Summary
פרוטוקול זה מתאר הזיוף של משטחי זכוכית אופטית באיכות הספוחה עם תרכובות המכילות ארוכי שרשרת פחמימנים יכול לשמש כדי לפקח פיוז'ן מקרופאג של דגימות החיים ומאפשרת סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה של דגימות קבוע .
Abstract
להמחיש את היווצרות תאי ענק multinucleated (MGCs) מן החי דגימות מאתגרת בשל העובדה כי ביותר טכניקות הדמיה בשידור חי דורשות הפצת האור מבעד לזכוכית, אבל על זכוכית פיוז'ן מקרופאג הוא אירוע נדיר. פרוטוקול זה מציג הזיוף של משטחי זכוכית אופטית באיכות מספר היכן ספיחה של תרכובות המכילות ארוכי שרשרת פחמימנים הופכת זכוכית משטח fusogenic. ראשית, הכנה של משטחי זכוכית נקי כמתחילה חומר עבור שינוי פני השטח המתואר. שנית, שיטת מסופק עבור ספיחה של תרכובות המכילות ארוכי שרשרת פחמימנים להמרת הלא-fusogenic זכוכית מצע fusogenic. שלישית, פרוטוקול זה מתאר ייצור של micropatterns משטח המקדמים רמה גבוהה של שליטה ייתכן על היווצרות MGC. לבסוף, בדיית כלי הזכוכית התחתונה מתואר. דוגמאות לשימוש במבחנה התאים במערכת זו כמודל ללמוד פיוז'ן מקרופאג ויצירת MGC מוצגים.
Introduction
היווצרות של MGCs מלווה מספר מצבים פתולוגיים בגוף האדם מכובד על ידי דלקת כרונית1. למרות הסכם זה mononucleated מקרופאגים הפתיל טופס MGCs2, אך מספר מחקרים הראו היתוך בהקשר עם חיים דגימות3,4. זה בגלל משטחי זכוכית נקי הנדרשים עבור רוב טכניקות הדמיה לא לקדם פיוז'ן מקרופאג כאשר המושרה על ידי ציטוקינים דלקתיים5. אכן, אם זכוכית נקי משמש מצע פיוז'ן מקרופאג, ואז נמוך מטרות ביניים ההגדלה (קרי, X 10-20), יותר מ 15 h של רציפות הדמיה לעיתים קרובות נדרשים לקיים אירוע יחיד פיוז'ן.
על יד אחרים, משטחי פלסטיק fusogenic (למשל, permanox) או כיתה בקטריולוגית פלסטיק לקדם פיוז'ן2. עם זאת, הדמיה דרך פלסטיק הוא בעייתי, כיוון המצע עבה, מחליקי אור. זה מסבך הדמיה מאז זמן עבודה מרחק (LWD) מטרות נדרשים. עם זאת, המטרות LWD יש בדרך כלל איסוף קיבולת לעומת עמיתו שלהם תוקן coverslip אור נמוכה. יותר, טכניקות לנצל שינויים הקוטביות של האור עובר דרך הדגימה כגון התערבות דיפרנציאלית ניגודיות הם בלתי אפשרי מאחר פלסטיק הוא birefringent. המחסומים הקשורים לשימוש של פלסטיק בעץ־תה עוד יותר העובדה כי זה בלתי אפשרי לחזות איפה היווצרות MGC/פיוז'ן מקרופאג תתרחש על פני השטח. יחד, מגבלות אלה להגביל את החזיית פיוז'ן מקרופאג כדי שלב אופטיקה חדות, מורחב הכולל משכים הדמיה (> 15 שעות רצוף), ברזולוציה נמוכה.
לאחרונה זוהו משטח זכוכית fusogenic מאוד כשניצח מיקרוסקופ ברזולוציה סופר יחיד מולקולה עם קבוע מקרופאגים/MGCs4. התבוננות זו היה מפתיע כי לנקות זכוכית משטחים לקדם פיוז'ן בקצב נמוך מאוד של ~ 5% לאחר 24 שעות בנוכחות אינטרלוקין-4 (IL-4) כפי שנקבע על ידי היתוך גרעיני אינדקס4. מצאנו כי היכולת לקדם פיוז'ן היה עקב זיהום oleamide. ספיחה של oleamide או תרכובות אחרות שהכיל באופן דומה ארוכי שרשרת פחמימנים עשה את fusogenic זכוכית. רוב fusogenic מורכבים (פרפין) הייתה micropatterned, שהצפיפות רמה גבוהה של שליטה ייתכן פיוז'ן מקרופאג עלייה 2-fold מספר האירועים פיוז'ן נצפתה בתוך אותה כמות זמן בהשוואה permanox. משטחים אלה איכות אופטית סיפק הצצה ראשונה לתוך מורפולוגיות ו קינטיקה המפקחים על היווצרות של MGCs ב חי דגימות.
ב פרוטוקול זה אנו מתארים את ייצור מגוון רחב של משטחי זכוכית זה יכול לשמש כדי לפקח על היווצרות של MGCs מן החי דגימות. בנוסף, אנו מראים כי משטחים אלה נתונות שיטות סופר-זיהוי רחוק-שדה. משטח פבריקציה נוספת תלויה מטרת הניסוי, כל השטח המתואר בדוגמאות הקשורות בטקסט שתמשיך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלים לנצל חיות אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש ועדות-Mayo Clinic, Janelia מחקר בקמפוס אוניברסיטת המדינה של אריזונה.
1. הכנת ניקיתי חומצה מכסה זכוכית
הערה: ייתכן כיסוי זכוכית רכשה מיצרנים רבים לא תהיה נקייה כצפוי. לשקול באופן שגרתי ניקוי אצוות של כיסוי זכוכית לפני כל הליך שבו מעורב מיקרוסקופ.
- לרכוש לכתחילה גבוהה כיסוי זכוכית. לקחת טיפול מיוחד לבחור בעובי הנכון (או 0.17 0.15 מ"מ).
הערה: הבחירה של עובי כיסוי זכוכית תלוי המטרה מיקרוסקופ, רשומה ישירות החבית אובייקטיבית. - דגירה על חיפוי זכוכית 12 מ' חומצה הידרוכלורית בשכונה fume כימי מאוורר היטב עבור h 1 עם sonication (42 kHz, 70 W). חזור על שלב זה עבור שתי שעות נוספות עם טרי 12 M HCl.
- למלא גביע נפרד עם הנדסה גנטית מים ולהוסיף את מכסה הזכוכית. Sonicate הזכוכית המכסה למשך 5-10 דקות בשכונה כימי מאוורר היטב. חזור על שלב זה עשר פעמים.
- דגירה על זכוכית מכסה אצטון טהור בשכונה כימי מאוורר היטב למשך 30 דקות עם sonication. חזור על שלב זה עבור שתי פעמים נוספות.
- למלא גביע נפרדות עם מים הנדסה גנטית סטרילי ולהוסיף את מכסה הזכוכית. Sonicate הזכוכית המכסה למשך 5-10 דקות בשכונה כימי מאוורר היטב. חזור על שלב זה עשר פעמים.
- דגירה על זכוכית מכסה 100% אתיל אלכוהול בשכונה כימית למשך 30 דקות עם sonication. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
הערה: טוהר אתיל אלכוהול חשוב. מזהמים בצורה של מוצקים מומסים יתייבש על הזכוכית ולקדם פיוז'ן מקרופאג. - לאחסון לטווח ארוך, למקם את הזכוכית המכסה ניקיתי חומצה במיכל מלא טהור אתיל אלכוהול. לחלופין, יבש הזכוכית המכסה עם גז חנקן, בחנות desiccator ואקום.
2. הכנת משטחים אופטיים Fusogenic באיכות
- להמיס נטולת דימתיל סולפוקסיד התכה גבוהה נקודת פרפין, טולואן הנדסה גנטית.
הערה: מניות ריכוזים מתבצעים ב- 10 מ"ג/מ"ל, נמצאים מדולל 1:9 טולואן הנדסה גנטית כדי להפוך 1 מ"ג/מ"ל הפתרון עובד.
התראה: טולואן שצריך לנהוג בזהירות כמו teratogen. תשליך טולואן בתוכנית היגיינה כימי מוסדיים. - החל פרפין עובד פתרון זכוכית חיפוי יבש ניקיתי חומצה בווליום אחיד המכסה את פני השטח של זכוכית. Decant פתרון עודף ויבש הזכוכית המכסה עם גז חנקן או אוויר. לשימוש הכנה בתפזורת, צנצנת Coplin נועד להכיל את מכסה הזכוכית.
- פולנית הזכוכית הכיסוי לפי 3 קווי ציר x ולפי הבא 3 משיכות בציר y עם מגבון נטולת מוך (ראה טבלה של חומרים).
- מיד לפני הניסוי התנהלה, לשטוף את הזכוכית כיסוי סטרילי מים הנדסה גנטית ולאחר מכן לחטא למשך 15-30 דקות עם האור האולטרה סגול בשכונה בטיחות ביולוגית. לחלופין, לעקר את הזכוכית המכסה על ידי הקרנה אתילן אוקסיד או גאמא.
3. פחמימנים Micropatterning המכילים תרכובות להגבלת פיוז'ן כדי מראש אזורים
- יבש הזכוכית המכסה ניקיתי חומצה, לשתק את הזכוכית על משטח שטוח.
- בזהירות באמצעות מלקחיים, לטבול רשת שידור זהב finder מיקרוסקופ אלקטרונים בהפתרון עובד של compound(s) פחמימנים. בוחרים תרכובת פחמימנים שעונה היעד הסופי של הניסוי (ראה טבלה 1). לפתיל פתרון עודף משם על-ידי הקשה בעדינות את הרשת על נייר סינון, מיד למקם את הרשת במרכז הזכוכית המכסה. לאפשר את טולואן לייבוש למשך 2 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא.
- ודא כי הרשת היא מודבקת הזכוכית על-ידי היפוך בעדינות את הזכוכית. אם הרשת לניתוק וחזור על שלב מספר 3.2 באמצעות כוס כיסוי חדשה.
הערה: אם מסך פלזמה מנקה אינה זמינה, להשמיט שלב 3.4. - פלזמה תנקה את הזכוכית המכסה על ידי טיפול עם ואקום גז פלסמה.
הערה: הרשת finder משמשת כמסיכה להגן על השטח שמתחת הספוחה עם ארוכי שרשרת פחמימנים מ הפלזמה. האזורים שאינם הם מוגנים על-ידי הרשת מעובדים שאינן fusogenic על ידי חשיפה פלזמה. כמות הזמן שהזכוכית המכסה היא לחשוף כדי פלזמה צריך להיקבע מדעית. - בעזרת מלקחיים פיין-עצה, הסר בזהירות את הרשת ממשטח הזכוכית כדי לחשוף את micropattern.
4. בדיית כלי הזכוכית התחתונה
- לקדוח חור עגול 6-10 מ מ בחלק התחתון של 35 מ מ פלסטיק באמצעות מקדחה שלב צלחת פטרי.
הערה: חיוני להשתמש מקדחה צעד כדי ליצור קצוות חלקים. אם הקצוות גסות מדי, הזכוכית המכסה לא יקשרו שטוחות על החלק התחתון של המנה. משטחים שטוחים מושלם להקשות על מיקרוסקופ. - לערבב היטב, דגה elastomer סיליקון לפי הוראות היצרן (קרי, polydimethylsiloxane; PDMS).
- להחיל ציפוי דק של אלסטומר המוערכת רק עד הקצה (קריcircumscribing) החור.
הערה: elastomer אמור להופיע כלהקה רציפה אמנם דק סביב החור. - בעדינות חלות הזכוכית המכסה fusogenic (המתוארת בסעיף 2), או יבש ניקיתי חומצה כיסוי הזכוכית (המתוארת בסעיף 1) המנה על מנת לכסות את הבור מוקף elastomer. ודא כי הזכוכית המכסה מופיע מיושר עם החלק התחתון של המנה מרחיב מעבר קוטר החור כך חלק ניכר של הזכוכית היא בקשר עם הפלסטיק. לרפא את elastomer על ידי אפייה ב 50 מעלות צלזיוס במשך 2-3 h.
- אם fusogenic זכוכית הוא המועדף, UV לעקר את התאים מאכל והתרבות על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. עם זאת, אם micropattern הוא המועדף, המשך לשלב 3.2 להכנה micropattern (פלזמה גז בשימוש במהלך micropatterning sterilizes המנה, חריפה זוגות PDMS זכוכית).
5. איסוף מקרופאגים Thioglycollate-elicited
- להזריק עכברים C57BL/6 בן שבוע 8 עם 0.5 מ של פתרון סטרילי של thioglycollate 4% ברואר כפי שתואר לעיל3,4,6.
- שבעים ושתיים שעות מאוחר יותר, להרדימו על פי טיפול בבעלי חיים מאושרים, השתמש בהנחיות, לאסוף מקרופאגים על ידי שטיפת הצפק בתמיסת כקרח באגירה פוספט בתוספת 5 מ מ ethylenediaminetetraacetate.
- Centrifuge של המקרופאגים ב g x 300 למשך 3 דקות ו resuspend ב 1 מ"ל של DMEM:F12 בתוספת 15 מ מ HEPES, אנטיביוטיקה % FBS ו- 1% 10 (תרבות בינוני).
הערה: התאים נספרים לאחר מכן עם hemocytometer נויבאואר. מקרופאגים מדולל על הריכוז המתאים, המוחל על המשטחים. מספר התאים כדי להחיל על משטח נתון יש לשקול בזהירות על ידי החוקר לצורך השאלה ניסיוני. התייעץ עם סטנדרטים ידועים בספרות העיקרית. - לאחר 30 דקות לשטוף את המשטחים עם HBSS בתוספת 0.1% BSA כדי להסיר תאים שאינם מחסידי, ולהחליף בינונית תרבות טריים. להחזיר את התרבויות החממה (5% CO2 באוויר ב 37 מעלות צלזיוס).
- שעתיים מאוחר יותר, תשאף המדיום והחלף בינוני תרבות בתוספת 10 ננוגרם למ"ל של IL-4. תמונה התאים כמתואר4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרמטרים physicochemical של חומרים יש השפעה דרמטית על מידת מקרופאג fusion7,8,9,10. יתר על כן, השטח מזהמים ידועים כדי לקדם פיוז'ן מקרופאג11. לכן חשוב נקי כדי להתחיל עם כיסוי זכוכית כפקד שלילי עבור פיוז'ן מקרופאג. כאשר ניקה כפי שמתואר פרוטוקול 1, הזכוכית המכסה היא במיוחד שטוח עם תכונות פני השטח, ברור אין בעוד ספיחה של ארוכי שרשרת פחמימנים ואחריו ליטוש משטח יוצר מידה של nanotopography (איור 1).
על משטחים נקיים כיסוי זכוכית, מקרופאגים נתיך בקצב נמוך מאוד (איור 2). לעומת זאת, לאחר 24 שעות בנוכחות IL-4, המקרופאגים חלה על משטחים הספוחה עם תרכובות המכילות ארוכי שרשרת פחמימנים עוברים חזקים פיוז'ן (איור 2). יתרה מזאת, ספיחה של הממס לבד (למשל, טולואן, אלכוהול איזופרופיל) לא עושה זכוכית משטח fusogenic (איור 2).
למרות שאין זה סביר כי שכבה 10-nm של פחמימנים הספוחה משפיעה באופן דרמטי על רזולוציה, היה בכל זאת חשוב להעריך באופן כמותי את הפרש הפוטנציאלים ברזולוציה בקרב משטחים שונים. רזולוציה מוגדרת בדרך כלל לפי הקריטריון ריילי. מדד חלופי, אשר משמש לעתים קרובות כדי לאמוד את הרזולוציה היא ברוחב-מלא חצי מקסימום (FWHM) של מבנים קטנים יותר ממגבלת עקיפה של אור. חשוב, אין שום הבדל ניכר ב FWHM של 100 חרוזים פלורסנט nm בין משטחים שונים (איור 3 א), רומז כי המאפיינים של זכוכית הנדרש עבור הדמיה פלורסנט נשמרו מספיק. יתר על כן, הצלחנו לייצר. שדה evanescent ולבצע 3D ישיר שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופיה של מקרופאגים חלה על משטחים המכיל ארוכי שרשרת פחמימנים (איור 3B). מגוון רחב של טכניקות הדמיה לחיות הם האפשריים כאשר מקרופאגים מוחלים על פני השטח (איור 4, 1 וידאו משלימה, משלימה סרטון 2).
היתרון של כל אחד מממדי מתוארת בטבלה1. שימו לב כי הרוב המכריע של טכניקות הדמיה מתקדמים שדורשים גבוהה נה שמן טבילה מטרות עולה בקנה אחד עם רוב משטחי פלסטיק fusogenic כיוון שהם עבים, יש מידה מסוימת של autofluorescence. יצוין כי משטחים הספוחה עם ארוכי שרשרת פחמימנים לאפשר מספר רב של טכניקות הדמיה כולל12 דקל/dSTORM/GSDIM13,14,15,16, 17, DIC, ואחרים18,19,20,21 (טבלה 1). יתר על כן, לא רק מספר רב של אפשריות טכניקות הדמיה (טבלה 1), אך השימוש micropattern מאפשר רמה גבוהה של שליטה ייתכן על היווצרות MGC (איור 4B; משלימה וידאו 1).
איור 1 : משטחים פרפין הספוחה יש מידה מסוימת של הטופוגרפיה משטח ננו- AFM סריקות (5 x 5 מיקרומטר) של משטחי זכוכית הצג אין תכונות הטופוגרפי ברור ואילו משטחי פרפין-הספוחה מכיל מערכים של חומר לקשט את פני השטח. בסולם האינטנסיביות מצד ימין של כל micrograph מראה גובה לאורך ציר z. פסי בקנה מידה הם 500 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : משטחים הספוחה עם ארוכי שרשרת פחמימנים לקדם פיוז'ן מקרופאג על מכסה הזכוכית. (א) בהיעדר IL-4, נראה שיש מעט מאוד תאים multinucleated על משטחי זכוכית נקי כפי שנקבע על ידי הכתם של רייט. פחמימנים (B) לאחר 24 h בנוכחות IL-4, משטחים הספוחה עם הממס נהגה solubilize שרשרת ארוכה (למשל, טולואן או אלכוהול איזופרופיל) יש כמה תאי multinucleated. (C–E) לעומת זאת, משטחים הספוחה עם ארוכי שרשרת פחמימנים לקדם פיוז'ן ויצירת MGC. פרפין ספיחה תוצאות ברמה הגבוהה ביותר של IL-4 המושרה פיוז'ן. MGCs מתוארים בשחור. (F) מידת MGC היווצרות permanox פלסטיק מוצג עבור השוואה. לכל תמונה, כחול בהיר מראה הגרעינים, הציטופלסמה מופיע בסגול. פסי בקנה מידה הם 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : משטחים הספוחה עם ארוכי שרשרת פחמימנים אינן משפיעות באופן דרמטי רזולוציה. השוואה (A) של 100 ננומטר פלורסנט חרוזים מואר עם מיקרוסקופ הכולל פנימי השתקפות קרינה פלואורסצנטית (TIRF). שיבוץ בחלונית השמאלית העליונה היא תצוגה מוגדלת חרוז ניאון יחיד. הקו האדום היה נקודות המגע המוצגים כדי להציג פרופיל קו דוגמה לחישוב FWHM. אין הבדל ניכר FWHM של 100 חרוזים nm נצפתה. פסי בקנה מידה הם 5 מיקרומטר. (B) השוואה של ההתפלגות של אינטגרין Mac-1 כפי לאומדן TIRF ו- 3D ישיר שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ. מקרופאגים היו מוחל על השטח המכיל oleamide, מודגרות עם איל-4 במשך 24 שעות ביממה. שיבוץ לבן ב' מדגיש את האזור עם תמונה ב- micrographs הבאים. פסי בקנה מידה 5 מיקרומטר לתמונות TIRF הינם 2 מיקרומטר עבור תלת-ממד סערה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : משטחים הספוחה עם ארוכי שרשרת פחמימנים לאפשר זמן לפתור נופים של פיוז'ן מקרופאג והפצת. (א) הדיאגרמה מראה ההליך המשמש ליצירת של micropattern. (B) Micropatterned משטחים להקנות שליטה ייתכן פיוז'ן מקרופאג. מספר שעות לאחר היישום של IL-4, המקרופאגים היו עם תמונה עם שלב ניגודיות. שימו לב, ההגירה של תאים מן הפנים של הרשת על גבי micropattern. פיוז'ן נצפתה רק על micropattern. המקפים לבן חלוקה לרמות את התרחבות MGC. הזמן מוצג בפינה השמאלית העליונה של כל micrograph hh:mm:ss. פסי בקנה מידה הם 50 מיקרומטר. (ג) סריג אור גיליון מיקרוסקופ20 מגלה גבוה ייתכן הדינמיקה של macrophage מתפשטת על משטח פרפין-הספוחה. צבע מקודד את התפלגות עוצמת (צהוב הוא האינטנסיבי ביותר) של eGFP-LifeAct. הזמן מוצג בפינה הימנית העליונה של כל micrograph כמו mm:ss. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פני השטח: | ||||||
| טכניקה | פרפין | Oleamide | וזלין | פרפין MP | Permanox | זכוכית נקי |
| שלב ניגודיות | כהן | כהן | כהן | כהן | כהן * | כהן |
| brightfield | כהן | כהן | כהן | כהן | כהן * | כהן |
| DIC | כהן | כהן | N/T | כהן | x | כהן |
| epifluorescence | כהן | כהן | כהן | כהן | כהן * | כהן |
| קונפוקלי | כהן | כהן | כהן | כהן | כהן * | כהן |
| TIRF | כהן | כהן | N/T | x | x | כהן |
| דקל/dSTORM/GSDIM | כהן | כהן | N/T | x | x | כהן |
| ה-SIM | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T |
| STED | N/T | כהן | N/T | N/T | N/T | כהן |
| LLSM | כהן | N/T | N/T | כהן | N/T | כהן |
| אינדקס פיוז'ן | ביניים | ביניים | ביניים | גבוהה | ביניים | נמוך |
| מיקום פיוז ' ן | אקראי | אקראי | אקראי | מוגדרת על ידי | אקראי | אקראי |
| MP-micropattern | ||||||
| DIC - התערבות דיפרנציאלית ניגודיות | ||||||
| TIRF - ידי קרינה פלואורסצנטית החזרה גמורה | ||||||
| דקל - מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivated | ||||||
| dSTORM - מיקרוסקופיה ישירה שחזור אופטי סטוכסטי | ||||||
| GSDIM - המחסור בקרקע ואחריו מולקולה בודדת להחזיר | ||||||
| SIM - תאורה מובנית | ||||||
| STED - דלדול פליטה מאולצת | ||||||
| LLSM - מיקרוסקופ אור גיליון סריג | ||||||
| כהן - תואם | ||||||
| x - לא תואם | ||||||
| כהן * - אפשרי רק עם LWD, הגדלה נמוכה או טבילה מטרות | ||||||
| N/T - לא בדקה | ||||||
טבלה 1: פוטנציאל השימושים כל השטח. שימו לב כי משטחי פלסטיק למנוע את השימוש רוב טכניקות הדמיה.
משלימה Video 1: זמן לפתור שלב חדות התצוגה היווצרות MGC. הערה את מתכונת לכאורה של היווצרות MGC. הזמן מוצג hh:mm:ss בפינה השמאלית העליונה. סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
משלימה סרטון 2: סריג אור גיליון מיקרוסקופ 20 של macrophage thioglycollate-elicited eGFP-LifeAct מתפשטת על משטח הספוחה פרפין. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצורך לזהות ולפתח לאחר מכן משטחי זכוכית אופטית באיכות המקדמים פיוז'ן מקרופאג נבע מן העובדה עד מחקר שפורסם לאחרונה לא ישירות דמיינו פיוז'ן מקרופאג בהקשר של חיים דגימות3, 4. זה בשל העובדה כי משטחי פלסטיק fusogenic המשמשים בדרך כלל דורשים LWD מטרות, מוגבלות במידה רבה לאופטיקה חדות שלב. מחסומים אלה היו להתגבר על ידי הנדסה על משטח זכוכית אופטית באיכות לא רק קידום שיעור יוצא דופן של פיוז'ן מקרופאג, אך פניני מידה מפתיעה של שליטה מרחבית על היווצרות של MGCs.
למרות טכנולוגיה זו מאפשרת את השימוש בטכניקות הדמיה מתקדמות כדי לפקח פיוז'ן מקרופאג, זה לא מגיע ללא הגבלה. למרות מלוטשת משטחים הספוחה עם ארוכי שרשרת פחמימנים (למשל, oleamide, פרפין, וכו ') לייצר שיעור יוצא דופן של פיוז'ן מקרופאג לעומת משטחי פלסטיק fusogenic, פיוז'ן נשאר במרחב סטוכסטי תהליך (איור 2). מגבלה זו מונע השימוש בהגדלה מטרות כדי להמחיש פיוז'ן עם דגימות החיים שכן היא שלא ניתן לחזות היכן תתרחש פיוז'ן. על מנת להתגבר על מגבלה זו, אנו micropatterned פרפין כדי לתחום את תהליך האיחוי לאזורים מוגדרים מראש (איור 4; משלימה וידאו 1). במרחב באמצעות כליאת פיוז'ן מקרופאג כדי micropattern אפשרה לנו לחזות איפה פיוז'ן להתרחש, לכן לנצל את מטרות הגדלה גבוהה יותר כדי לחקור את האירוע מאוד הנפש הזה.
מהי המשמעות של שימוש של משטח אופטי באיכות מקנה שליטה מרחבית של פיוז'ן מקרופאג? קודם כל, מאז משטחים אלה לקדם את שיעור גבוה של פיוז'ן, זה אפשר לעקוב אחר פיוז'ן מ דגימות חי בתוך פרק זמן סביר. זה חיוני במקרה של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מאז חשיפה מוגברת של תאים לאור מוביל photobleaching ו- phototoxicity. שנית, משטחים אלה מאפשרים מתקדם טכניקות הדמיה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית או קיטוב להיות מועסק (איור 4; טבלה 1; משלימה וידאו 1; משלימה וידאו 2). לבסוף, הפקד ייתכן המוענקת על ידי משטחים micropatterned המתוארות פרוטוקול זה צריך לזרז מחקרים שנועדו לזהות את המנגנונים הסלולר, subcellular השולטים פיוז'ן מקרופאג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
אנו מאחלים להודות חברים של Ugarova מעבדה, חוקרים במרכז על חילוף החומרים וביולוגיה וסקולרית לדיון מועיל של עבודה זו. ג'יימס פאוסט מבקש להביע את תודתי כדי המדריכים בקורס האירופי לביולוגיה מולקולרית מעבדה סופר רזולוציה מיקרוסקופיה של בשנת 2015. אנו רוצים להודות Khuon הילה זיו-Janelia על העזרה עם הכנת הדוגמא עבור LLSM. במהלך הסקירה ואת הצילומים חלקים של עבודה זו ג'יימס פאוסט נתמכה על ידי מלגת T32 (5T32DK007569-28). המרכיב סריג אור גיליון של עבודה זו נתמכה על ידי HHMI ואת בטי גורדון מור קרן. T.U. ממומן על ידי NIH הענק HL63199.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
References
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
- Helming, L., Gordon, S.
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
