Summary
このプロトコルを記述する生きている標本のマクロファージの融合の監視に使用することができ、固定標本の超解像顕微鏡の長鎖炭化水素を含む化合物を吸着した光学的品質のガラス表面の作製.
Abstract
生きている標本から巨細胞 (MGCs) の形成の可視化という最もライブ イメージング技術は、ガラスを光の伝搬を必要とするが、ガラスにマクロファージの融合は、まれなイベントのためにチャレンジしております。このプロトコルは、長鎖炭化水素を含む化合物の吸着が融合性表面にガラスを変換いくつかの光学的品質のガラス表面の作製を提示します。まず、きれいなガラス表面処理表面改質の出発原料として、説明します。第二に、融合性基板非融合性ガラスに変換する長鎖炭化水素を含む化合物の吸着のメソッドが提供されます。第三に、このプロトコルでは、MGC 形成の時空間制御の高度を促進するため表面のマイクロ パターンの作製について説明します。最後に、ガラス底培養皿を製造すると説明します。マクロファージの融合や MGC 形成を研究するモデルとしてこの体外電池システムの使用の例を示します。
Introduction
MGCs の形成に伴う慢性炎症1識別人体病理学的状態の数。Mononucleated マクロファージ ヒューズ フォーム MGCs2に合意、にもかかわらず意外にも少数の研究は、生活の文脈の中融合を示している標本3,4。ほとんどイメージングに必要なきれいなガラス表面はマクロファージの融合による炎症性サイトカイン5時を促進しないためにです。確かに、きれいなガラスとして使用する場合、基板、マクロファージの融合中間倍率の目的 (すなわち10-20 X) 及び連続 15 時間以上低画像多くの場合単一の融合イベントを観察するに必要があります。
その他の手、融合性プラスチック表面 (例えばpermanox) または細菌学的グレードのプラスチックにフュージョン2を促進します。しかし、プラスチックを通してイメージングは、基板が厚いと光が飛び散るので問題です。これはイメージング長い作動距離 (LWD) 対物レンズが必要なので複雑になります。ただし、LWD 目標通常収集能力と比べて、coverslip 修正、低光があります。さらに、以来、プラスチックの複屈折、微分干渉コントラストなど試料を通過する光の極性の変化を利用する技術が可能。プラスチックの使用に伴う障壁をそれはマクロファージの融合/MGC 形成が表面に発生する個所を予測することが可能ではないという事実によってさらに強調しました。一緒に、これらの制限は、段階の対照の光学、合計イメージング期間を拡張するマクロファージの融合の可視化を制限する (> 15 連続時間)、および低解像度。
最近マクロファージ/MGCs4分子超解像顕微鏡観察を行いながら高い融合性のガラス表面がわかりました。この観測された意外なのできれいにガラス表面の非常に低いレートで融合を促進する 〜 インターロイキン 4 (IL-4) 融合によって決定される存在下で 24 時間後 5% インデックス4。融合を促進するために容量がオレアミドの汚染が原因だったことがわかった。オレアミドまたは同様に長鎖炭化水素に含まれているその他の化合物の吸着したガラス膜融合。ほとんど融合ペプチド化合物 (パラフィン ワックス) マイクロパターニングゲル、それはマクロファージの融合と permanox と比較して同じ時間内で観測された融合イベントの数の 2 倍増加を時空間制御の高度を与えられます。これらの光学的品質の表面は形態学的特徴と生きている標本の MGCs 形成カイネティクスに最初の一見を提供しました。
このプロトコルの様々 な MGCs の生きている標本からの形成を監視するために使用できるガラス表面の作製について述べる。さらに、これらのサーフェスが遠方の超解像技術に従う義務があることを示します。表面加工は、実験の目的に依存して、各サーフェスは、進むテキストの関連の例で説明。
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Protocol
動物を利用する手順は、動物愛護とメイヨー クリニックと Janelia リサーチ キャンパス、アリゾナ州立大学で使用委員会によって承認されました。
1. カバーのガラスを酸洗浄の準備
注: 多くのメーカーから購入したカバーガラスは、どおりきれいできない場合があります。顕微鏡が関与している任意のプロシージャの前にカバー ガラスのバッチを日常的に清掃をご検討ください。
- 高い金詰りカバーガラスを購入します。正しい厚さ (0.15 または 0.17 mm) を選択する特別な注意を取る。
注: カバー ガラス厚の選択は対物レンズに依存して、客観的バレルに直接表示されます。 - 超音波 (42 kHz、70 W) で 1 時間の換気の化学発煙のフード 12 M 塩酸でカバーガラスを孵化させなさい。新鮮な 12 M HCl と追加で 2 回のこの手順を繰り返します。
- 純水を別のビーカーを記入し、カバーガラスを追加します。換気化学フードで 5-10 分間カバー ガラスを超音波照射します。この手順を 10 回繰り返します。
- 超音波処理で 30 分間換気化学フードで純粋なアセトンでカバーガラスを孵化させなさい。追加で 2 回のこの手順を繰り返します。
- 滅菌超純水と別のビーカーを記入し、カバーガラスを追加します。換気化学フードで 5-10 分間カバー ガラスを超音波照射します。この手順を 10 回繰り返します。
- 超音波処理と 30 分のための化学フード 100% エチルアルコールでカバーガラスを孵化させなさい。追加で 2 回この手順を繰り返します。
メモ: ethyl アルコールの純度が重要です。溶存固形物の形で汚染物質はガラスの上は乾燥され、マクロファージの融合を促進することができます。 - 長期保存のため純粋なアルコールを入れた容器に酸洗浄カバー ガラスを配置します。また、窒素ガスと真空デシケータ内ストア カバーガラスを乾燥させます。
2. 融合性光学的品質面の準備
- 無料の DMSO 溶解超純水トルエン高融点点パラフィン ワックス。
注: ストック濃度 10 mg/mL でなされ、希薄化後の 1:9 は超純水トルエン 1 mg/mL に作業ソリューションを作成します。
注意: トルエンは催奇形物質として注意して処理する必要があります。機関の化学衛生学の計画によるとトルエンの処分します。 - ガラス表面を均等にカバーするボリュームで乾燥酸洗浄カバー ガラスへの解決策を働いてパラフィンを適用します。余分なソリューションを捨て、窒素ガスまたは空気でカバーガラスを乾燥します。一括準備 Coplin jar カバーガラスを収容するように設計を使用します。
- X 軸の 3 本のストローク、糸くずのワイプで y 軸の 3 本のストローク次カバー ガラスを磨く (材料の表を参照してください)。
- 直前に実験を行い, 無菌純水とカバーガラスを洗浄し、その後紫外光生物学的安全フードで 15-30 分間殺菌します。また、エチレン酸化物またはガンマ照射によるカバー ガラスを滅菌します。
3. 微細炭化水素を含む化合物に融合を限定する所定の地域
- 酸洗浄カバーガラスを乾燥し、平らな面にガラスを固定します。
- 炭化水素化合の実用的なソリューションで金伝達電子顕微鏡のファインダー グリッドを浸す鉗子を使用して、慎重に。実験の目的に合った炭化水素化合物を選択 (表 1参照)。ろ紙上のグリッドをやさしくタッピングによって離れて余分なソリューションを芯し、カバー ・ ガラスの中心にグリッドをすぐに置き。次のステップに進む前に 2 分間乾燥するトルエンを許可します。
- グリッドはガラスを軽く反転によってガラスに接着されていることを確認します。グリッドは、3.2 の新しいカバーのガラスを使用して、手順を繰り返しますをデタッチします。 場合、
注: プラズマ クリーナーを使用できない場合は、ステップ 3.4 を省略します。 - プラズマ真空プラズマ処理によるカバー ガラスのクリーニングします。
注: ファインダーのグリッドは、プラズマから長鎖炭化水素を吸着した基になる表面を保護するためのマスクとして機能します。グリッドによって保護されていない領域は、プラズマへの露出によって非融合性がレンダリングされます。カバーガラスは、プラズマに公開時間の量は、経験的に決定する必要があります。 - ファイン ・ チップ鉗子を使用して、慎重に、微細パターンを公開するガラス面からグリッドを取り外します。
4. 加工ガラス底培養皿
- 35 mm プラスチック シャーレ ステップ ドリルを使用しての下で 6-10 mm の孔をドリルします。
注: ステップ ドリル ビットを使用して、滑らかなエッジを作成する重要です。エッジは、あまりにもラフ、カバーガラスが平らな皿の底に接合しないでしょう。不完全平らな表面は顕微鏡を困難にさせます。 - 慎重に混合し、ドガの (すなわちポリジメチルシロキサンの製造元の指示に従ってシリコーン ・ エラストマーPDMS)。
- エラストマーの端にだけ近接の薄いコーティングを適用 (すなわち、外接) 穴。
注: エラストマーは、ホールの周り連続とはいえ薄いバンドとして表示されます。 - エラストマーに囲まれた穴をカバーするために料理に融合ペプチド カバーガラス (2 のセクションで説明します)、または (セクション 1 で説明した) 乾燥酸洗浄カバー ガラスを適用優しく。カバー ガラス皿の底と同じ高さに表示されます、ガラスのかなりの部分がプラスチックに接触して穴の直径を超えたことを確認します。2-3 h の 50 ° C で焼成してエラストマーを硬化します。
- 融合性ガラスを優先する場合、殺菌は標準のプロトコルによると料理と文化の細胞。微細パターンをお勧め、しかし、微細パターン準備のため 3.2 手順に進みます (マイクロパターニング中に使用されるガス プラズマ殺菌皿と強くガラスに PDMS をカップル)。
5. 収集 Thioglycollate 誘発マクロファージ
- 前述3,4,64% ビール thioglycollate の滅菌溶液 0.5 mL を 8 週齢の c57bl/6 マウスを注入します。
- 七十から二時間後、承認された動物のケアによると動物を安楽死させると、ガイドラインに従うし、冷えたリン酸緩衝生理食塩水を 5 mM エチレンジアミン四酢酸を添加した腹膜灌流によるマクロファージを収集します。
- 3 分間 300 x g でマクロファージを遠心し、15 ミリメートル、HEPES を添加した DMEM:F12 の 1 mL で再懸濁します 10 %fbs、および 1% の抗生物質 (培養液)。
注: セルをその後ノイバウアー検定と数えます。マクロファージは適切な濃度に希釈して、サーフェスに適用されます。所定の表面に適用するセルの数は、実験の質問の目的のための調査官によって注意深く検討されるべき。主要な文学で知られている規格を参照してください。 - 30 分後に非付着性細胞を除去し、新鮮な培養液を交換する 0.1 %bsa を添加した HBSS で表面を洗います。文化をインキュベーター (37 ° C で空気 5% CO2 ) に戻ります。
- 2 h 後、培地を吸引し、IL-4 の 10 ng/mL 添加培養液中に置き換えます。4他の所で説明したように細胞をイメージします。
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Representative Results
材料の物理化学的パラメーターは、マクロファージの融合7,8,9,10の程度に劇的な効果を持っています。また、表面汚染物質は、マクロファージの融合11を促進するために知られています。したがって、マクロファージの融合のネガティブ コントロールとして重要なを始めるきれいなカバー ガラスです。きれいプロトコル 1 で説明したように、表面研磨による長鎖炭化水素の吸着度ナノトポグラフィ (図 1) を作成します。 一方ないの明白な表面の特徴をフラットにカバー ガラスが非常にです。
きれいなカバー ガラス表面に、マクロファージは非常に低率 (図 2) でヒューズします。対照的に、IL 4 の存在下で 24 h 後長鎖炭化水素を含む化合物を吸着した表面に適用されるマクロファージは堅牢な融合 (図 2) を受けます。さらに、(例えばトルエン、イソプロパノール) 単独で溶媒を吸着していないガラス膜融合表面 (図 2)。
炭化水素吸着の 10 nm の層が大幅に解像度に影響を与えること可能性が高いですが、それはそれにもかかわらず様々 な面の間で解像度の潜在的な違いを定量的に評価することが重要です。解像度は、通常レイリーの基準によって定義されます。近似解像力にしばしば使用される代替指標は全角半値幅 (半値幅) 光の回折限界より小さい構造。重要なは、蛍光イメージングに必要なガラスの特徴を十分に保存されていたことを示唆している (図 3 a)、様々 な面の間で 100 nm の蛍光ビーズの半値幅で明らかな違いはありません。さらに、エバネッ セント場を生成し、長鎖炭化水素 (図 3 b) を含む表面に適用される大食細胞の直接確率光三次元顕微鏡を実行することができました。ライブ イメージング技術の各種が実現可能な大食細胞、表面 (図 4、補足のビデオ 1、ビデオ 2 の補足) に適用されます。
表 1各表面の利点を説明します。高 NA オイル浸漬の目的を必要とする高度なイメージング技術の大半に厚く、蛍光の学位を持っているので、ほとんど融合性プラスチック表面と互換性がないがあるに注意してください。長鎖炭化水素吸着表面が12パーム/dSTORM/GSDIM13,14,15,16,を含むイメージング技術の多数を有効にすることに注意してください17、DIC、他18,19,20,21 (表 1)。さらに、イメージング可能 (表 1) の非常に多いだけでなく、(図 4 b; MGC 形成の時空間制御の高度を微細パターンの使用補足動画 1)。
図 1: パラフィン吸着表面ナノスケール表面地形の学位を持っている。パラフィン吸着表面の表面を飾る材料の配列を含むに対し、ガラス表面の AFM スキャン (5 x 5 μ m) は明白な地形を示さない。Z 軸に沿って各顕微鏡写真の右側にある震度を表示します。スケール バーは、500 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: と長鎖炭化水素吸着表面カバー ガラスにマクロファージの融合を促進します。(A) IL 4 がない場合は、ライトの汚れによりきれいなガラス表面に非常に少数の多核巨細胞細胞であるが。(B) 後 24 h IL-4、長鎖の可溶化に使用される溶剤を吸着した表面の存在下で炭化水素 (例えばトルエン、イソプロパノール) いくつかの多核巨細胞の細胞があります。(C-E)対照的と長鎖炭化水素吸着表面は融合と MGC 形成を促進します。IL 4 の最高度のパラフィン吸着結果は融合を誘導されます。黒で MGCs のとおりです。(F) permanox プラスチックの MGC 形成の度合いが比較のため表示されます。各画像で水色表示核と細胞質が紫色で表示。スケール バーは、100 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 3: と長鎖炭化水素吸着表面では、解像度が劇的には影響しません。(A) 全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡で照らされた 100 nm の蛍光ビーズの比較。上部の左側のパネルのはめ込みは拡大表示単一蛍光ビーズです。赤い線の値幅を計算するために使用の例ラインのプロファイルを表示する重ね合わせ。100 nm ビーズの半値幅で明らかな差は認められなかった。スケール バーは、5 μ m。 (B) 全反射と直接確率光三次元顕微鏡により評価した Mac 1 インテグリンの分布の比較。マクロファージはオレアミド含む表面に適用され、IL - 4 24 時間インキュベートします。B 白のはめ込みは、後続の顕微鏡写真のイメージ領域を強調表示します。スケール バーは、全反射画像の 5 μ m と 3 D の嵐の 2 μ m です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: と長鎖炭化水素吸着表面がマクロファージの融合および広がりの時間分解ビューを有効にします。(A) 図は、微細パターンを生成するために使用プロシージャを示しています。(B) マイクロパターニングゲル表面がマクロファージの融合の時空間的制御を与えます。IL-4 の適用後数時間位相コントラストとマクロファージをイメージしました。微細パターンにグリッドの内部から細胞の移動に注意してください。フュージョンは、微細パターンでのみ観測されました。白い破線のアウトライン、MGC の拡大。時間は、hh:mm:ss として各顕微鏡写真の左上隅に表示されます。スケール バーは、50 μ m。 (C) 格子光シート顕微鏡20明らかに高い時空間ダイナミクス パラフィン吸着面に広がっているマクロファージです。色エンコード強度分布 (黄色は最も強い) eGFP LifeAct の。時間は各 mm:ss. として顕微鏡の写真の右上隅で表示されますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 表面: | ||||||
| テクニック | パラフィン | オレアミド | ワセリン | MP パラフィン | Permanox | きれいなガラス |
| 位相コントラスト | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| 明視野観察 | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| DIC | √ | √ | N/T | √ | x | √ |
| 落射蛍光 | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| 共焦点 | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| 全反射 | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| パーム/dSTORM/GSDIM | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| SIM | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T |
| STED | N/T | √ | N/T | N/T | N/T | √ |
| LLSM | √ | N/T | N/T | √ | N/T | √ |
| 融合インデックス | 中間 | 中間 | 中間 | 高 | 中間 | 低 |
| 融合場所 | ランダム | ランダム | ランダム | 定義されています。 | ランダム | ランダム |
| MP 微細パターン | ||||||
| DIC - 微分干渉コントラスト | ||||||
| 全反射・全反射蛍光 | ||||||
| パーム - センサー ローカリゼーション顕微鏡 | ||||||
| dSTORM - 直接確率光再建顕微鏡 | ||||||
| GSDIM - 個々 の分子に続いて地上州枯渇を返す | ||||||
| シム - 構造化照明 | ||||||
| STED - 誘導放出の枯渇 | ||||||
| LLSM - 格子光シート顕微鏡 | ||||||
| √-互換性 | ||||||
| x - 互換性のないです。 | ||||||
| √ * - LWD、低倍率、または浸漬の目的でのみ可能 | ||||||
| N/T - テストしていません | ||||||
表 1: 各表面の潜在的な用途。プラスチックの表面がほとんどイメージング技術の使用を排除することに注意してください。
補足ビデオ 1: MGC 形成の時分割位相コントラスト表示。MGC 形成の明白なシンクロニシティに注意してください。時間は、hh:mm:ss の左上隅に表示されます。スケール バーは 50 μ m.このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください。
補足ビデオ 2: 格子光シート顕微鏡20パラフィン吸着表面の拡散 thioglycollate 誘発 eGFP LifeAct マクロファージ。このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
識別し、その後、マクロファージの融合を促進するため、光学的品質のガラス表面を開発する必要が最近ない出版された調査直接まで生活のコンテキストでマクロファージの融合を可視化という事実から生じた試験片3、 4。これは、一般的に使用される融合性プラスチック表面 LWD 目標を必要し、する大部分の段階の対照の光学に制限されますが原因です。これらの障壁は、マクロファージの融合の特別なレートを推進だけでなく、意外な MGCs の形成空間制御を付与する光学的品質ガラス表面をエンジニア リングによって克服されました。
この技術は、マクロファージの融合を監視する高度なイメージング技術の使用を可能に制限なし付属していません。長鎖炭化水素(例えばオレアミド、パラフィン ワックス等)を吸着した研磨面は、マクロファージの融合融合性プラスチック表面と比較しての特別料金を生成する核融合残る空間確率プロセス (図 2)。この制限は、それは核融合が発生する個所を予測することが可能ではないので生きている標本との融合を視覚化する高倍率の目的の使用を排除します。この制限を克服するために当社所定の地域 (図 4の融合プロセスを制限するマイクロパターニングゲル パラフィン補足動画 1)。空間的拘束、微細パターンにマクロファージの融合融合が発生するだろう、そのためこの高いアニメーション イベントを研究する高倍率目標を利用を予測することができました。
マクロファージの融合の空間制御を与える光学的品質面を使用しての意義とは何ですか。まず、これらのサーフェスは、融合の率が高いを促進するので、適度な時間枠内の生きている標本からの融合を監視することが可能です。セルの光への露出増加が退色、光毒性につながるので、これは蛍光顕微鏡の場合必須です。第二に、これらの表面は、高度なイメージング技術蛍光または採用する分極に基づく (図 4を有効にします。表 1;補足動画 1補足動画 2)。最後に、このプロトコルで記述されているマイクロパターニングゲル表面によって与えられる時空間制御は、マクロファージの融合を支配する細胞および細胞内メカニズムを識別するために研究を促進しなければなりません。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
私たちはこの仕事の役に立つ議論のための代謝と血管生物学 Ugarova 研究所、センターの研究者のメンバーに感謝したいと思います。ジェームズ ・ ファウストは、2015 年に欧州分子生物学研究所超解像顕微鏡法コースでインストラクターに感謝の意を表現する願っています。Janelia で LLSM のサンプル準備のヘルプについてサティヤ Khuon に感謝したいです。レビューとこの作品の撮影の部分の間にジェームズ ・ ファウストは T32 フェローシップ (5T32DK007569-28) によって支えられました。この作品の格子光シート コンポーネントは HHMI およびベティとゴードン ・ ムーア財団によって支えられました。顧問は、NIH によって資金を供給 HL63199 を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
References
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