Summary
İnsan derisi dış ortamda karşı savunma ilk satırı olarak davranır. Biz yetişkin cilt üzerinden birincil insan lenfositi izole bir yöntem mevcut. Bu izole lenfositi çok sayıda deneysel kurulumları yararlıdır ve kutanöz Biyoloji vitro. moleküler mekanizmalar çalışmak için son derece uygun bir model vardır
Abstract
Keratinositler ana işlevi böylece dış dünya için mekanik bir engel Bakımı epidermis, yapısal bütünlüğünü sağlamaktır. Buna ek olarak, keratinositler hızlı, spesifik olmayan şekilde antijenik uyaranlara yanıt doğuştan gelen bağışıklık sisteminin bir bölümü olarak başlatma, bakım ve düzenleme epidermal bağışıklık yanıtı, temel bir rol oynar. Burada, biz birincil insan lenfositi yetişkin deri, izolasyon için bir iletişim kuralı tanımlamak ve bu hücreler farklılaşma işaret involucrin artan bir ifade göre ölçülen kalsiyum kaynaklı terminal farklılaşma yanıt göstermektedir. Buna ek olarak, izole lenfositi aktivasyonu p38 MAPK tarafından ölçülen duyarlı hücre içi sinyal yolları için IL-1β-indüklenen aktivasyonu olduğunu göstermektedir. Birlikte ele alındığında, yalıtım ve yetişkin cilt üzerinden birincil insan keratinositler, kültür için bir yöntem açıklanmaktadır. Lenfositi epidermis baskın hücre tipinde olduğu için bu moleküler mekanizmalar Kutanöz Biyoloji içinde vitroçalışma için yararlı bir yöntemdir.
Introduction
Deri insan vücudunun en büyük organı ve dış çevreye karşı koruyucu bir bariyer görevi görür. Deri iki ana katmandan oluşur: dermis ve epidermis nerede epidermis derinin en dış tabakası oluşturan,. Epidermisin en bol bulunan hücre türü hücre kitle1,%295'den fazla oluşan lenfositi değil. Keratinositler farklılaşma epidermisin içinde çeşitli aşamalarında korunur ve farklılaşma3belirli aşamalarında karşılık Bazal, spinöz, taneli ve cornified katmanlar halinde düzenlenir. Keratinositler birincil işlevi böylece dış dünyaya sağlam bir bariyer üreten epidermis, yapısal bütünlüğünü sağlamaktır.
Keratinositler da deride patojenlere karşı savunma ilk satırı temsil eder ve bu nedenle doğuştan gelen bağışıklık yanıtı4,5' te önemli bir rol oynamaktadır. Keratinositler pozlama dış uyaranlara karşı harekete geçirmek için hücre içi sinyal yolları ve daha sonra üretim, sitokinler, kemokinler ve antimikrobiyal peptidler gibi çeşitli inflamatuar aracılar birkaç açar. Bu keratinosit kaynaklı proteinler alımı ve dendritik hücreler, nötrofil ve belirli T hücreleri6,7gibi bağışıklık hücreleri aktive tarafından inflamatuar yanıt olarak katılmak. Böylece, keratinositler çok sayıda biyolojik işlemlerinde çok önemli bir rol oynamak çünkü burada sunulan teknik arkasındaki mantığı deri Biyoloji çalışmaya bir vitro modeli oluşturmak için idi. Yenidoğan sünnet derisi elde edilen birincil keratinosit kültürler genellikle deri Biyoloji8,9incelemek için kullanılır. Ancak, burada açıklanan tekniği ile lenfositi üzerinden her iki cinsiyette hücreleri daha yüksek bir biyolojik çeşitlilik sonucu elde edilir.
Burada, yalıtım ve yetişkin deri, birincil insan lenfositi nesil için detaylı bir protokolü keratinositler dondurma ve bakım dahil olmak üzere mevcut. Bu yöntem genel amacı Kutanöz Biyoloji içinde vitroçalışma için bir model olarak kullanılan birincil insan lenfositi üretmektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sağlıklı yetişkin gönüllü plastik cerrahisi uygulanan deri örnekleri koleksiyon ana bilgisayar kurumlarında etik kurul onayı gerektirir. Bu iletişim kuralı bölgesel Etik Komitesi, bölge Midtjylland tarafından Danimarka (M-20110027) kabul edildi. Burada açıklanan yöntemi Maciaq vd tarafından benzer çalışmalardan elde edilir 10 ve Liu ve Karasek11.
1. insan deri lenfositi yalıtım
- Başlatmak aşağıdaki çözümleri yaparak: 50 mL solüsyon % 0.25 tripsin ve % 0.1 glikoz DPBS içinde. Mix ve filtre (0.2 µm) çözüm sterilize. RPMI-1640 + % 2 FBS çözüm, DPBS ve keratinosit serum-Alerjik orta (KSFM) 50 mL 10 mL hazırlayın. KSFM takviyeleri ve 250 µL viomisin, 500 mL KSFM ekleyin. 37 ° C kullanmadan önce için çözümleri önceden ısıtmak.
- Cilt sağlıklı yetişkin gönüllüler plastik cerrahisi uygulanan toplamak. Kullanılan deri örnekleri yaklaşık 10 cm x 15 cm, vardır ama boyutu değişebilir. Ulaşım altında deri serin deri örnekleri soğutma bir öğeyi içeren bir Styrofoam kutusu taşıma tarafından tutmak. Gerekirse, deri örneği 4 ° C'de gecede depolanabilir.
- Steril makas, neşter ve forseps kullanarak cilt bölümü altında gelen yağ çıkarmak.
- Cilt bölümü (yaklaşık 10 cm x 15 cm) steril bir kapak iğneleri kullanarak bir plaka üzerine toka. Önce Cilt Kuru steril gazlı bez pad ile temizleyin. Sonra deri % 70 etanol ile steril gazlı bez pad kullanarak temiz.
- Bir ayak planer kullanarak, Cilt bölüm üst tabakası (epidermis) kesin ve bir 9 cm Petri kabına yerleştirin. O zaman, hemen 25 mL (1.1 adımda hazırlanan) DPBS/tripsin/glukoz çözeltisi Petri kabına ekleyin. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
- Bir pipet kullanarak DPBS/tripsin/glikoz çözüm Petri kabına kaldırın ve 10 mL RPMI-1640 + %2 FBS tripsin devre dışı bırakın ekleyin.
- İki forseps kullanarak, şimdi epidermal hücrelerin orta yavaşça kazıma ve epidermal ve deri bölümleri dermal bölmesinin Tantanacı serbest.
- Epidermal hücre süspansiyon bir metal filtre (1 mm delik boyutu) filtre ve bir 50 mL tüp içinde toplamak. RPMI-1640 FBS ve girdap olmadan 10 mL süspansiyon ile metal filtre epidermal hücre süspansiyon içeren bir 50 mL tüp içine 10 s. filtre içeren bir 50 mL tüp için geri kalan cilt bölümleri ekleyin. DPBS toplam hacmi 50 mL için ekleyin.
- Hücre süspansiyon vasıl 450 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak ve epidermal hücre Pelet 37 ° C KSFM hücre Pelet boyutuna bağlı olarak yaklaşık 10 ml resuspend. Trypan boyama yöntemi mikroskop altında mavi kullanarak hücreleri saymak. Yaklaşık 50-100 x 106 hücre hücre bir 10 cm x 15 cm cilt bölümünden elde edilen sayıdır. Her 75 cm2 kültür şişesi için 8 x 106 hücreleri ile birlikte 37 ° C KSFM 12 mL aktarın. Yavaşça hücrelerin tekdüze dağılım sağlamak için kültür şişeler sallamak.
- %100 nem oranı ve % 5 CO237 ° C kuluçka lenfositi kuluçkaya. Orta 2 gün ve üç kez haftalık sonra değiştirin. Geçiş hücreleri lenfositi proliferasyon oranını bağlı olarak yaklaşık 2 hafta sürer % 70-80 birleşmesi kültürdür.
2. passaging keratinositler
- Bir kuluçka 37 ° C'de % 0.05 tripsin-EDTA çözüm uygun miktarda ısı. 4.5 mL % 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi bir 75 cm2 kültür şişesi için kullanın.
- Orta hücrelerden kaldırın ve 4.5 mL/75 cm2 kültür şişesi % 0.05 tripsin-EDTA çözüm hücrelere önceden ısınmış ekleyin. İnkübatör (37 ° C) kültür şişeye koyun ve hücreleri gevşeme başlattıysanız yaklaşık 5 dakika sonra mikroskop altında kontrol edin.
- Hücreleri yaklaşık % 50'si gevşetti, hafifçe kalan hücreleri gevşetmek için el karşı kültür şişeye çarptı. Sonra tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için 75 cm2 kültür şişesi için 6 mL RPMI-1640 + %2 FBS (37 ° C) ekleyin ve hücre süspansiyon 50 mL tüpler için transfer.
- Kültür şişeler RPMI 1640 + %2 3 mL ile durulayın FBS ve 50 mL tüpler için ekleyin. Hücreler için 450 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi.
- KSFM (37 ° C) 10 mL pelleted hücrelerde resuspend. Hücreleri saymak ve 3 x 106 hücreler bir 150 cm2 kültür şişesi ile birlikte KSFM (37 ° C) 20 mL transfer. Yavaşça hücrelerin tekdüze dağılım sağlamak için kültür şişeyi sallayın. Kültür bağlı olarak (bkz: Bölüm 3, iletişim kuralı aşağıdaki buz gibi) lenfositi nükleer silahların yayılmasına karşı oranı yaklaşık 4-6 gün sürer % 80-90 birleşmesi olduğunda hücreleri dondur. Keratinositler uygun dondurulmuş hisse oluşturmak için genişletin.
3. lenfositi dondurulması
- Bir kuluçka 37 ° C'de % 0.05 tripsin-EDTA çözüm uygun miktarda ısı. 9 mL % 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi 150 cm2 kültür şişesi için kullanın.
- Orta hücrelerden kaldırın ve 9 mL/150 cm2 kültür şişesi % 0.05 tripsin-EDTA çözüm hücrelere önceden ısınmış ekleyin. İnkübatör (37 ° C) kültür şişeye koyun ve hücreleri gevşeme başlattıysanız yaklaşık 5 dakika sonra mikroskop altında kontrol edin.
- Hücreleri yaklaşık % 50'si gevşetti, yavaşça kültür şişeye el karşı kalan hücreleri gevşetmek için çarptı. O zaman, tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için 150 cm2 kültür şişesi için 12 mL RPMI-1640 + %2 FBS (37 ° C) ekleyin ve hücre süspansiyon 50 mL tüpler için Aspire edin.
- Kültür şişeler RPMI 1640 + %2 6 mL ile durulayın FBS ve 50 mL tüpler için ekleyin. 450 x g 4 ° C'de 10 dakika için tüpler santrifüj kapasitesi Orta (KSFM + % 10 DMSO) soğuk buz gibi hücre hazırlayın.
- Hücre Pelet KSFM + % 10 DMSO resuspend, hücreleri saymak ve hücreleri bir yoğunluk olarak 6 x 106 hücre/mL standart yavaş dondurma dondurma yöntemleri12kullanarak, Don.
- Keratinositler sıvı azot (Buhar fazı) kullanıma hazır kadar saklayın.
4. çözülme ve donmuş lenfositi kültür
- Hızla bir 37 ° C su banyosu uygun dondurulmuş şişeleri çözülme. % 70 etanol cryovial dışını temizlemek için kullanın. Hücreleri (yaklaşık 15.000 hücreler/cm2) uygun sayıda bir kültür şişesi aktarmak ve hemen kültür şişeye Önceden ısıtılmış büyüme orta (KSFM) ekleyin.
Kültür şişeler herhangi bir boyut deneme kurulumuna bağlı olarak kullanılabilir. - 5 mL kültür orta bir 25 cm2 kültür şişesi için kullanın.
Not: Bizim veri ortalama burada açıklanan protokol tarafından izole hücreler % 95'i keratinosit-marker cytokeratine-1413için olumlu olduğunu gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Terminal farklılaşma kalsiyum kaynaklı
İnsan lenfositi terminal farklılaşma üzerine kalsiyum14,15,16ile tedavi tabi. Birincil insan lenfositi izole ve yukarıdaki protokolünde açıklandığı gibi kültürlü. Ne zaman yaklaşık % 50-60 birleşmesi, hücreleri kalsiyum (1,2 mM) ile teşvik ya da araç ve hücreleri resimlerini 0, 1 ve 2 günde alınmıştır. Şekil 1 kalsiyum stimülasyon gözlenen lenfositi morfolojik değişiklikler gösterir.
Involucrin ifade artış üzerine kalsiyum stimülasyon olduğunu
Kültürlü insan lenfositi yaklaşık % 50-60 birleşmesi sonra hücreleri kalsiyum (1,2 mM) veya 24 ve 48 s için bir araç ile teşvik kadar yetişkin. Keratinositler morfolojik değişiklikler tarafından gözlemlediği gibi hücreleri artan farklılaşma paralel olarak, farklılaşma işaret involucrin mRNA ifade önemli ölçüde kalsiyum stimülasyon artış gösterdi. Stimülasyon 24 ve 48 saat sonra involucrin mRNA ifade yaklaşık 5.5-fold artmış ve 3.5-fold, sırasıyla, araç (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında.
IL-1β-indüklenen fosforilasyon p38 MAPK
İzole insan lenfositi sitokin kaynaklı harekete geçirmek-in hücre içi sinyal yolları için duyarlı olsaydı, kültürlü lenfositi uyarılmış IL-1β ile belirlemek için (10 ng/mL) çeşitli zaman puan için. 5 dk içinde IL-1β stimülasyon Western Blot tarafından belirlendiği gibi bir hızlı harekete geçirmek/fosforilasyon için p38 MAPK, bir yol açtı. 1 saat sonra IL-1β-indüklenen p38 MAPK fosforilasyon Bazal seviyeye (şekil 3) geri döndü. IL-1β stimülasyon p38 MAPK (şekil 3) toplam protein düzeyi üzerinde etkisi olduğu gibi sadece p38 MAPK fosforile şeklinde artış olmuştur.
Resim 1 : Kalsiyum kaynaklı farklılaşma lenfositi temsilcisi görüntülerini. Kültürlü birincil insan lenfositi araç (dH2O) ya da kalsiyum (1,2 mM) için belirtilen zaman puan ile teşvik. (A - E) Keratinositler gün 0(a), gün (B ve C) 1 ve 2. gün (D ve E) kalsiyum stimülasyon sonra faz kontrast görüntüler. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : İnvolucrin kalsiyum stimülasyon üzerine mRNA ifade arttı. Kalsiyum (1,2 mM) ya da araç (dH2O) belirtilen süre puan için birincil kültürlü insan lenfositi eklendi (n = 3). RNA izole edildi ve farklılaşma işaret involucrin ifade qPCR tarafından analiz. RPLP0 (ribozomal Protein büyük P0) mRNA ifade normalleştirme için kullanıldı. Sonuçları ortalama ± SD üç farklı deneylerden temsil eder. p < 0,05 araç ile karşılaştırıldığında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : IL-1β-indüklenen fosforilasyon, p38 MAPK. Kültürlü birincil insan lenfositi uyarılmış araç (PBS + % 0.15 BSA) veya IL-1β (10 ng/mL) belirtilen süre puan için. Proteini özleri edildi p38 MAPK fosforile düzeyini ölçmek için kullanılan izole ve Western Blot analizi ve toplam p38 MAPK. Eşit yük bir anti-β-aktin antikor ile kuluçka tarafından doğrulandı. Üçte bir temsilcisi deney verileri gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, kolayca yetişkin cilt üzerinden birincil insan lenfositi yalıtmak ve onları vitrokültür anlatan. Bu model epidermal hücre biyolojisi incelenmesi için geniş bir uygulama olabilir ve araştırmacılar Kutanöz hastalıkları okumak isteyen için yararlı olabilir.
Burada açıklanan protokol avantajları bir kısmı yeni doğan erkek sünnet geçiren elde yenidoğan sünnet derisi üzerinden izole lenfositi aksine yetişkin hastalarda birincil insan lenfositi hem erkek hem de kadın izole edilmiştir ve herhangi bir yaş ≥18 yıl içerebilir. Böylece, biyolojik çeşitlilik lenfositi yenidoğan sünnet derisi üzerinden ile karşılaştırıldığında Bu hücrelerde çok daha büyüktür. Ayrıca, deri örnekleri parça nispeten büyük meme küçültme ameliyatı veya kilo kaybı cerrahi gibi plastik cerrahisi uygulanan hastalarda elde edilebilir.
Yukarıda da belirtildiği gibi epidermis lenfositi belirli ayırt etme aşamasına karşılık gelen farklı katmanlar halinde düzenlenmiştir. Deri Biyoloji çalışma için burada açıklanan modeli üç boyutlu bir microenvironment eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Epidermis olarak deride mevcut farklı hücre tipleri farklı katmanlar bu modelde taklit değil. Bu sorunu gidermek için insan derisi eşdeğer modelleri, hangi oluşur çok katmanlı bir epitel keratinositler maruz hava-sıvı arayüzü için üzerine ayırt etmek ve böylece, daha yakından yerli epidermis17, taklit eden kullanılabilir 18,19. Deri Biyoloji çalışma için elde edilen başka bir cilt biyopsileri kültürler, yukarıda açıklanan20olarak bir hava-sıvı Interphase tutulur ex vivo cilt modeli modelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. Yazar hiçbir çıkar çatışması vardır.
Acknowledgments
Yazar Annette Blak Rasmussen ve Kristine Moeller teknik verdikleri destek için teşekkür istiyor
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | - |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | - |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | - | - | Forceps from any company can be used |
| Scissors | - | - | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | - | - | - |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | - | - | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | - |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | - |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J.
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A.
- Fuchs, E., Raghavan, S.
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G.
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
