Summary
人类皮肤作为抵御外部环境的第一条防线。我们提出了一种从成人皮肤中分离原代角质形成细胞的方法。这些孤立的角质形成细胞是有用的许多实验设置, 是一个非常适合的模型研究的分子机制在皮肤生物学体外.
Abstract
角质形成细胞的主要功能是提供表皮的结构完整性, 从而保持对外部世界的机械屏障。此外, 角质形成细胞扮演一个重要的角色, 在启动, 维护和调节表皮免疫反应的一部分, 是先天免疫系统反应抗原刺激的快速, 非特异性的方式。在这里, 我们描述了一个从成人皮肤分离的初级人类角质形成的协议, 并证明这些细胞反应钙诱导的终端分化, 通过增加表达的分化标记 involucrin。此外, 我们表明, 孤立的角质形成细胞是响应 IL-1β-induced 活化的胞内信号通路, 通过 p38 MAPK 通路的活化测量。我们一起介绍了一种从成人皮肤中分离和培养原代角质形成细胞的方法。由于角质形成细胞是表皮中的主要胞型, 因此该方法对皮肤生物学的分子机制 (体外) 的研究是有益的。
Introduction
皮肤是人体最大的器官, 是抵御外界环境的屏障。皮肤由两个主要层组成: 真皮和表皮, 表皮构成皮肤最外层。表皮中最丰富的细胞类型是角质形成细胞, 它包含95% 以上的胞质1,2。角质形成细胞保持在不同阶段的分化在表皮, 并组织成基底, 棘, 颗粒, 和 cornified 层, 对应的特定阶段的差异3。角质形成细胞的主要功能是提供表皮的结构完整性, 从而产生一个完整的屏障, 外部世界。
角质形成细胞也代表了第一行防御病原体在皮肤, 因此发挥重要作用的先天免疫反应4,5。角质形成细胞对外界刺激的暴露导致胞内信号传导通路的活化, 随后产生多种炎症介质, 包括细胞因子、趋化因子和抗菌肽。这些角质形成细胞衍生的蛋白质参与炎症反应, 通过招募和激活免疫细胞, 如树突状组织, 嗜中性细胞, 和特定 T 淋巴细胞6,7。因此, 由于角质形成细胞在许多生物过程中扮演着重要的角色, 这里提出的技术背后的基本原理是生成一个体外模型来研究皮肤生物学。从新生儿包皮中获得的原代角质细胞培养物通常用于研究皮肤生物学8,9。然而, 根据这里所描述的技术, 来自两性的角质形成细胞得到了更高的生物多样性。
在这里, 我们提出了一个详细的协议, 从成人皮肤分离和生成原人角质形成细胞, 包括维持和冷冻的角质。该方法的总目标是生成主要的人角质形成细胞, 可以作为一个模型来研究皮肤生物学体外。
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Protocol
在接受整形手术的健康成人志愿者身上采集的皮肤样本需要得到所在机构伦理委员会的批准。该议定书得到了丹麦 Midtjylland 区域伦理委员会的批准 (M-20110027)。这里描述的方法来自 Maciaq et al.的类似研究10和刘和 Karasek11。
1. 从人的皮肤中分离角质形成细胞
- 首先提出以下解决方案:50 毫升溶液中0.25% 胰蛋白酶和0.1% 葡萄糖在 DPBS。混合和过滤消毒 (0.2 µm) 的解决方案。准备10毫升的 RPMI-1640 + 2% FBS 溶液, 50 毫升的 DPBS 和角质形成细胞无血清培养基 (KSFM)。添加 KSFM 补充剂和250µL 庆大霉素到500毫升的 KSFM。在使用前预热溶液至37° c。
- 从健康的成人志愿者那里收集皮肤, 接受整形手术。所使用的皮肤样本约10厘米 x 15 厘米, 但可以在大小上有所不同。通过在含有冷却元件的聚苯乙烯泡沫塑料盒中运输皮肤样品, 使皮肤保持凉爽。如有必要, 皮肤样品可在4° c 过夜贮存。
- 使用无菌剪刀、手术刀和镊子, 从皮肤底部取出脂肪。
- 将皮肤部分 (大约10厘米 x 15 厘米) 系在一个使用针头的盘子上面的无菌盖子上。首先, 用干燥的消毒纱布清洁皮肤。然后用70% 乙醇消毒的纱布垫清洁皮肤。
- 使用足部刨床, 切开皮肤部分的上层 (表皮), 并将其放入9厘米的培养皿中。然后, 立即添加25毫升的 DPBS/胰蛋白酶/葡萄糖溶液 (准备在步骤 1.1) 的培养皿。孵育30分钟, 在37° c。
- 使用吸管从培养皿中除去 DPBS/胰蛋白酶/葡萄糖溶液, 并添加10毫升的 RPMI-1640 + 2% FBS, 以使胰蛋白酶钝化。
- 使用两个钳, 现在将表皮细胞释放到培养基中, 通过轻轻地刮和搅动皮肤部分的表皮和真皮室。
- 过滤表皮细胞悬浮通过金属过滤器 (1 毫米孔大小) 和收集在50毫升管子。将其余的皮肤部分添加到50毫升管, 其中含有10毫升的 RPMI-1640, 没有 FBS 和漩涡十年代. 通过金属过滤器将悬浮液过滤成含有表皮细胞悬浮液的50毫升管。将 DPBS 添加到总容量为50毫升。
- 在室温下将细胞悬浮液离心10分钟, 450 x g。
- 在大约10毫升的37° c KSFM, 根据细胞颗粒的大小去除上清和重表皮细胞颗粒。在显微镜下使用台盼蓝染色法对细胞进行计数。从 10 cm x 15 cm 皮肤剖面获得的单元格数约为 50-100 x 106单元格。对每 75 cm2培养烧瓶, 将 8 x 106单元格与12毫升37° KSFM 传输到一起。轻轻摇动培养瓶, 确保细胞均匀分布。
- 在37° c 恒温箱中孵育角质形成细胞, 100% 湿度和 5% CO2。2天三次, 每周更换培养基。传代细胞时, 文化是 70-80% 汇合, 这需要大约2周, 取决于增殖率的角质形成。
2. 角质形成细胞的传代
- 将适当数量的0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液加热到37° c 的恒温箱中。使用4.5 毫升0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液为75厘米2培养烧瓶。
- 从细胞中取出培养基, 并在细胞中添加 4.5 mL/75 cm2培养烧瓶 5ml 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。将培养烧瓶放在孵化箱中 (37 ° c), 在大约5分钟后, 在显微镜下检查细胞是否开始松动。
- 当大约50% 的细胞松动时, 轻轻地将培养瓶放在手上, 松开剩余的细胞。然后, 为了使胰蛋白酶钝化, 将6毫升的 RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° c) 添加到 75 cm2培养烧瓶中, 并将该细胞悬浮液转移到50毫升管。
- 冲洗3毫升的 RPMI 1640 + 2% FBS 的培养烧瓶, 并添加到50毫升管。在室温下离心10分钟, 450 x 克。
- 重10毫升 KSFM (37 ° c) 的颗粒细胞。将单元格计数并将 3 x 106单元格转换为 150 cm2培养瓶, 并与20毫升的 KSFM (37 ° c) 一起进行计算。轻轻摇动培养瓶, 确保细胞均匀分布。当培养 80-90% 汇合时, 冻结细胞, 这需要大约4-6 天, 这取决于角质形成的增殖率 (见下面的 3, 冻结协议)。扩大角质形成细胞以产生适当的冷冻储存。
3. 冷冻角质形成细胞
- 将适当数量的0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液加热到37° c 的恒温箱中。使用9毫升0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液为150厘米2培养烧瓶。
- 从细胞中取出培养基, 并在细胞中添加 9 mL/150 cm2培养烧瓶 5ml 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。将培养烧瓶放在孵化箱中 (37 ° c), 在大约5分钟后, 在显微镜下检查细胞是否开始松动。
- 当大约50% 的细胞松动时, 轻轻地将培养瓶放在手上, 以便松开剩余的细胞。然后, 为了使胰蛋白酶钝化, 将12毫升的 RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° c) 添加到 150 cm2培养烧瓶中, 并将细胞悬浮液吸入50毫升管。
- 冲洗6毫升的 RPMI 1640 + 2% FBS 的培养烧瓶, 并添加到50毫升管。离心管为10分钟在 450 x g 在4° c。制备 ice-cold 细胞冷冻培养基 (KSFM + 10% 亚砜)。
- 重 KSFM + 10% 亚甲基亚砜中的细胞团, 计数细胞, 并冻结细胞在密度为 6 x 106细胞/毫升使用标准慢冷冻冷冻方法12。
- 将角质形成细胞储存在液氮中 (蒸气相), 直至使用。
4. 解冻和培养冰冻角质形成细胞
- 在37° c 水浴中迅速解冻适当的冷冻瓶。用70% 的乙醇清洁 cryovial 的外部。将适当数量的细胞 (大约1.5万细胞/cm2) 转移到培养烧瓶中, 并立即将5ml 生长培养基 (KSFM) 添加到培养瓶中。
根据实验的设置, 可以使用任何大小的培养烧瓶。 - 使用5毫升培养基为 25 cm2培养瓶。
注意: 我们的数据表明, 在这里所描述的协议所隔离的细胞中, 平均有95% 是阳性的角质-标记 cytokeratine-1413。
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Representative Results
钙诱导的末端分化
人角质形成细胞接受治疗后, 钙14,15,16。主要的人角质形成细胞被隔离和培养, 如上述协议所述。当大约 50-60% 汇合, 细胞被刺激了与钙 (1.2 毫米) 或车和细胞的图片在天 0, 1 和2被采取了。图 1显示了在钙刺激下观察到的角质形成细胞的形态学变化。
钙刺激后 Involucrin 的表达增加
培养的人角质形成细胞生长, 直到大约 50-60% 汇合, 在之后单元被刺激与钙 (1.2 毫米) 或一辆车为24和 48 h。我们证明, 随着细胞分化的增加, 观察到角质形成的形态学变化, 分化标记 involucrin 的 mRNA 表达显著增加钙刺激。经过24和 48 h 的刺激, involucrin mRNA 的表达增加约5.5 倍和3.5 倍, 分别与车辆 (图 2) 相比。
p38 MAPK 的 IL-1β-induced 磷酸化
为了确定被分离的人角质形成细胞是否能反应因子诱导的细胞内信号通路激活, 培养的角质形成细胞的 IL-1β (10 ng/毫升) 的不同时间点。在5分钟内, IL-1β刺激导致快速活化/磷酸化的 p38 MAPK, 由西方印迹确定。1小时后, IL-1β-induced p38 MAPK 磷酸化已恢复到基底水平 (图 3)。只有磷酸化形式的 p38 mapk 增加, 因为 IL-1β刺激没有影响总蛋白水平的 p38 mapk (图 3)。
图 1: 钙诱导的角质形成细胞分化的代表性图像.培养的主要人角质形成细胞的刺激与车辆 (dH2O) 或钙 (1.2 毫米) 为指定的时间点。(A-E)在0天 (A)、1天 (B和C) 和天 2 (D和E) 经过钙刺激后的角质形成细胞相对比图像。缩放栏 = 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: involucrin 在钙刺激时的 mRNA 表达增加.钙 (1.2 毫米) 或车辆 (dH2O) 被添加到培养的主要人角质形成细胞为指定的时间点 (n = 3)。RNA 的分离和表达的分化标记 involucrin 分析的 qPCR。RPLP0 (核糖体蛋白大 P0) mRNA 表达用于规范化。结果表明, 来自三不同实验的平均±法令。*p和 #60; 0.05 与车辆比较。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: IL-1β-induced 磷酸化 p38 MAPK.培养的主要人角质形成细胞的刺激与车辆 (PBS + 0.15% BSA) 或 IL-1β (10 ng/毫升) 为指定的时间点。分离蛋白质提取物和西方印迹分析用于测定 p38 mapk 和总 p38 mapk 的磷酸化水平。用抗β肌动蛋白抗体进行孵育, 验证了等载量。数据从一个代表性实验三显示。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们描述了如何很容易地分离成人皮肤角质形成细胞, 以及如何培养他们在体外。该模型可以广泛应用于表皮细胞生物学的研究, 对研究皮肤疾病的研究有一定的参考价值。
这里所描述的协议的一些优点是, 与从接受包皮环切手术的新生儿包皮中分离出来的角质形成细胞相比, 成年患者的原始人角质产生者与男性和女性都是分离的。可以包括任何年龄≥18年。因此, 与新生包皮中的角质形成细胞相比, 生物多样性要大得多。此外, 还可以从接受整形手术的患者中获得比较大的皮肤标本, 如乳房复位手术或减肥手术。
如上所述表皮是组织在不同的层次对应于特定的分化阶段的角质形成细胞。为了研究皮肤生物学, 这里描述的模型是有限的缺乏一个三维微环境。表皮的不同的层数并且不同的细胞类型存在于皮肤在这个模型没有被模仿。为了克服这一点, 人体皮肤等效模型可以被使用, 这包括一个多层上皮细胞在暴露于气界面上的分化, 从而更紧密地模仿本机表皮17, 18,19。另一种模型, 可以获得, 以研究皮肤生物学是ex 体内皮肤模型, 其中皮肤活检保存在文化中的一个气的界面前描述的20。
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Disclosures
.作者没有利益冲突。
Acknowledgments
作者希望感谢安妮特布拉克拉斯穆森和汀穆勒的技术支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | - |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | - |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | - | - | Forceps from any company can be used |
| Scissors | - | - | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | - | - | - |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | - | - | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | - |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | - |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
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