現は正規化に使用されました。結果は、3 つの実験からの平均 ± 標準偏差を表します。p < 車両に比べ 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: P38 MAPK のリン酸化を IL 1 β 誘発。主なひと培養ケラチノ サイト車 (PBS + 0.15 %bsa) と il-1 β 刺激を受けました (10 ng/mL) 示された時間ポイント。タンパク質抽出された p38 MAPK のリン酸化レベルを測定するために使用分離および西部のしみが付く分析および p38 MAPK を合計します。等しい荷重は抗 β-アクチン抗体の孵化によって確認されました。3 つのうちの 1 つの代表的な実験からのデータが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、大人の皮膚から人間ケラチノ サイト主を簡単に分離する方法、およびそれらを体外培養する方法について述べる。このモデルは、表皮の細胞生物学の調査のための広範なアプリケーションを持つことができます、皮膚病の研究に興味を持って研究に便利することができます。
ここで説明したプロトコルの利点のいくつかは新生児の男性の割礼を受けてから得られる新生児包皮由来ケラチノ サイトと対照をなして成人患者から人間ケラチノ サイト主が男性と女性の両方から分離≥18 歳を含めることができます。したがって、生物多様性は、新生児包皮からケラチノ サイトと比較してこれらの細胞にはるかに大きいです。また、皮膚のサンプルの比較的大規模な作品は、乳房縮小手術や減量の外科などの整形手術を受けている患者から入手できます。
前述の通り表皮ケラチノ サイトの分化段階に対応する別のレイヤーが構成されています。皮膚生物学を勉強するためにここで説明するモデルは三次元微小環境の不足によって制限されます。表皮と皮膚に存在の異なった細胞のタイプの異なる層のこのモデルでまねできません。これを克服するために人間の皮膚と同じモデルを使用できます、成っている多層上皮ケラチノ サイトを区別、気液界面への露出に、そしてこうして、もっと密接に模倣ネイティブ表皮17, 18,19。皮膚生物学を勉強するために得ることができる別のモデルは前のヴィヴォ皮膚モデルです、前述20として気液相間での文化保持、皮膚生検。
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Disclosures
.著者には、利害の対立はないです。
Acknowledgments
著者が彼らのテクニカル サポートのアネット ・ ディスティニー ラスムッセンとクリスティン ・ メラーに深くお礼申し上げます
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | - |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | - |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | - | - | Forceps from any company can be used |
| Scissors | - | - | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | - | - | - |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | - | - | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | - |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | - |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
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