Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von hochwertigem optischen Glasoberflächen adsorbiert mit Verbindungen, die langkettigen Kohlenwasserstoffe, die können verwendet werden, um Makrophagen Verschmelzung von lebenden Exemplaren zu überwachen und ermöglicht Super-Resolution-Mikroskopie von festen Proben .
Abstract
Die Bildung von mehrkernigen Riesenzellen (MGCs) von lebenden Exemplaren zu visualisieren ist eine Herausforderung gewesen, die meisten live bildgebende Verfahren Ausbreitung von Licht durch das Glas erfordern, aber auf Glas Makrophagen Fusion ein seltenes Ereignis ist. Dieses Protokoll stellt die Herstellung von mehreren optischen Qualität Glasflächen wo Adsorption von Verbindungen, die langkettigen Kohlenwasserstoffe Glas verwandelt sich in eine Fusogenic Oberfläche. Vorbereitung der saubere Glasflächen als Ausgangsmaterial für Oberflächenmodifizierung ist erstbeschrieben. Zweitens ist eine Methode für die Adsorption von Verbindungen, die langkettigen Kohlenwasserstoffe zur Umwandlung von nicht-Fusogenic Glas in ein Fusogenic Substrat zur Verfügung gestellt. Drittens beschreibt dieses Protokoll Herstellung der Oberfläche Micropatterns, die ein hohes Maß an räumlich-zeitliche Kontrolle über MGC Bildung zu fördern. Schließlich wird die Herstellung Glasschalen unten beschrieben. Beispiele für die Verwendung dieses Systems in-vitro- Zelle als ein Modell zur Fusion von Makrophagen und MGC Bildung werden angezeigt.
Introduction
Die Bildung von MGCs begleitet eine Reihe von pathologischen Zuständen in den menschlichen Körper durch die chronische Entzündung1. Trotz Einigung, die Mononucleated Makrophagen zu bilden MGCs2vereinen, erstaunlich wenige Studien Fusion in Zusammenhang mit lebenden Exemplaren3,4. Und zwar deshalb, weil saubere Glasflächen, die für die meisten bildgebenden Verfahren nicht Makrophagen Fusion, wenn durch inflammatorische Zytokine5fördern. In der Tat, wenn sauberes Glas als Trägermaterial für Makrophagen Fusion, dann niedrige mittlere Vergrößerung Ziele (z.B. 10-20 X) und mehr als 15 h Dauerbetrieb verwendet wird Bildgebung müssen häufig eine einzelne Fusion Ereignis beobachten.
Auf der anderen Hand, Fusogenic Kunststoff-Oberflächen (z.B. Permanox) oder bakteriologische Qualität Kunststoff fördern Sie Fusion2. Bildgebung durch Kunststoff ist jedoch problematisch, da das Substrat dick ist und streut das Licht. Dies erschwert, imaging, da lange arbeiten Abstand (LWD) Ziele erforderlich sind. LWD-Ziele haben jedoch in der Regel geringe Lichtstärke Kapazität im Vergleich zu ihrem Pendant Deckglas korrigiert. Darüber hinaus sind Techniken, die ausgenutzt werden Änderungen in der Polarität von Licht durch die Probe z. B. differential Interferenz Kontrast unmöglich, da Kunststoff doppelbrechenden ist. Die Barrieren, die verbunden sind mit der Verwendung von Kunststoff sind weiter durch die Tatsache unterstrichen, die es ist unmöglich vorherzusagen, wo die Makrophagen Fusion/MGC Bildung auf der Oberfläche entstehen wird. Zusammen, diese Einschränkungen schränken die Visualisierung von Makrophagen Fusion zur Phase Kontrast Optik, total imaging Dauer verlängert (> 15 Stunden ununterbrochen), und niedriger Auflösung.
Wir identifizierten vor kurzem eine höchst Fusogenic Glasoberfläche während der Durchführung Einzelmolekül-Superresolution Mikroskopie mit Fixed Makrophagen/MGCs4. Diese Beobachtung war überraschend, weil sauberes Glas Oberflächen fördern Fusion mit einer sehr niedrigen Rate von ~ 5 % nach 24 h in Anwesenheit von Interleukin-4 (IL-4) durch die Fusion index4. Wir fanden, dass die Fähigkeit zur Verschmelzung zu fördern durch Oleamide Verschmutzung. Adsorption von Oleamide oder anderen Verbindungen, die ähnlich wie langkettige Kohlenwasserstoffe enthalten gemacht das Glas Fusogenic. Die meisten Fusogenic zusammengesetzten (Paraffinwachs) war Micropatterned, und es vermittelt ein hohes Maß an räumlich-zeitliche Kontrolle über Makrophagen Fusion und eine 2-fache Erhöhung der Zahl der Fusion-Ereignisse, die innerhalb der gleichen Zeitspanne im Vergleich zu Permanox beobachtet. Diese optische Qualität Flächen versehen den ersten Blick in die morphologischen Merkmale und Kinetik, die die Bildung von MGCs in lebende Exemplare zu Regeln.
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Vielzahl von Glasflächen, die verwendet werden können, um die Bildung von MGCs von lebenden Exemplaren zu überwachen. Darüber hinaus zeigen wir, dass diese Flächen Fernfeld Höchstauflösung Techniken zugänglich sind. Oberfläche Fertigung ist das Ziel des Experiments abhängig, und jede Fläche wird mit entsprechenden Beispielen im Text Verfahren beschrieben.
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Protocol
Verfahren, die Tiere nutzen stimmten die Animal Care und Nutzung Gremien auf Mayo Clinic, Janelia Research Campus und Arizona State University.
1. Vorbereitung Deckglas Säure gereinigt
Hinweis: Deckglas gekauft von vielen Herstellern so sauber wie erwartet möglicherweise nicht. Betrachten Sie routinemäßig Reinigung Chargen von Deckglas vor jedem Eingriff wo Mikroskopie beteiligt ist.
- Kaufen Sie hohe Stringenz Deckglas. Achten Sie besonders auf die richtige Dicke (0,15 oder 0,17 mm) wählen.
Hinweis: Die Wahl der Abdeckung Glasstärke richtet sich nach dem Mikroskopobjektiv und direkt auf den objektiven Lauf aufgeführt ist. - Das Deckglas in 12 M Salzsäure in einem gut belüfteten chemische Abzug für 1 h mit Beschallung (42 kHz, 70 W) inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt für zwei weitere Male mit frisch 12 M HCl.
- Füllen Sie einen separaten Becher mit Reinstwasser und fügen Sie das Deckglas. Beschallen Sie das Deckglas für 5-10 min in einem gut belüfteten chemische Haube. Wiederholen Sie diesen Schritt zehnmal.
- Inkubieren Sie das Deckglas in Aceton in einer gut belüfteten chemische Haube für 30 min mit Beschallung. Wiederholen Sie diesen Schritt für zwei weitere Male.
- Füllen Sie einen separaten Becher mit sterilen Reinstwasser und fügen Sie das Deckglas. Beschallen Sie das Deckglas für 5-10 min in einem gut belüfteten chemische Haube. Wiederholen Sie diesen Schritt zehnmal.
- Inkubieren Sie das Deckglas in 100 % Ethylalkohol in eine chemische Haube für 30 min mit Beschallung. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male.
Hinweis: Die Reinheit der Ethylalkohol ist wichtig. Verunreinigungen in Form von gelösten Stoffen werden auf dem Glas trocken und Makrophagen Fusion fördern können. - Legen Sie für die langfristige Lagerung das Deckglas Säure gereinigt in einen Behälter gefüllt mit reinen Äthylalkohol. Alternativ, trocknen Sie das Deckglas mit Stickstoffgas und Shop in einem Vakuum Exsikkator.
2. Vorbereitung des Fusogenic optisch hochwertige Oberflächen
- Auflösen, DMSO-freie hochschmelzenden Punkt Paraffinwachs in hochreinen Toluol.
Hinweis: Lager Konzentrationen bestehen bei 10 mg/mL, und verdünnt 1:9 in hochreinen Toluol zu 1 mg/mL Lösung sind.
Achtung: Toluol sollte als Teratogen pfleglich behandelt werden. Toluol nach institutionellen chemische Hygieneplan entsorgen. - Wenden Sie das Paraffin arbeiten Lösung für eine trockene Säure gereinigt Deckglas auf ein Volume, das die Glasoberfläche gleichmäßig deckt. Dekantieren Sie überschüssige Lösung und trocknen Sie das Deckglas mit Stickstoffgas oder Luft zu. Vorbereitung der Masse verwenden Sie Kanope Coplin entworfen, um das Deckglas unterzubringen.
- Das Deckglas mit 3 Schlägen in der x-Achse und anschließend mit 3 Schlägen in der y-Achse mit einem fusselfreien Tuch zu polieren (siehe Tabelle der Materialien).
- Unmittelbar vor das Experiment durchgeführt, das Deckglas mit sterilen Reinstwasser waschen und anschließend sterilisieren für 15-30 min mit UV-Licht in eine biologische Schutzhaube. Sterilisieren Sie alternativ Glasabdeckung durch Ethylen Oxid oder Gamma-Bestrahlung.
3. Micropatterning Kohlenwasserstoff-Verbindungen beschränken, Fusion, vorgegebenen Regionen
- Trocknen Sie das Deckglas Säure gereinigt und immobilisieren Sie das Glas auf eine Ebene Fläche zu.
- Tauchen Sie mit Pinzette, sorgfältig ein gold Elektronenmikroskopie Finder Übertragungsnetz in eine funktionierende Lösung von Kohlenwasserstoff-widerrufen. Wählen Sie einen Kohlenwasserstoff-Verbindung, die das eigentliche Ziel des Experiments entspricht (siehe Tabelle 1). Docht entfernt überschüssige Lösung durch leichtes Klopfen das Raster auf Filterpapier, und sofort das Gitter in der Mitte der Glasabdeckung. Können Sie Toluol zum Trocknen für 2 min bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Stellen Sie sicher, dass das Gitter auf dem Glas verklebt ist, durch das Glas vorsichtig umdrehen. Wenn das Raster wiederholen Sie Schritt 3.2 mit einem neuen Deckglas löst.
Hinweis: Wenn ein Plasma Reiniger nicht verfügbar ist, überspringen Sie Schritt 3.4. - Plasma reinigen das Deckglas durch Behandlung mit Vakuum Gasplasma.
Hinweis: Der Finder-Raster dient als Maske, die zugrunde liegende Oberfläche adsorbiert mit langkettigen Kohlenwasserstoffen aus dem Plasma zu schützen. Die Regionen, die durch das Gitter geschützt sind werden nicht Fusogenic durch die Einwirkung von Plasma gerendert. Die Höhe der Zeit ist das Deckglas Expose Plasma sollte empirisch bestimmt werden. - Entfernen Sie mit feinen Spitze Pinzette, vorsichtig das Gitter von der Glasoberfläche, die Micropattern verfügbar zu machen.
4. Herstellung von unten Glasschalen
- Bohren Sie ein 6-10 mm kreisrundes Loch in den Boden von einem 35-mm-Kunststoff Petrischale mit einem Schritt-Bohrer.
Hinweis: Es ist wichtig, einen Schritt Bohrer mit glatte Kanten erstellt. Wenn Kanten zu rau sind, wird das Deckglas nicht flach auf den Boden der Schale kleben. Unvollkommen Planflächen erschweren die Mikroskopie. - Vorsichtig mischen Sie und entgasen Sie Silikon-Elastomer gemäß den Anweisungen des Herstellers (z.B. Polydimethylsiloxan; PDMS).
- Wenden Sie eine dünne Schicht des Elastomer nur unmittelbar an den Rand des (d. h.Indefinitpronomen) das Loch.
Hinweis: Das Elastomer sollte als eine ständige, wenn auch dünne Band rund um das Loch angezeigt werden. - Sanft Auftragen der Fusogenic Deckglas (beschrieben in Abschnitt 2) oder die trockene Säure gereinigt Deckglas (beschrieben in Abschnitt 1) in die Schale um das Loch, umgeben von Elastomer zu decken. Stellen Sie sicher, dass das Deckglas bündig mit dem Boden der Schale wird und der Durchmesser des Lochs hinausgeht, so dass ein wesentlicher Teil des Glases in Kontakt mit dem Kunststoff. Das Elastomer durch Backen bei 50 ° C für ca. 2-3 Stunden zu heilen.
- Wenn Fusogenic Glas bevorzugt wird, UV sterilisieren die Schüssel und Kultur Zellen nach standard-Protokolle. Jedoch, wenn ein Micropattern bevorzugt wird, fahren Sie mit Schritt 3.2 Vorbereitung Micropattern (das Gasplasma verwendet, während Micropatterning das Gericht sterilisiert und stark Paare PDMS auf Glas).
5. sammeln Thioglykollat entlockte Makrophagen
- Injizieren Sie 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen mit 0,5 mL einer sterilen Lösung von 4 % Brewer Thioglykollat wie zuvor beschrieben3,4,6.
- Einschläfern Sie zweiundsiebzig Stunden später des Tieres entsprechend zugelassenen Tierpflege und Richtlinien Sie, und sammeln Sie Makrophagen durch peritoneal Lavage mit eiskalten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 5 mM Ethylenediaminetetraacetate ergänzt.
- Die Makrophagen bei 300 X g für 3 min Zentrifugieren und in 1 mL DMEM:F12 mit 15 mM HEPES, ergänzt Aufschwemmen 10 % FBS und 1 % Antibiotika (Kulturmedium).
Hinweis: Die Zellen werden anschließend mit einem Neubauer Hemocytometer gezählt. Makrophagen sind auf die entsprechende Konzentration verdünnt und auf die Oberflächen angewendet. Die Anzahl der Zellen auf einer vorgegebenen Fläche anwenden sollte durch den Prüfarzt für die Zwecke der experimentellen Frage sorgfältig abgewogen werden. Wenden Sie sich an bekannten Standards in der Primärliteratur. - Waschen Sie nach 30 min die Oberflächen mit HBSS ergänzt mit 0,1 % BSA-anhaftende Zellen zu entfernen und ersetzen mit frischem Nährmedium. Die Kulturen in den Inkubator (5 % CO2 in der Luft bei 37 ° C) zurück.
- 2 h später, aspirieren Sie das Medium und ersetzen mit Kulturmedium mit 10 ng/mL IL-4 ergänzt. Bild der Zellen wie4an anderer Stelle beschrieben.
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Representative Results
Physikalisch-chemischen Parameter der Materialien haben dramatische Auswirkungen auf das Ausmaß der Makrophagen Fusion7,8,9,10. Darüber hinaus sind Oberflächenverunreinigungen bekannt, Makrophagen Fusion11zu fördern. Daher ist es wichtig zu sauberen Deckglas als Negativkontrolle für Makrophagen Fusion. Beim Reinigen, wie im Protokoll Nr. 1 beschrieben, ist das Deckglas außergewöhnlich flach mit keine offensichtlichen Oberflächenmerkmalen während Adsorption von langkettigen Kohlenwasserstoffen gefolgt von Oberflächen Polieren eine gewisse Nanotopography (Abbildung 1 schafft).
Auf saubere Abdeckung Glasflächen verschmelzen Makrophagen zu einem sehr niedrigen Zinssatz (Abbildung 2). Im Gegensatz dazu unterliegen nach 24 h in Anwesenheit von IL-4, die Makrophagen auf Oberflächen mit Verbindungen, die langkettigen Kohlenwasserstoffen adsorbiert angewendet robuste Fusion (Abbildung 2). Darüber hinaus macht Adsorption von Lösungsmittel allein(z. B.Toluol, Isopropanol) nicht Glas eine Fusogenic Oberfläche (Abbildung 2).
Obwohl es unwahrscheinlich ist, dass eine 10-nm-Schicht adsorbierten Kohlenwasserstoffe dramatisch Auflösung betrifft, war es dennoch wichtig, die möglichen Unterschied in der Auflösung unter den verschiedenen Oberflächen quantitativ zu bewerten. Auflösung wird in der Regel durch das Rayleigh-Kriterium definiert. Eine alternative Metrik, die oft verwendet wird, um die ungefähre Auflösung ist volle Breite am halben Maximum (FWHM) von Strukturen, die kleiner als die Beugungsgrenze des Lichts. Wichtig ist, gibt es keine offensichtlichen Unterschiede in FWHM von 100 nm fluoreszierenden Perlen unter den verschiedenen Oberflächen (Abbildung 3A), was darauf hindeutet, dass die Eigenschaften des Glases für Fluoreszenz-Bildgebung erforderlich ausreichend konserviert wurden. Darüber hinaus konnten wir eine evaneszenten Feldes zu erzeugen und führen Sie direkte stochastische optische 3D-Rekonstruktion Mikroskopie von den Makrophagen auf Oberflächen mit langkettigen Kohlenwasserstoffe (Abb. 3 b) angewendet. Eine Vielzahl von live-bildgebende Verfahren sind machbar, wenn Makrophagen an den Oberflächen (Abbildung 4, ergänzende Video 1, ergänzende Video 2) angewendet werden.
Der Vorteil der jede Oberfläche ist in Tabelle 1beschrieben. Beachten Sie, dass die Mehrheit der Moderne bildgebende Verfahren, die hohe NA Öl eintauchen Ziele erfordern nicht kompatibel mit den meisten Fusogenic Kunststoff-Oberflächen, sind da sie dick sind und ein Maß an Autofluoreszenz haben. Es sei darauf hingewiesen, dass Flächen mit langkettigen Kohlenwasserstoffen adsorbiert ermöglichen eine große Anzahl von bildgebenden Verfahren einschließlich12 PALM/dSTORM/GSDIM13,14,15,16, 17, DIC, und andere18,19,20,21 (Tabelle 1). Darüber hinaus nicht nur eine große Anzahl von bildgebenden Verfahren möglich (Tabelle 1), sondern die Verwendung von eine Micropattern ermöglicht ein hohes Maß an räumlich-zeitliche Kontrolle über MGC Bildung (Abbildung 4 b; Zusätzliche Video 1).
Abbildung 1 : Paraffin adsorbiert Oberflächen haben ein Maß von nanoskaligen Oberflächentopographie. AFM-Scans (5 x 5 µm) von Glasflächen zeigen keine offensichtlichen topographische Merkmale, während Paraffin adsorbiert Oberflächen Arrays von Material, Verzierung der Oberfläche enthalten. Die Intensitätsskala auf der rechten Seite jeder Schliffbild zeigt Höhe entlang der z-Achse. Der Maßstabsbalken sind 500 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Oberflächen mit langkettigen Kohlenwasserstoffen adsorbiert Förderung Makrophagen Fusion auf Abdeckglas. (A) In Ermangelung von IL-4, scheint es sehr wenige mehrkernigen Zellen auf saubere Glasflächen wie von Wrights Fleck bestimmt. (B) nach 24 h in Gegenwart von IL-4, Oberflächen adsorbiert mit Lösungsmittel verwendet, um anderweitig langkettigen Kohlenwasserstoffe (z.B., Toluol oder Isopropanol) haben einige mehrkernigen Zellen. (C–E) Im Gegensatz dazu fördern Oberflächen mit langkettigen Kohlenwasserstoffen adsorbiert, Fusion und MGC Bildung. Paraffin-Adsorption-Ergebnisse in den höchsten Grad an IL-4 induziert Fusion. MGCs sind schwarz umrandet. (F) ist der Grad der MGC Bildung auf Permanox Kunststoff zum Vergleich angezeigt. Jedes einzelne Bild hellblau zeigt Kerne und Zytoplasma erscheint lila. Der Maßstabsbalken sind 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Oberflächen mit langkettigen Kohlenwasserstoffen adsorbiert wirken sich nicht dramatisch Auflösung. (A) Vergleich von 100 nm fluoreszierenden Perlen mit insgesamt interne Reflexion Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie beleuchtet. Der Einschub in der oberen linken ist eine vergrößerte Darstellung eine einzelne fluoreszierende Perle. Die rote Linie wurde überlagert, um ein Beispielprofil Linie zur Berechnung des FWHM zeigen. Keine offensichtlichen Unterschiede in FWHM von 100 nm Perlen wurde beobachtet. Der Maßstabsbalken sind 5 µm. (B) Vergleich der Verteilung der Mac-1 Integrin wie TIRF und direkte stochastische optische 3D-Rekonstruktion Mikroskopie bewertet. Makrophagen waren auf eine Oleamide-haltigen Oberfläche aufgebracht und mit IL-4 für 24 h inkubiert. Der weißen Inset in B highlights die Region in nachfolgenden Mikrographen abgebildet. Der Maßstabsbalken sind 5 µm für die TIRF Bilder und 2 µm für 3D Sturm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Oberflächen mit langkettigen Kohlenwasserstoffen adsorbiert ermöglichen zeitaufgelösten Ansichten von Makrophagen Fusion und verbreiten. (A) das Diagramm zeigt das Verfahren verwendet, um eine Micropattern zu generieren. (B) Micropatterned Oberflächen vermitteln räumlich-zeitliche Steuerung von Makrophagen Fusion. Mehrere Stunden nach der Applikation von IL-4, wurden die Makrophagen mit Phasenkontrast abgebildet. Beachten Sie die Wanderung von Zellen aus dem Inneren des Gitters auf die Micropattern. Fusion wurde nur auf die Micropattern beobachtet. Die weißen Striche skizzieren die Erweiterung ein MGC. Zeit ist in der oberen linken Ecke jedes Schliffbild als HH angezeigt. Der Maßstabsbalken sind 50 µm (C) Gitter Licht Blatt Mikroskopie20 zeigt hohe raumzeitliche Dynamik der eine Verbreitung auf einer Oberfläche adsorbiert Paraffin Makrophagen. Farbe kodiert die Intensitätsverteilung (gelb ist am intensivsten) von eGFP-LifeAct. Zeit zeigt sich in der oberen rechten Ecke jeder Schliffbild als Mm:ss. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
| Oberfläche: | ||||||
| Technik | Paraffin | Oleamide | Vaseline | MP-paraffin | Permanox | Sauberes Glas |
| Phasenkontrast | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| Hellfeld | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| DIC | √ | √ | N/T | √ | x | √ |
| Epifluoreszenz | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| konfokale | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| TIRF | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| PALM/dSTORM/GSDIM | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| SIM-KARTE | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T |
| STED | N/T | √ | N/T | N/T | N/T | √ |
| LLSM | √ | N/T | N/T | √ | N/T | √ |
| Fusion-Index | Mittelstufe | Mittelstufe | Mittelstufe | hoch | Mittelstufe | niedrige |
| Fusion-Lage | zufällige | zufällige | zufällige | definiert | zufällige | zufällige |
| MP-micropattern | ||||||
| DIC - differential Interferenz-Kontrast | ||||||
| TIRF - Totalreflexion Fluoreszenz | ||||||
| PALM - photoaktiviert Lokalisierung Mikroskopie | ||||||
| dSTORM - direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie | ||||||
| GSDIM - Grundzustand Erschöpfung gefolgt von einzelnen Molekül zurück | ||||||
| SIM - strukturierte Beleuchtung | ||||||
| STED - stimulierte Emission depletion | ||||||
| LLSM - Gitter Lichtblattmikroskopie | ||||||
| √ - kompatibel | ||||||
| X - nicht kompatibel | ||||||
| √ * - nur mit LWD, geringer Vergrößerung oder Eintauchen Ziele möglich | ||||||
| N/T - nicht getestet | ||||||
Tabelle 1: Einsatzmöglichkeiten von jeder Oberfläche. Beachten Sie, dass die Kunststoff-Oberflächen die Verwendung von den meisten bildgebenden Verfahren ausschließen.
Ergänzende Video 1: zeitaufgelöste Phase Kontrast Ansicht der MGC Formation. Beachten Sie die scheinbare Synchronität der MGC Bildung. Zeit wird in HH in der oberen linken Ecke angezeigt. Der Maßstab ist 50 µm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.
Ergänzende Video 2: Gitter Licht Blatt Mikroskopie 20 von einer Thioglykollat entlockte eGFP-LifeAct Makrophagen Verbreitung auf einer Paraffin adsorbierten Oberfläche. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.
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Discussion
Die Notwendigkeit zu identifizieren und anschließend entwickeln optische Qualität Glasflächen, die Makrophagen Fusion fördern ergab sich aus der Tatsache, die bis vor kurzem nicht veröffentlichte Studie direkt Makrophagen Fusion im Rahmen des Wohnens visualisiert Proben3, 4. Dies ist dass Fusogenic Kunststoff-Oberflächen, die häufig verwendet werden, LWD Ziele erfordern und beschränken sich weitgehend auf Phase Kontrast-Optik. Diese Hindernisse wurden durch eine optische Qualität Glasoberfläche, die nicht nur außergewöhnliche Preise von Makrophagen Fusion gefördert, sondern ein überraschendes Maß an räumliche Kontrolle über die Bildung von MGCs vermittelt engineering.
Obwohl diese Technologie die Verwendung von fortgeschrittenen Bildgebungsverfahren ermöglicht, Makrophagen Fusion zu überwachen, kommt es nicht ohne Einschränkung. Obwohl die polierten Oberflächen adsorbiert mit langkettigen Kohlenwasserstoffen (z.B., Oleamide, Paraffinwachs, etc.) außergewöhnliche Preise von Makrophagen Fusion im Vergleich zu Fusogenic Kunststoffoberflächen produzieren, bleibt die Fusion eine räumlich stochastische Prozess (Abbildung 2). Diese Einschränkung schließt die Verwendung der hohen Vergrößerung Ziele visualisieren Fusion mit lebenden Exemplaren, denn es ist unmöglich vorherzusagen, wo Fusion kommen wird. Um diese Beschränkung zu überwinden wir Micropatterned Paraffin zu beschränken, den Fusionsprozess zu vorgegebenen Regionen (Abbildung 4; Zusätzliche Video 1). Räumlich beschränkt Makrophagen Fusion der Micropattern konnten wir vorhersagen, wo Fusion auftreten würden und daher nutzen höherer Vergrößerung Ziele um dieses höchst lebendigen Ereignis zu studieren.
Was ist die Bedeutung der Verwendung einer optische Qualität-Oberfläche, die räumliche Kontrolle von Makrophagen Fusion vermittelt? Zuerst, da diese Oberflächen hohe Raten von Fusion fördern, ist es möglich, Fusion von lebenden Exemplaren innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens zu überwachen. Dies ist wichtig bei Fluoreszenz-Mikroskopie, da erhöhte Lichteinwirkung von Zellen zu Immunofluoreszenz und Phototoxizität führt. Zweitens ermöglichen diese Oberflächen erweiterte bildgebende Verfahren anhand der Fluoreszenz oder Polarisation eingesetzt werden (Abbildung 4; Tabelle 1; Zusätzliche Video 1; Zusätzliche Video 2). Zu guter Letzt sollte die räumlich-zeitliche Steuerung gewährten die Micropatterned Oberflächen, die in diesem Protokoll beschriebenen Studien entwickelt, um die zellulären und subzellulären Mechanismen zu identifizieren, die Makrophagen Fusion regieren vorantreiben.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir möchte Mitglieder der Ugarova Labor und Ermittler in der Mitte für Stoffwechsel- und vaskuläre Biologie für hilfreiche Diskussion dieser Arbeit danken. James Faust möchte seine Dankbarkeit für die Ausbilder an der European Molecular Biology Laboratory Super Auflösung Mikroskopie-Kurs im Jahr 2015 zum Ausdruck zu bringen. Wir wünschen Satya Khuon am Janelia Danke für Hilfe bei der Probenvorbereitung für die LLSM. Während der Überprüfung und Dreharbeiten Teile dieses Werkes wurde James Faust durch ein T32 Fellowship (5T32DK007569-28) unterstützt. Die Gitter Licht Blatt Komponente dieses Werkes wurde von HHMI und Betty und Gordon Moore Foundation unterstützt. NIH finanziert T.U HL63199 zu gewähren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
References
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