Summary
Este protocolo descreve a fabricação de superfícies de vidro ótico-qualidade adsorvido com compostos contendo hidrocarbonetos de cadeia longa que podem ser usados para monitorar fusão macrófago de espécimes vivos e permite a microscopia de super-resolução de espécimes fixos .
Abstract
Visualizando a formação de células gigantes multinucleadas (MGCs) de espécimes vivos tem sido um desafio devido ao fato de que mais técnicas de imagem ao vivo requerem a propagação da luz através do vidro, mas no vidro fusão macrófago é um evento raro. Este protocolo apresenta a preparação de várias superfícies de vidro de qualidade óptica onde a adsorção de compostos contendo hidrocarbonetos de cadeia longa transforma o vidro em uma superfície de fusogenic. Em primeiro lugar, a preparação de superfícies de vidro limpo como material para a modificação da superfície de partida é descrita. Em segundo lugar, um método é fornecido para a adsorção de compostos contendo hidrocarbonetos de cadeia longa para converter não-fusogenic vidro em um substrato de fusogenic. Em terceiro lugar, este protocolo descreve a fabricação de superfície micropatterns que promovem um elevado grau de controle spatiotemporal sobre formação de MGC. Finalmente, fabricar pratos de vidro inferior é descrito. Exemplos de utilização deste sistema de célula em vitro como um modelo para estudar a fusão do macrófago e MGC formação são mostrados.
Introduction
A formação de MGCs acompanha uma série de estados patológicos, no corpo humano distinto de inflamação crônica1. Apesar do acordo que mononucleadas macrófagos fundem-se para formar MGCs2, surpreendentemente poucos estudos têm mostrado a fusão em contexto com vivos espécimes3,4. Isso ocorre porque as superfícies de vidro limpo que são necessárias para a maioria das técnicas de imagem não promover fusão macrófago quando induzida por citocinas inflamatórias5. Com efeito, se limpa vidro é usado como substrato para a fusão do macrófago, então baixa a objectivos intermédios ampliação (ou seja, 10-20 X) e mais de 15 h de contínua imagens são geralmente necessário para observar um evento único de fusão.
Na outra mão, fusogenic superfícies plásticas (por exemplo, permanox) ou plástico grade bacteriológica promova fusão2. No entanto, imagens através do plástico é problemática, porque o substrato é espesso e dispersa a luz. Isso complica a imagem latente, pois há muito trabalho objectivos de distância (LWD) são necessários. No entanto, objectivos LWD geralmente têm baixa capacidade em comparação com suas contrapartes da lamela-corrigido de captura de luz. Além disso, técnicas que exploram as mudanças na polaridade da luz que passa através da amostra como contraste de interferência diferencial são impossíveis, já que o plástico é birrefringentes. As barreiras associadas ao uso do plástico são ressaltou ainda mais pelo fato de que é impossível prever onde a formação de fusão/MGC macrófago ocorrerá na superfície. Juntos, essas limitações restringem a visualização da fusão do macrófago a óptica de contraste de fase, estendido durações de imagem totais (> 15 horas contínuas) e baixa resolução.
Recentemente, nós identificamos uma superfície de vidro altamente fusogenic durante a realização de microscopia de resolução super single-molécula com macrófagos fixos/MGCs4. Esta observação foi surpreendente porque limpa vidro superfícies promovem fusão à baixíssima taxa de ~ 5% após 24 h na presença de interleucina-4 (IL-4), conforme determinado pela fusão do índice4. Descobrimos que a capacidade de promover fusão era devido à contaminação de oleamide. Adsorção de oleamide ou outros compostos que da mesma forma continham hidrocarbonetos de cadeia longa feita a fusogenic de vidro. A maioria dos compostos fusogenic (parafina) foi micropatterned, e é transmitido a um alto grau de controle spatiotemporal sobre fusão de macrófagos e um aumento de 2 vezes no número de eventos de fusão observado dentro a mesma quantidade de tempo em comparação com permanox. Estas superfícies ópticas-qualidade desde o primeiro vislumbre nas características morfológicas e cinética que regem a formação de MGCs em espécimes vivos.
Neste protocolo, descrevemos a fabricação de uma variedade de superfícies de vidro que pode ser usado para monitorar a formação de MGCs de espécimes vivos. Além disso, mostramos que essas superfícies são receptivos às técnicas de super-resolução consideravelmente-campo. Fabricação de superfície é dependente sobre o objetivo do experimento, e cada superfície é descrito com exemplos relacionados no texto processo.
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Protocol
Procedimentos que utilizam animais foram aprovados pelas comissões de utilização na clínica Mayo, Campus de pesquisa Janelia e Arizona State University e cuidado Animal.
1. preparar o ácido-limpa vidro de tampa
Nota: tampa vidro comprado de muitos fabricantes podem não ser tão limpo como esperado. Considere-se rotineiramente limpeza lotes de vidro de tampa, antes de qualquer procedimento onde microscopia está envolvida.
- Comprar vidro de tampa de elevado rigor. Tome especial cuidado para escolher a espessura correta (0,15 ou 0.17 mm).
Nota: A escolha da espessura do vidro de cobertura depende do objectivo do microscópio e está listada diretamente no tambor da objetivo. - Incube o vidro de tampa em 12 M ácido clorídrico em uma coifa química bem ventilado para 1 h com sonication (42 kHz, 70 W). Repita esta etapa para dois horários adicionais com frescos de 12 M de HCl.
- Encha um copo separado com água ultrapura e adicione o cobertura de vidro. Proceda à sonicação o vidro de tampa por 5-10 min numa vizinhança de química bem ventilada. Repita dez vezes.
- Incube o vidro de tampa em acetona pura em uma capa de química ventilada por 30 min com sonication. Repita esta etapa para mais duas vezes.
- Encha um copo separado com água ultrapura estéril e adicionar o tampa de vidro. Proceda à sonicação o vidro de tampa por 5-10 min numa vizinhança de química bem ventilada. Repita dez vezes.
- Incube o vidro de cobertura em 100% de álcool etílico em um capuz químico por 30 min com sonication. Repita mais duas vezes.
Nota: A pureza do álcool etílico é importante. Contaminantes na forma de sólidos dissolvidos vão secar no vidro e podem promover a fusão do macrófago. - Para armazenamento a longo prazo, coloca o vidro de tampa limpa de ácido em um recipiente com álcool etílico puro. Alternativamente, seque o vidro de cobertura com nitrogênio e loja num exsicador de vácuo.
2. preparação de superfícies ópticas Fusogenic qualidade
- Dissolver livre de DMSO fundição alta a ponto de cera de parafina em tolueno ultrapura.
Nota: Concentrações de estoque são feitas em 10 mg/mL e estão diluído 1:9 em tolueno ultrapura tornar um 1 mg/mL solução de trabalho.
Cuidado: Tolueno deve ser manuseado com cuidado, como um teratógeno. Descarte de tolueno, de acordo com o plano de higiene química institucional. - Aplica a parafina trabalhando a solução para um vidro de tampa de ácido-limpo seco em um volume que cobre uniformemente a superfície do vidro. Decantar a solução em excesso e seque o vidro de cobertura com nitrogênio ou ar. Para a preparação da massa, use uma jarra de Coplin projetada para acomodar o tampa de vidro.
- Polir o vidro de tampa por 3 pancadas no eixo x e em seguida por 3 pancadas no eixo y com uma limpeza de fiapos (veja a Tabela de materiais).
- Imediatamente antes que o experimento é conduzido, lave o tampa de vidro com água ultrapura esterilizada e posteriormente esterilizar por 15-30 min com luz ultravioleta em uma capa de segurança biológica. Alternativamente, esterilize o vidro de cobertura por irradiação de óxido ou gama de etileno.
3. Micropatterning hidrocarbonetos contendo compostos de confinar a fusão para predeterminado de regiões
- Seque o vidro tampa ácido-limpos e imobilizar o vidro sobre uma superfície plana.
- Com cuidado usando fórceps, mergulhe uma grade de localizador de microscopia eletrônica de transmissão ouro em uma solução de trabalho de compound(s) o hidrocarboneto. Escolher um hidrocarboneto composto que atenda o objetivo final do experimento (ver tabela 1). Pavio fora excesso solução tocando suavemente a grade no papel de filtro e imediatamente coloque a grelha no centro da tampa de vidro. Permitir que o tolueno secar por 2 min antes de prosseguir para a próxima etapa.
- Certifique-se que a grade é ligada ao vidro por inversão suavemente o vidro. Se a grade desanexa repita a etapa 3.2 usando um vidro de tampa novo.
Nota: Se não houver um plasma líquido de limpeza, omita passo 3.4. - Plasma limpar o vidro de cobertura pelo tratamento com plasma de gás vácuo.
Nota: A grade de localizador funciona como uma máscara para proteger a superfície subjacente adsorvida com hidrocarbonetos de cadeia longa do plasma. As regiões que estão desprotegidas pela rede são processadas não-fusogenic pela exposição de plasma. A quantidade de tempo que o vidro de cobertura é expor para o plasma deve ser determinada empiricamente. - Usando pinças de ponta fina, Retire cuidadosamente a grade de superfície de vidro para expor a micropattern.
4. fabricação de pratos de vidro inferior
- Faça um furo circular de 6-10 mm na parte inferior de um plástico de 35mm prato de Petri, usando uma broca de passo.
Nota: É fundamental usar uma broca de etapa para criar bordas lisas. Se as bordas são muito fortes, o vidro de cobertura não ligarão plana para o fundo do prato. Superfícies planas imperfeitamente dificultam a microscopia. - Com cuidado Misture e desgaseificar elastômero de silicone de acordo com as instruções do fabricante (ou seja, polidimetilsiloxano; PDMS).
- Aplique uma camada fina de elastômero apenas próximos à borda do (i.e., circunscrever) o buraco.
Nota: O elastômero deve aparecer como uma faixa contínua, embora fina em torno do buraco. - Aplica suavemente o vidro de tampa de fusogenic (descrito na secção 2), ou o vidro de tampa ácido-limpo seco (descrito na secção 1) para o prato para cobrir o buraco rodeado de elastômero. Certifique-se que a tampa de vidro aparece nivelado com o fundo do prato e se estende além do diâmetro do furo para que uma parte substancial do vidro está em contato com o plástico. Cure o elastômero cozendo a 50 ° C, durante 2-3h.
- Se fusogenic de vidro é o preferido, UV esterilizar as células prato e cultura de acordo com protocolos padrão. No entanto, se um micropattern é o preferido, prossiga para a etapa 3.2 para preparação de micropattern (o plasma de gás utilizado durante micropatterning Esteriliza o prato e fortemente casais PDMS para vidro).
5. recolha de macrófagos tioglicolato-suscitou
- Injete camundongos C57BL/6 de 8 semanas com 0,5 mL de uma solução estéril de tioglicolato 4% Brewer como descrito anteriormente,3,4,6.
- Eutanásia em setenta e duas horas depois, o animal de acordo com o aprovado cuidado animal use diretrizes e coletar os macrófagos pela lavagem peritoneal com gelada fosfato salino suplementado com 5 mM etilenodiaminotetracético.
- Centrifugue os macrófagos a 300 x g por 3 min e Resuspenda em 1 mL de DMEM:F12 suplementado com 15 mM HEPES, 10% FBS e 1% de antibióticos (meio de cultura).
Nota: As células são posteriormente contadas com um hemocytometer de Neubauer. Os macrófagos são diluídos na concentração adequada e aplicados sobre as superfícies. O número de células para aplicar a uma dada superfície deverão ser cuidadosamente considerado pelo investigador para efeitos a questão experimental. Consulte padrões conhecidos na literatura primária. - Após 30 min lave as superfícies com HBSS suplementado com 0,1% de BSA para remover as células não-aderentes e substituir com meio de cultura fresco. Retorno as culturas para a incubadora (5% CO2 no ar a 37 ° C).
- 2h depois, Aspire o meio e substituir com meio de cultura suplementado com 10 ng/mL de IL-4. As células conforme descrito em outra parte4da imagem.
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Representative Results
Parâmetros físico-químicos de materiais tem efeitos dramáticos sobre a extensão do macrófago fusão7,8,9,10. Além disso, contaminantes superficiais são conhecidos por promover o macrófago fusão11. Portanto, é importante começar com limpo vidro de tampa como um controle negativo para fusão de macrófagos. Quando limpo conforme descrito no protocolo 1, disse o tampa de vidro é excepcionalmente plana, com características da superfície não óbvias, Considerando que a adsorção de hidrocarbonetos de cadeia longa, seguido de polimento de superfície cria um grau de nanotopography (Figura 1).
Em superfícies de vidro limpo, os macrófagos fundem-se em uma taxa muito baixa (Figura 2). Em contraste, após 24 h na presença de IL-4, os macrófagos aplicados às superfícies adsorvidas com compostos contendo hidrocarbonetos de cadeia longa sofrem fusão robusto (Figura 2). Além disso, adsorção do solvente sozinho (por exemplo, tolueno, isopropanol) não faz vidro uma superfície de fusogenic (Figura 2).
Embora seja improvável que uma camada de 10 nm de hidrocarbonetos adsorvidos afeta drasticamente a resolução, no entanto, foi importante avaliar quantitativamente a diferença de potencial na resolução entre as várias superfícies. Resolução normalmente é definida pelo critério de Rayleigh. Uma métrica alternativa que é frequentemente usada para aproximar a resolução é a largura total no máximo meia (FWHM) de estruturas menores que o limite de difração da luz. Importante, não há nenhuma diferença aparente em FWHM de 100 contas de fluorescente nm entre as diversas superfícies (Figura 3A), sugerindo que as características do vidro necessário para geração de imagens fluorescente suficientemente foram preservadas. Além disso, fomos capazes de gerar um campo evanescente e realizar microscopia de reconstrução 3D de óptica estocástico direto de macrófagos aplicado em superfícies que contenham hidrocarbonetos de cadeia longa (Figura 3B). Uma variedade de técnicas de imagem ao vivo são viáveis quando os macrófagos são aplicados sobre as superfícies (Figura 4, suplementar 1 vídeo, 2 de vídeo suplementar).
A vantagem de cada superfície é descrita na tabela 1. Note que a maioria de técnicas de imagem avançadas que exigem altos objectivos de imersão de óleo at é incompatível com a maioria das superfícies de plástico de fusogenic desde que eles são grossos e têm um grau de autofluorescência. Note-se que as superfícies adsorvidas com hidrocarbonetos de cadeia longa permitem um grande número de técnicas de imagem incluindo12 PALM/dSTORM/GSDIM13,14,15,16, 17, DIC e outros18,19,20,21 (tabela 1). Além disso, não são apenas um grande número de técnicas de imagem possíveis (tabela 1), mas o uso de um micropattern permite um alto grau de controle spatiotemporal sobre formação de MGC (Figura 4B; Suplementar vídeo 1).
Figura 1 : Parafina adsorvida superfícies têm um grau de topografia da superfície nanoescala. Scans AFM (5 x 5 µm) de superfícies de vidro mostram não óbvias características topográficas Considerando que superfícies de parafina-adsorvido contêm matrizes de material da superfície de decoração. A escala de intensidade no lado direito de cada Micrografia mostra altura ao longo do eixo z. As barras de escala são 500 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Superfícies adsorvidas com hidrocarbonetos de cadeia longa promovem fusão de macrófagos na tampa vidro. (A) na ausência de IL-4, parece haver muito poucas células multinucleadas em superfícies de vidro limpo, conforme determinado pela mancha de Wright. (B) após 24 h na presença de IL-4, superfícies adsorvidas com solvente utilizado para solubilizar a cadeia longa de hidrocarbonetos (por exemplo, tolueno ou isopropanol) tem poucas células multinucleadas. (C–E) Em contraste, as superfícies adsorvidas com hidrocarbonetos de cadeia longa promovem fusão e formação de MGC. Resultados de adsorção de parafina no mais alto grau de IL-4 induzido por fusão. MGCs são esboçados em preto. (F) o grau de formação MGC em plástico permanox é mostrado para comparação. Em cada imagem, luz azul mostra núcleos e citoplasma aparece roxo. As barras de escala são 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Superfícies adsorvidas com hidrocarbonetos de cadeia longa não afetam drasticamente resolução. (A) comparação de 100 grânulos fluorescentes nm iluminado com microscopia Total fluorescência de reflexão interna (TIRF). O baixo-relevo no painel superior esquerdo é uma vista ampliada um único grânulo fluorescente. A linha vermelha foi sobreposta para mostrar um perfil de linha de exemplo para calcular FWHM. Não observou-se nenhuma diferença aparente em FWHM de 100 contas nm. As barras de escala são 5 µm. (B) comparação da distribuição de integrina Mac-1 avaliada pelo TIRF e microscopia de reconstrução 3D de óptica estocástico direto. Macrófagos foram aplicados a uma superfície contendo oleamide e incubados com IL-4 durante 24 h. O baixo-relevo branco em B destaca a região fotografada em micrografias subsequentes. As barras de escala são 5 µm para as imagens TIRF e 2 µm para 3D STORM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Superfícies adsorvidas com hidrocarbonetos de cadeia longa permitem tempo-resolvido vistas da fusão do macrófago e espalhar-se. (A) o diagrama mostra o procedimento usado para gerar um micropattern. (B) Micropatterned superfícies transmitir spatiotemporal controle da fusão de macrófagos. Várias horas após a aplicação de IL-4, os macrófagos foram fotografados com contraste de fase. Observe a migração das células do interior da grade para o micropattern. Fusão foi observado somente no micropattern. Os traços brancos delinear a expansão de um MGC. Tempo é mostrado no canto superior esquerdo de cada lâmina histológica como hh. As barras de escala são 50 µm. (C) retículo luz folha microscopia20 revela alta spatiotemporal dinâmica de um macrófago espalhar sobre uma superfície de parafina-adsorvido. Cor codifica a distribuição de intensidade (amarelo é mais intenso) de eGFP-LifeAct. Tempo é mostrado no canto superior direito de cada lâmina histológica como mm:ss. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Superfície: | ||||||
| Técnica | Parafina | Oleamide | Petrolato | Parafina de MP | Permanox | Limpo vidro |
| contraste de fase | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| brightfield | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| DIC | √ | √ | N/T | √ | x | √ |
| epifluorescência | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| confocal | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| TIRF | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| PALM/dSTORM/GSDIM | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| SIM | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T |
| STED | N/T | √ | N/T | N/T | N/T | √ |
| LLSM | √ | N/T | N/T | √ | N/T | √ |
| Índice de fusão | intermediário | intermediário | intermediário | alta | intermediário | baixa |
| Localização de fusão | aleatórios | aleatórios | aleatórios | definido | aleatórios | aleatórios |
| MP-micropattern | ||||||
| DIC - contraste de interferência diferencial | ||||||
| TIRF - fluorescência de reflexão interna total | ||||||
| PALM - microscopia de localização fotoativo | ||||||
| dSTORM - microscopia direta reconstrução óptica estocástica | ||||||
| GSDIM - estado fundamental esgotamento seguido por molécula individual retornar | ||||||
| SIM - iluminação estruturada | ||||||
| STED - depleção de emissão estimulada | ||||||
| LLSM - microscopia de luz folha de treliça | ||||||
| √ - compatível | ||||||
| x - incompatível | ||||||
| √ * - possível somente com o LWD, baixa ampliação ou objectivos de imersão | ||||||
| N/T - não testado | ||||||
Tabela 1: potencial usa de cada superfície. Note-se que as superfícies de plástico impedem o uso de técnicas de imagem mais.
1 de vídeo suplementar: exibição de contraste de fase tempo-resolvido de formação MGC. Observe a aparente sincronicidade da formação MGC. Tempo é mostrado no hh no canto superior esquerdo. Barra de escala é 50 µm. por favor clique aqui para baixar este vídeo.
2 de vídeo suplementar: microscopia Lattice luz folha 20 de um macrófago tioglicolato-suscitou eGFP-LifeAct espalhar sobre uma superfície de parafina adsorvida. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
A necessidade de identificar e desenvolver posteriormente as superfícies de vidro ótico-qualidade que promovem a fusão do macrófago resultou do fato de que até recentemente não publicado estudo diretamente visualizado fusão macrófago no contexto de vida espécimes3, 4. Isto é devido ao fato de que fusogenic as superfícies plásticas que são comumente usadas exigem objectivos LWD e são em grande parte limitadas a óptica de contraste de fase. Estas barreiras foram superadas por uma superfície de vidro ótico-qualidade que não só promoveu extraordinárias taxas de fusão do macrófago, transmitidos a um grau surpreendente de controle espacial sobre a formação de MGCs de engenharia.
Embora esta tecnologia permite o uso de técnicas de imagem avançadas para monitorar fusão de macrófagos, não vem sem limitação. Embora as superfícies polidas adsorvidas com hidrocarbonetos de cadeia longa (por exemplo, oleamide, parafina, etc.) produzem extraordinárias taxas de fusão de macrófagos, em comparação com as superfícies plásticas fusogenic, fusão permanece um espacialmente estocástica processo (Figura 2). Esta limitação impede o uso de objetivos de alta ampliação para visualizar fusão com espécimes vivos, uma vez que é impossível prever onde a fusão ocorrerá. Para superar esta limitação, nós micropatterned parafina para confinar o processo de fusão de regiões predeterminadas (Figura 4; Suplementar vídeo 1). Espacialmente, confinar fusão de macrófagos para o micropattern permitiu-nos prever onde fusão iria ocorrer e, portanto, utilizar mais elevados objetivos de ampliação para estudar este evento altamente animar.
Qual é a importância do uso de uma superfície de qualidade ótica que transmite o controle espacial da fusão do macrófago? Em primeiro lugar, desde que estas superfícies promovem altas taxas de fusão, é possível monitorar fusão de espécimes vivos dentro de um prazo razoável. Isto é essencial no caso da microscopia de fluorescência, desde que o aumento da exposição das células à luz conduz ao fotobranqueamento e fototoxicidade. Segundo, estas superfícies ativar avançadas técnicas de imagem baseadas na fluorescência ou polarização para ser empregado (Figura 4; Tabela 1; Vídeo suplementar 1; Vídeo complementar 2). Finalmente, o controle spatiotemporal proporcionado pelas superfícies de micropatterned descrito neste protocolo deve acelerar estudos projetados para identificar os mecanismos celulares e subcelulares que governam a fusão do macrófago.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer os membros do laboratório de Ugarova e investigadores no centro para Biologia Vascular e metabólica para discussão útil deste trabalho. James Faust deseja expressar sua gratidão aos instrutores no curso de laboratório de Biologia Molecular Europeu Super resolução microscopia em 2015. Desejamos agradecer Satya Khuon no Janelia ajuda com preparação da amostra para LLSM. Durante a revisão e a filmagens porções deste trabalho James Faust foi apoiado por uma bolsa T32 (5T32DK007569-28). O componente de folha de luz da estrutura deste trabalho foi apoiado pelo HHMI e Betty e Gordon Moore Foundation. T.U. é financiado pelo NIH conceder HL63199.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
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