Summary
इस प्रोटोकॉल के निर्माण का वर्णन करता है ऑप्टिकल गुणवत्ता कांच यौगिकों जिसमें रहने वाले नमूनों की मैक्रोफेज संलयन पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और निश्चित नमूनों की सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए सक्षम बनाता है युक्त लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन के साथ adsorbed सतहों .
Abstract
नमूनों रहने से multinucleated विशाल कोशिकाओं (MGCs) के गठन visualizing तथ्य यह है कि ज्यादातर लाइव इमेजिंग तकनीक कांच के माध्यम से प्रकाश के प्रसार की आवश्यकता के कारण चुनौतीपूर्ण है, लेकिन कांच मैक्रोफेज फ्यूजन पर एक दुर्लभ घटना है । इस प्रोटोकॉल कई ऑप्टिकल गुणवत्ता कांच सतहों का निर्माण प्रस्तुत करता है, जहां लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन युक्त यौगिकों के सोखना एक fusogenic सतह में कांच बदल जाता है । पहले, सतह संशोधन के लिए शुरू सामग्री के रूप में साफ गिलास सतहों की तैयारी वर्णित है । दूसरा, एक विधि एक fusogenic सब्सट्रेट में गैर fusogenic ग्लास परिवर्तित करने के लिए लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन युक्त यौगिकों के सोखना के लिए प्रदान की जाती है । तीसरा, इस प्रोटोकॉल सतह micropatterns कि MGC गठन पर spatiotemporal नियंत्रण के एक उच्च डिग्री को बढ़ावा देने के निर्माण का वर्णन है । अंत में, कांच के नीचे व्यंजन बनाना वर्णन किया गया है । मैक्रोफेज फ्यूजन और MGC गठन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में इन विट्रो सेल प्रणाली के उपयोग के उदाहरण दिखाए जाते हैं ।
Introduction
MGCs के गठन जीर्ण सूजन1द्वारा प्रतिष्ठित मानव शरीर में रोग राज्यों की एक संख्या के साथ जुडा हुआ है । समझौते के बावजूद कि mononucleated मैक्रोफेज फ्यूज MGCs2फार्म, आश्चर्यजनक रूप से कुछ अध्ययनों के संदर्भ में फ्यूजन रहने वाले नमूनों के साथ दिखाया गया है3,4. यह इसलिए है क्योंकि स्वच्छ कांच सतहों कि सबसे इमेजिंग तकनीकों के लिए आवश्यक है मैक्रोफेज फ्यूजन को बढ़ावा देने जब भड़काऊ साइटोकिंस द्वारा प्रेरित नहीं है5। वास्तव में, यदि स्वच्छ कांच मैक्रोफेज संलयन के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में प्रयोग किया जाता है, तो कम से मध्यम आवर्धन उद्देश्यों (यानी, 10-20X) और निरंतर इमेजिंग के 15 से अधिक एच अक्सर एक एकल संलयन घटना का पालन करने की आवश्यकता है ।
दूसरी ओर, fusogenic प्लास्टिक सतहों (जैसे, permanox) या जीवाणु ग्रेड प्लास्टिक को बढ़ावा देने के फ्यूजन2। हालांकि, प्लास्टिक के माध्यम से इमेजिंग समस्याग्रस्त है क्योंकि सब्सट्रेट मोटी है और प्रकाश तितर बितर । यह पेचीदा इमेजिंग के बाद से लंबे समय से काम दूरी (LWD) उद्देश्यों की आवश्यकता है । हालांकि, LWD उद्देश्यों आमतौर पर कम प्रकाश सभा क्षमता उनके coverslip-समकक्ष सही की तुलना में है । इसके अलावा, तकनीक है कि इस तरह के अंतर हस्तक्षेप के विपरीत के रूप में नमूना के माध्यम से गुजर प्रकाश की ध्रुवीयता में परिवर्तन का फायदा उठाने के बाद से प्लास्टिक birefringent है असंभव है । प्लास्टिक के उपयोग के साथ जुड़े बाधाओं को आगे तथ्य यह है कि यह कहां मैक्रोफेज फ्यूजन/MGC गठन सतह पर हो जाएगा भविष्यवाणी करने के लिए असंभव है द्वारा रेखांकित कर रहे हैं । साथ में, इन सीमाओं मैक्रोफेज संलयन के दृश्य को सीमित करने के लिए चरण कंट्रास्ट प्रकाशिकी, विस्तारित कुल इमेजिंग अवधि (> 15 निरंतर घंटे), और कम संकल्प ।
हम हाल ही में एक अत्यधिक fusogenic कांच की सतह की पहचान की है जबकि फिक्स्ड मैक्रोफेज/MGCs4के साथ एकल अणु सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का आयोजन. इस अवलोकन आश्चर्य की बात है क्योंकि साफ गिलास सतहों के बहुत कम दर पर संलयन को बढ़ावा देने के ~ 5% interleukin की उपस्थिति में 24 घंटे के बाद-4 (IL-4) के रूप में फ्यूजन सूचकांक4द्वारा निर्धारित है । हमने पाया कि फ्यूजन को बढ़ावा देने की क्षमता oleamide संदूषण के कारण थी । oleamide या अंय यौगिकों कि इसी तरह लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन निहित की सोखना ग्लास fusogenic बनाया है । सबसे fusogenic यौगिक (आयल मोम) micropatterned था, और यह मैक्रोफेज फ्यूजन पर spatiotemporal नियंत्रण के एक उच्च डिग्री प्रदान की और एक 2-फ्यूजन की घटनाओं की संख्या में वृद्धि गुना permanox की तुलना में समय की एक ही राशि के भीतर मनाया । इन ऑप्टिकल गुणवत्ता सतहों रूपात्मक सुविधाओं और कैनेटीक्स कि नमूनों में रहने वाले MGCs के गठन को नियंत्रित में पहली झलक प्रदान की है ।
इस प्रोटोकॉल में हम कांच सतहों कि रहने वाले नमूनों से MGCs के गठन की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक किस्म के निर्माण का वर्णन । इसके अलावा, हम बताते हैं कि इन सतहों दूर क्षेत्र सुपर संकल्प तकनीक के लिए उत्तरदायी हैं. सतह निर्माण प्रयोग के लक्ष्य पर निर्भर है, और प्रत्येक सतह को आगे बढ़ने के पाठ में संबंधित उदाहरणों के साथ वर्णित है ।
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Protocol
प्रक्रियाओं है कि पशुओं का उपयोग मेयो क्लिनिक, Janelia अनुसंधान परिसर, और एरिजोना राज्य विश्वविद्यालय में पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. तैयारी एसिड-साफ कवर ग्लास
नोट: कई निर्माताओं से खरीदा कवर कांच के रूप में उम्मीद के रूप में साफ नहीं हो सकता है. किसी भी प्रक्रिया से पहले कवर कांच की नियमित रूप से सफाई बैचों पर विचार जहां माइक्रोस्कोपी शामिल है ।
- उच्च stringency कवर ग्लास खरीद । सही मोटाई (0.15 या ०.१७ mm) चुनने के लिए विशेष सावधानी बरतें ।
नोट: कवर कांच मोटाई के विकल्प माइक्रोस्कोप उद्देश्य पर निर्भर है और उद्देश्य प्रति बैरल पर सीधे सूचीबद्ध है । - एक अच्छी तरह से हवादार रासायनिक धुएं हुड में 12 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड में कवर ग्लास मशीन (42 kHz, 70 डब्ल्यू) sonication के साथ 1 एच के लिए । ताजा 12 एम एचसीएल के साथ दो अतिरिक्त बार के लिए यह कदम दोहराएं ।
- ultrapure पानी के साथ एक अलग चोंच भरें और कवर ग्लास जोड़ें । Sonicate एक अच्छी तरह हवादार रासायनिक हुड में 5-10 मिनट के लिए कवर गिलास । इस चरण को दस बार दोहराएं ।
- sonication के साथ 30 मिनट के लिए एक अच्छी तरह हवादार रासायनिक हुड में शुद्ध एसीटोन में कवर गिलास मशीन । इस चरण को दो अतिरिक्त बार दोहराएं ।
- बाँझ ultrapure पानी के साथ एक अलग चोंच भरें और कवर ग्लास जोड़ें । Sonicate एक अच्छी तरह हवादार रासायनिक हुड में 5-10 मिनट के लिए कवर गिलास । इस चरण को दस बार दोहराएं ।
- sonication के साथ 30 मिनट के लिए एक रासायनिक हुड में 100% एथिल शराब में कवर ग्लास मशीन । इस चरण को दो अतिरिक्त बार दोहराएं ।
नोट: एथिल शराब की शुद्धता महत्वपूर्ण है । भंग ठोस के रूप में संदूषणों कांच पर सूख जाएगा और मैक्रोफेज संलयन को बढ़ावा देने कर सकते हैं । - लंबे समय तक भंडारण के लिए, शुद्ध एथिल शराब से भरा एक कंटेनर में एसिड साफ कवर गिलास जगह है । वैकल्पिक रूप से, कवर ग्लास को नाइट्रोजन गैस से सुखाएं और एक वैक्यूम desiccator में स्टोर करें ।
2. Fusogenic ऑप्टिकल गुणवत्ता सतहों की तैयारी
- ultrapure टोल्यूनि में DMSO मुक्त उच्च पिघल बिंदु आयल मोम भंग ।
नोट: स्टॉक सांद्रता 10 मिलीग्राम/एमएल में बना रहे हैं, और ultrapure टोल्यूनि में 1:9 पतला कर रहे है एक 1 मिलीग्राम/
चेतावनी: टोल्यूनि एक teratogen के रूप में देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए । संस्थागत रासायनिक स्वच्छता योजना के अनुसार टोल्यूनि का निपटारा । - एक मात्रा है कि समान रूप से कांच की सतह को कवर पर एक सूखी एसिड साफ कवर ग्लास के लिए तेल काम कर समाधान लागू होते हैं । खिचड़ी भाषा अतिरिक्त समाधान और सूखी नाइट्रोजन गैस या हवा के साथ कवर गिलास । थोक तैयारी के लिए, कवर ग्लास को समायोजित करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक Coplin जार का उपयोग करें ।
- x अक्ष में 3 स्ट्रोक और एक एक प्रकार का वृक्ष के साथ y अक्ष में 3 स्ट्रोक से अगले द्वारा कवर ग्लास पॉलिश-मुक्त पोंछें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
- तुरंत प्रयोग करने से पहले, कवर गिलास बाँझ ultrapure पानी के साथ धोने, और बाद में एक जैविक सुरक्षा हुड में पराबैंगनी प्रकाश के साथ 15-30 मिनट के लिए निष्फल । वैकल्पिक रूप से, ईथीलीन ऑक्साइड या गामा विकिरण द्वारा कवर गिलास निष्फल ।
3. Micropatterning हाइड्रोकार्बन युक्त यौगिकों पूर्व निर्धारित क्षेत्रों के लिए फ्यूजन सीमित करने के लिए
- अम्ल-जरुर कवर ग्लास को सुखा लें और एक समतल सतह पर काँच को स्थिर कर लें ।
- संदंश का प्रयोग, ध्यान से हाइड्रोकार्बन यौगिक (ओं) का एक काम समाधान में एक सोने के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी खोजक ग्रिड विसर्जित कर दिया । एक हाइड्रोकार्बन यौगिक चुनें जो प्रयोग के अंतिम लक्ष्य को पूरा करे ( तालिका 1देखें) । दूर धीरे फिल्टर कागज पर ग्रिड दोहन से अतिरिक्त समाधान बाती, और तुरंत कवर ग्लास के केंद्र में ग्रिड जगह है । अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले टोल्यूनि को 2 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें ।
- सुनिश्चित करें कि ग्रिड शीशे को धीरे से उलटा करके कांच के लिए बंधुआ है । यदि ग्रिड अलग दोहराएं एक नया कवर ग्लास का उपयोग कर 3.2 कदम ।
नोट: यदि एक प्लाज्मा क्लीनर उपलब्ध नहीं है, कदम 3.4 छोड़ दें । - प्लाज्मा वैक्यूम गैस प्लाज्मा के साथ उपचार द्वारा कवर गिलास साफ ।
नोट: खोजक ग्रिड प्लाज्मा से लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन के साथ अंतर्निहित सतह adsorbed की रक्षा के लिए एक मुखौटा के रूप में कार्य करता है । क्षेत्रों है कि ग्रिड द्वारा अरक्षित है प्लाज्मा के लिए जोखिम से गैर fusogenic प्रदान की जाती हैं । समय की मात्रा को कवर गिलास प्लाज्मा को बेनकाब है empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । - ठीक टिप संदंश का प्रयोग, ध्यान से कांच की सतह से ग्रिड को हटाने के लिए micropattern बेनकाब ।
4. निर्माण ग्लास नीचे व्यंजन
- एक चरण ड्रिल बिट का उपयोग कर एक 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश के तल में एक 6-10 मिमी परिपत्र छेद ड्रिल ।
नोट: यह एक चरण ड्रिल बिट चिकनी किनारों बनाने के लिए उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि किनारों बहुत मोटा है, कवर गिलास पकवान के नीचे फ्लैट बांड नहीं होगा । अपूर्ण फ्लैट सतहों माइक्रोस्कोपी मुश्किल बनाते हैं । - निर्माता के निर्देशों के अनुसार सावधानीपूर्वक मिश्रण और degas सिलिकॉन elastomer (अर्थात, polydimethylsiloxane; PDMS) ।
- लागू करें elastomer की एक पतली कोटिंग सिर्फ सीमेट के किनारे करने के लिए (यानी, circumscribing) छेद ।
नोट: elastomer एक सतत हालांकि छेद के आसपास पतली बैंड के रूप में प्रकट होना चाहिए । - धीरे या तो fusogenic कवर ग्लास लागू करें (खंड 2 में वर्णित), या सूखी एसिड साफ कवर ग्लास (खंड 1 में वर्णित) पकवान के लिए elastomer से घिरा हुआ छेद को कवर करने के लिए । सुनिश्चित करें कि कवर गिलास पकवान के नीचे से फ्लश दिखाई देता है और छेद के व्यास से परे फैली हुई है ताकि कांच का एक बड़ा हिस्सा प्लास्टिक के संपर्क में है । 2-3 एच के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर पाक द्वारा elastomer इलाज ।
- यदि fusogenic ग्लास पसंद है, यूवी मानक प्रोटोकॉल के अनुसार पकवान और संस्कृति कोशिकाओं को निष्फल । हालांकि, अगर एक micropattern पसंद है, आगे बढ़ना micropattern तैयारी के लिए 3.2 कदम (गैस micropatterning के दौरान इस्तेमाल किया प्लाज्मा पकवान और दृढ़ता से जोड़ों PDMS ग्लास को निष्फल) ।
5. एकत्रित Thioglycollate-बटोरी मैक्रोफेज
- इंजेक्शन 8-सप्ताह पुराने C57BL/4% शराब बनानेवाला के thioglycollate के एक बाँझ समाधान के 0.5 मिलीलीटर के साथ 6 चूहों के रूप में पहले से वर्णित3,4,6।
- ७२ घंटे बाद, euthanize पशु की देखभाल और उपयोग के दिशा निर्देशों के अनुसार पशु, और बर्फ ठंडा फॉस्फेट के साथ पेरिटोनियल लेवेज द्वारा मैक्रोफेज इकट्ठा-बफर खारा 5 मिमी ethylenediaminetetraacetate के साथ पूरक ।
- 3 मिनट के लिए 300 x g पर मैक्रोफेज केंद्रापसारक और DMEM के 1 मिलीलीटर में reसस्पेंड: F12 15 मिमी HEPES, 10% FBS, और 1% एंटीबायोटिक दवाओं (संस्कृति मध्यम) के साथ पूरक ।
नोट: कक्षों को बाद में किसी Neubauer hemocytometer के साथ गिना जाता है । मैक्रोफेज उचित एकाग्रता को पतला कर रहे है और सतहों के लिए आवेदन किया । किसी दी गई सतह पर लागू करने के लिए कक्षों की संख्या को प्रायोगिक प्रश्न के प्रयोजन के लिए जांचकर्ता द्वारा सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए । प्राथमिक साहित्य में ज्ञात मानकों की सलाह लें । - 30 मिनट के बाद HBSS के साथ सतहों धो 0.1% BSA के साथ पूरक गैर अनुयाई कोशिकाओं को दूर करने के लिए, और ताजा संस्कृति के माध्यम से प्रतिस्थापित । (5% सह हवा में 37 डिग्री सेल्सियस पर) मशीन के लिए संस्कृतियों लौटें ।
- 2 ज बाद में, मध् यम को महाप्राण और संस् कृत माध् यम से प्रतिस्थापित करें, आईएल-4 के 10 एनजी/ 4कहीं वर्णित के रूप में कक्ष छवि ।
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Representative Results
सामग्री के भौतिक मानकों मैक्रोफेज फ्यूजन7,8,9,10की हद पर नाटकीय प्रभाव पड़ता है । इसके अलावा, सतह दूषित मैक्रोफेज फ्यूजन11को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है । इसलिए, यह मैक्रोफेज फ्यूजन के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में साफ कवर ग्लास के साथ शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है । जब प्रोटोकॉल 1 में वर्णित के रूप में साफ किया, कवर कांच कोई स्पष्ट सतह सुविधाओं के साथ असाधारण सपाट है, जबकि लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन के सोखना सतह चमकाने के बाद nanotopography (चित्रा 1) की एक डिग्री बनाता है ।
साफ कवर ग्लास सतहों पर, एक बहुत ही कम दर (चित्रा 2) पर फ्यूज मैक्रोफेज । इसके विपरीत, IL-4 की उपस्थिति में 24 घंटे के बाद, मैक्रोफेज लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन युक्त यौगिकों के साथ adsorbed सतहों के लिए लागू किया मजबूत संलयन (चित्रा 2) से गुजरना । इसके अलावा, अकेले विलायक के सोखना (जैसे, टोल्यूनि, isopropanol) ग्लास एक fusogenic सतह (चित्रा 2) नहीं बना है ।
हालांकि यह संभावना नहीं है कि adsorbed हाइड्रोकार्बन के एक 10 एनएम परत नाटकीय रूप से संकल्प को प्रभावित करता है, यह फिर भी मात्रात्मक विभिंन सतहों के बीच संकल्प में संभावित अंतर का आकलन महत्वपूर्ण था । संकल्प आमतौर पर रेले कसौटी द्वारा परिभाषित किया जाता है । एक वैकल्पिक मीट्रिक जो अक्सर अनुमानित रिज़ॉल्यूशन के लिए उपयोग किया जाता है, पूर्ण-चौड़ाई आधा अधिकतम (FWHM) संरचनाओं के प्रकाश की विवर्तन सीमा से छोटी है । महत्वपूर्ण बात, वहां विभिंन सतहों के बीच 100 एनएम फ्लोरोसेंट मोतियों की FWHM में कोई स्पष्ट अंतर है (चित्र 3ए), सुझाव है कि फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए आवश्यक कांच की विशेषताओं को पर्याप्त रूप से संरक्षित किया गया । इसके अलावा, हम एक evanescent क्षेत्र उत्पन्न करने और लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन (चित्र 3 बी) युक्त सतहों के लिए लागू मैक्रोफेज के 3d प्रत्यक्ष stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने में सक्षम थे. लाइव इमेजिंग तकनीक की एक किस्म व्यवहार्य है जब मैक्रोफेज सतहों (चित्रा 4, पूरक वीडियो 1, पूरक वीडियो 2) के लिए लागू कर रहे हैं ।
प्रत्येक सरफ़ेस का लाभ तालिका 1में बताया गया है । ध्यान दें कि उंनत इमेजिंग तकनीक है कि उच्च ना तेल विसर्जन उद्देश्यों की आवश्यकता के बहुमत के बाद से वे मोटी हैं, और autofluorescence की एक डिग्री है सबसे fusogenic प्लास्टिक सतहों के साथ असंगत हैं । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सतहों adsorbed लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन के साथ इमेजिंग तकनीकों की एक बड़ी संख्या में सक्षम करें12 पाम/dSTORM/GSDIM13,14,15,16, 17, उद्योग, और अंय18,19,20,21 (तालिका 1) । इसके अलावा, न केवल इमेजिंग तकनीक की एक बड़ी संख्या में संभव है (तालिका 1), लेकिन एक micropattern का उपयोग MGC गठन (चित्रा 4Bपर spatiotemporal नियंत्रण के एक उच्च डिग्री सक्षम बनाता है; पूरक वीडियो 1) ।
चित्र 1 : आयल adsorbed सतहों नेनो सतह स्थलाकृति की एक डिग्री है । AFM स्कैन (5 x 5 µm) कांच सतहों कोई स्पष्ट स्थलाकृतिक सुविधाओं जबकि आयल-adsorbed सतहों दिखाने की सतह को सजाने सामग्री की arrays होते हैं । प्रत्येक micrograph के दाईं ओर तीव्रता पैमाने z-अक्ष के साथ ऊंचाई से पता चलता है । स्केल सलाखों के 500 एनएम हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन के साथ सतहों adsorbed कवर ग्लास पर मैक्रोफेज संलयन को बढ़ावा देने । (ए) IL-4 के अभाव में, वहां साफ गिलास सतहों पर बहुत कुछ multinucleated कोशिकाओं के रूप में राइट के दाग द्वारा निर्धारित प्रतीत होता है । (ख) IL-4 की उपस्थिति में 24 एच के बाद, solubilize लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन (जैसे, टोल्यूनि या isopropanol) के लिए इस्तेमाल किया विलायक के साथ adsorbed सतहों कुछ multinucleated कोशिकाओं है । (ग-ङ) इसके विपरीत, सतहों लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन के साथ adsorbed फ्यूजन और MGC गठन को बढ़ावा देने के । आयल सोखना परिणाम IL-4 प्रेरित संलयन के उच्चतम डिग्री में । MGCs काले में उल्लिखित हैं. (च) permanox प्लास्टिक पर MGC गठन की उपाधि की तुलना के लिए दिखाया गया है. प्रत्येक छवि में, हल्के नीले रंग से पता चलता है नाभिक और कोशिका द्रव्य बैंगनी दिखाई देता है । स्केल पट्टियां 100 µm हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 3 : लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन के साथ adsorbed सतहों नाटकीय रूप से संकल्प को प्रभावित नहीं करते । (A) 100 एनएम फ्लोरोसेंट मोतियों की तुलना कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी के साथ प्रबुद्ध । ऊपरी बाएं पैनल में इनसेट एक बढ़ाया दृश्य एक फ्लोरोसेंट मनका है । लाल रेखा FWHM परिकलित करने के लिए उपयोग किया गया एक उदाहरण रेखा प्रोफ़ाइल दिखाने के लिए आरोपित था । 100 एनएम मोतियों की FWHM में कोई स्पष्ट अंतर नहीं देखा गया । पैमाने सलाखों के 5 µm हैं । (ख) TIRF और 3d प्रत्यक्ष stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन के रूप में मैक-1 integrin के वितरण की तुलना । मैक्रोफेज एक oleamide युक्त सतह के लिए आवेदन किया और 24 एच के लिए आईएल-4 के साथ मशीन थे । बी में सफेद इनसेट बाद में माइक्रोग्राफ में imaged क्षेत्र पर प्रकाश डाला गया । पैमाने सलाखों के TIRF छवियों और 3 डी तूफान के लिए 2 µm के लिए 5 µm हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन के साथ adsorbed सतहों मैक्रोफेज फ्यूजन और प्रसार के समय हल विचारों को सक्षम करें । (a) आरेख micropattern जनरेट करने के लिए उपयोग की गई कार्यविधि दिखाता है । (ख) Micropatterned सतहों मैक्रोफेज संलयन के spatiotemporal नियंत्रण प्रदान । कई घंटे IL-4 के आवेदन के बाद, मैक्रोफेज चरण के विपरीत के साथ छवि थे । micropattern पर ग्रिड के इंटीरियर से कक्षों का माइग्रेशन नोट करें । फ्यूजन केवल micropattern पर मनाया गया । सफेद डैश एक MGC के विस्तार की रूपरेखा । समय hh: mm: ss के रूप में प्रत्येक micrograph के ऊपरी बाएं कोने में दिखाया गया है । पैमाने सलाखों के 50 µm हैं. (ग) जाली प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी20 एक तेल adsorbed सतह पर फैल एक मैक्रोफेज की उच्च spatiotemporal गतिशीलता से पता चलता है । रंग encodes तीव्रता वितरण (पीला सबसे तीव्र है) eGFP-LifeAct की । समय एम एस के रूप में प्रत्येक micrograph के ऊपरी दाएँ कोने में दिखाया गया है: ss. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| सतह: | ||||||
| तकनीक | पैराफिन | Oleamide | वेसिलीन | सांसद आयल | Permanox | साफ गिलास |
| चरण कंट्रास्ट | √ | √ | √ | √ | √* | √ |
| brightfield | √ | √ | √ | √ | √* | √ |
| डीआइसी | √ | √ | N/T | √ | x | √ |
| epifluorescence | √ | √ | √ | √ | √* | √ |
| confocal | √ | √ | √ | √ | √* | √ |
| tirf | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| पाम dSTORM/GSDIM | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| सिम | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T |
| STED | N/T | √ | N/T | N/T | N/T | √ |
| LLSM | √ | N/T | N/T | √ | N/T | √ |
| फ्यूजन सूचकांक | मध्यवर्ती | मध्यवर्ती | मध्यवर्ती | उच्च | मध्यवर्ती | कम |
| फ्यूजन स्थान | यादृच्छिक | यादृच्छिक | यादृच्छिक | निर्धारित | यादृच्छिक | यादृच्छिक |
| MP-micropattern | ||||||
| उद्योग-विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट | ||||||
| TIRF-कुल आंतरिक परावर्तन प्रतिदीप्ति | ||||||
| पाम-photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी | ||||||
| dSTORM-प्रत्यक्ष stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी | ||||||
| GSDIM-भूमि राज्य घट व्यक्तिगत अणु वापसी के बाद | ||||||
| सिम संरचित दीप्ति | ||||||
| STED-प्रेरित उत्सर्जन घट | ||||||
| LLSM-जाली हल्की चादर माइक्रोस्कोपी | ||||||
| √-संगत | ||||||
| x-असंगत | ||||||
| √ *-केवल LWD, कम आवर्धन, या विसर्जन उद्देश्यों के साथ संभव | ||||||
| N/T-परीक्षण नहीं किया गया | ||||||
तालिका 1: प्रत्येक सरफ़ेस का संभावित उपयोग। ध्यान दें कि प्लास्टिक सतहों सबसे इमेजिंग तकनीकों का उपयोग बाधा ।
पूरक वीडियो 1: MGC गठन के समय हल चरण कंट्रास्ट देखें। MGC गठन के स्पष्ट synchronicity नोट करें । समय hh: mm: ऊपरी बाएं कोने में एसएस में दिखाया गया है । स्केल बार 50 µm है । इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
पूरक 2 वीडियो: जाली प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप ी 20 के एक thioglycollate-बटोरा हुआ eGFP-LifeAct एक आयल adsorbed सतह पर फैल मैक्रोफेज । इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
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Discussion
की पहचान करने के लिए और बाद में ऑप्टिकल गुणवत्ता कांच सतहों कि मैक्रोफेज फ्यूजन को बढ़ावा देने की जरूरत है कि हाल ही में जब तक कोई प्रकाशित नहीं अध्ययन सीधे रहने वाले नमूनों के संदर्भ में मैक्रोफेज संलयन कल्पना से उपजी है3, 4. इस तथ्य के कारण है कि fusogenic प्लास्टिक सतहों कि सामांयतः उपयोग किया जाता है LWD उद्देश्यों की आवश्यकता होती है और मोटे तौर पर चरण कंट्रास्ट प्रकाशिकी तक ही सीमित हैं । इन बाधाओं इंजीनियरिंग एक ऑप्टिकल गुणवत्ता कांच की सतह है कि न केवल मैक्रोफेज संलयन के असाधारण दरों को बढ़ावा देकर दूर थे, लेकिन MGCs के गठन पर स्थानिक नियंत्रण की एक आश्चर्य की बात की डिग्री प्रदान की ।
हालांकि इस प्रौद्योगिकी मैक्रोफेज फ्यूजन की निगरानी के लिए उन्नत इमेजिंग तकनीक के उपयोग को सक्षम बनाता है, यह सीमा के बिना नहीं आता है. हालांकि पॉलिश सतहों लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन के साथ adsorbed (जैसे, oleamide, आयल मोम, आदि) fusogenic प्लास्टिक सतहों की तुलना में मैक्रोफेज संलयन के असाधारण दरों का उत्पादन, फ्यूजन एक स्थानिक stochastic रहता है प्रक्रिया (चित्र 2) । यह सीमा उच्च आवर्धन उद्देश्यों का उपयोग करने के लिए रहने वाले नमूनों के साथ संलयन कल्पना के बाद से यह जहां फ्यूजन हो जाएगा भविष्यवाणी करने के लिए असंभव है precludes । इस सीमा को दूर करने के लिए, हम micropatterned आयल को पूर्व निर्धारित क्षेत्रों में फ्यूजन प्रक्रिया को सीमित करने के लिए (चित्रा 4; पूरक वीडियो 1) । micropattern को विशेष रूप से परिष्कृत मैक्रोफेज संलयन हमें भविष्यवाणी करने के लिए सक्षम है जहां फ्यूजन हो और इसलिए उच्च आवर्धन उद्देश्यों का उपयोग इस अत्यधिक चेतन घटना का अध्ययन करेगा ।
मैक्रोफेज फ्यूजन के स्थानिक नियंत्रण प्रदान करता है कि एक ऑप्टिकल गुणवत्ता सतह का उपयोग करने का महत्व क्या है? सबसे पहले, के बाद से इन सतहों संलयन के उच्च दर को बढ़ावा देने, यह एक उचित समय सीमा के भीतर रहने वाले नमूनों से फ्यूजन की निगरानी संभव है । यह प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के मामले में आवश्यक है के बाद से प्रकाश के लिए कोशिकाओं की वृद्धि की जोखिम photobleaching और phototoxicity की ओर जाता है । दूसरा, इन सतहों उन्नत इमेजिंग तकनीकों प्रतिदीप्ति या ध्रुवीकरण के आधार पर नियोजित किया जा करने के लिए सक्षम (चित्रा 4; तालिका 1; पूरक वीडियो 1; पूरक वीडियो 2) । अंत में, spatiotemporal नियंत्रण micropatterned इस प्रोटोकॉल में वर्णित करने के लिए सेलुलर और सेलुलर तंत्र है कि मैक्रोफेज फ्यूजन शासन की पहचान के लिए डिजाइन अध्ययन तेज करना चाहिए द्वारा afforded ।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
हम इस काम के लिए उपयोगी चर्चा के लिए चयापचय और संवहनी जीवविज्ञान के लिए केंद्र में Ugarova प्रयोगशाला और जांचकर्ताओं के सदस्यों को धंयवाद देना चाहते हैं । जेम्स Faust ने 2015 में यूरोपीय आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशाला सुपर रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोपी कोर्स में प्रशिक्षकों के प्रति अपना आभार व्यक्त करना चाहता है । हम LLSM के लिए नमूना तैयारी के साथ मदद के लिए Janelia पर सत्य Khuon शुक्रिया अदा करना चाहता हूं । समीक्षा और इस काम के अंश फिल्माने के दौरान जेम्स Faust को एक T32 फेलोशिप (5T32DK007569-28) द्वारा सपोर्ट किया गया । इस काम के जाली प्रकाश शीट घटक HHMI और बेटी और गॉर्डन मूर फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था । T.U. NIH अनुदान HL63199 द्वारा वित्त पोषित है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
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