Summary
Este protocolo describe la fabricación de las superficies de cristal de calidad óptica adsorbido con compuestos que contengan hidrocarburos de cadena larga que pueden ser utilizados para controlar la fusión de macrófagos de ejemplares vivos y permite la microscopía de superresolución de muestras fijas .
Abstract
Visualizar la formación de células gigantes multinucleadas (MGCs) de ejemplares vivos ha sido un desafío debido a que las técnicas de imagen más vivo requieren de propagación de la luz a través del vidrio, pero en vidrio fusión de macrófagos es un acontecimiento raro. Este protocolo presenta la fabricación de varias superficies de cristal de calidad óptica donde la adsorción de compuestos que contienen hidrocarburos de cadena larga transforma vidrio una superficie fusogénicas. En primer lugar, se describe la preparación de limpieza de superficies de vidrio como material para la modificación superficial de partida. En segundo lugar, un método se proporciona para la adsorción de compuestos que contienen hidrocarburos de cadena larga para convertir no fusogénicas vidrio en un substrato fusogénicas. En tercer lugar, este protocolo describe fabricación de micropatrones superficie que promueven un alto grado de control spatiotemporal sobre formación de MGC. Por último, se describe fabricación de platos de fondo de vidrio. Se muestran ejemplos de uso de este sistema de célula en vitro como un modelo para estudiar la fusión de macrófagos y la formación de MGC.
Introduction
La formación del MGCs acompaña a una serie de estados patológicos en el cuerpo humano caracterizado por inflamación crónica1. A pesar del acuerdo que mononucleated macrófagos se fusionan para formar MGCs2, sorprendentemente pocos estudios han demostrado fusión en contexto con vivas muestras de3,4. Esto es porque las superficies de vidrio limpio que se requieren para la mayoría de técnicas de imagen no favorecer la fusión de macrófagos cuando inducida por citoquinas inflamatorias5. De hecho, si limpio de vidrio se utiliza como sustrato para la fusión de macrófagos, luego baja a los objetivos de aumento intermedio (es decir, 10-20 X) y más de 15 h de continuo la proyección de imagen se requieren a menudo para observar un evento único fusion.
En la otra mano, fusogénicas las superficies de plástico (por ejemplo, permanox) o del plástico del grado bacteriológico promover fusión2. Sin embargo, la proyección de imagen a través del plástico es problemática porque el sustrato es grueso y dispersa la luz. Esto complica la proyección de imagen ya que requiere mucho trabajo objetivos de distancia (LWD). Sin embargo, objetivos LWD suelen tienen poca luz reuniendo capacidad en comparación con sus contrapartes cubreobjetos-corregida. Además, técnicas que aprovechan los cambios en la polaridad de luz que pasa a través de la muestra tales como contraste diferencial de interferencia son imposibles ya que el plástico es birrefringente. Las barreras asociadas al uso del plástico se destacaron aún más por el hecho de que es imposible predecir donde se producirá la formación de macrófagos fusión/MGC en la superficie. En conjunto, estas limitaciones restringen la visualización de la fusión de macrófagos a la óptica de contraste de fase, extendido duraciones imagen total (> 15 horas continuas) y baja resolución.
Recientemente se identificó una superficie altamente fusogénicas vidrio mientras realiza la microscopía de resolución super sola molécula con macrófagos fijos/MGCs4. Esta observación fue sorprendente porque limpiar vidrio superficies favorecer la fusión en la muy baja tasa de ~ 5% después de 24 h en presencia de Interleucina-4 (IL-4) según lo determinado por la fusión índice4. Se encontró que la capacidad de favorecer la fusión fue debido a la contaminación oleamide. Adsorción de oleamide u otros compuestos que igualmente contenían hidrocarburos de cadena larga hecha del vidrio fusogénicas. La mayoría fusogénicas compuesto (parafina) era micropatterned, e imparte un alto grado de control spatiotemporal sobre fusión de macrófagos y un aumento de 2 dobleces en el número de eventos de fusión observados dentro de la misma cantidad de tiempo en comparación con permanox. Estas superficies de calidad óptica proveyeron el primer vistazo a las características morfológicas y cinéticas que rigen la formación de MGCs en ejemplares vivos.
En este protocolo se describe la fabricación de una variedad de superficies de vidrio que pueden usarse para controlar la formación de MGCs de ejemplares vivos. Además, demostramos que estas superficies son susceptibles a las técnicas de resolución súper campo lejano. Fabricación superficial depende de la meta del experimento, y cada superficie se describe con ejemplos relacionados en el texto del procedimiento.
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Protocol
Procedimientos que utilizan los animales fueron aprobados por los comités de uso en Mayo Clinic, Janelia investigación Campus y Universidad Estatal de Arizona y de cuidado Animal.
1. preparación de ácido limpiar cubierta de vidrio
Nota: adquiridos de muchos fabricantes de vidrio de cubierta puede no ser tan limpia como se esperaba. Examinar rutinariamente limpiar lotes de cristal antes de cualquier procedimiento cuando se trata de la microscopia.
- Compra de vidrio de cubierta de alta rigurosidad. Tenga especial cuidado al elegir el grueso correcto (0,15 ó 0.17 mm).
Nota: La elección del espesor del vidrio depende del objetivo de microscopio y cotiza directamente en el cilindro del objetivo. - Incubar el vidrio de cubierta de 12 M de ácido clorhídrico en una campana de humos químicos bien ventilado durante 1 h con baño de ultrasonidos (42 kHz, 70 W). Repetir esta operación dos veces más con fresco 12 M HCl.
- Llene un recipiente aparte con agua ultrapura y añadir el cubierta de vidrio. Someter a ultrasonidos el vidrio de cubierta de 5-10 min en una campana química bien ventilada. Repita este paso diez veces.
- Incubar el vidrio de cubierta en acetona pura en una campana química bien ventilada durante 30 minutos con la sonicación. Repetir esta operación dos veces más.
- Llene un recipiente aparte con agua ultrapura estéril y añadir el cubierta de vidrio. Someter a ultrasonidos el vidrio de cubierta de 5-10 min en una campana química bien ventilada. Repita este paso diez veces.
- Incubar el vidrio de cubierta en alcohol etílico de 100% en una campana química por 30 min con la sonicación. Repita este paso dos veces más.
Nota: La pureza del alcohol etílico es importante. Contaminantes en forma de sólidos disueltos se secarán sobre el vidrio y pueden favorecer la fusión de macrófagos. - Para el almacenamiento a largo plazo, coloque el cristal ácido limpiar en un recipiente llenado de alcohol etílico puro. Por otra parte, seca el cubierta de vidrio con gas nitrógeno y almacenar en un desecador de vacío.
2. preparación de superficies de calidad óptica fusogénicas
- Disolver DMSO-libre elevado punto de fusión punto de parafina en tolueno ultrapura.
Nota: Las concentraciones de población se hacen en 10 mg/mL y diluido 1:9 en ultrapura tolueno para hacer un 1 mg/mL solución de trabajo.
PRECAUCIÓN: Tolueno debe manipularse con cuidado como un teratógeno. Deseche de acuerdo con el plan de higiene química institucional de tolueno. - Aplicar la parafina trabajo solución a un vidrio de cubierta limpia ácido seco en un volumen que cubre uniformemente la superficie de vidrio. Decantar la solución excedente y seca el vidrio de cubierta con gas de nitrógeno o aire. Para la preparación a granel, utilice una jarra de Coplin para adaptarse al cubierta de vidrio.
- Pulir el vidrio de cubierta por 3 movimientos en el eje x y luego por 3 movimientos en el eje y con una toallita libre de pelusas (véase Tabla de materiales).
- Inmediatamente antes de que se lleva a cabo el experimento, lavar el vidrio de la cubierta con agua ultrapura estéril y posteriormente esterilizar por 15-30 min con luz ultravioleta en una campana de seguridad biológica. Alternativamente, esterilizar el vidrio de cubierta por la irradiación de etileno óxido o gamma.
3. Micropatterning hidrocarburos conteniendo compuestos limitar la fusión a predeterminados regiones
- Seque el cristal ácido limpiar e inmovilizar el vidrio sobre una superficie plana.
- Cuidadosamente con unas pinzas, sumerja una cuadrícula de buscador de microscopia electrónica de transmisión oro en una solución de trabajo de los hidrocarburos, establecidos. Elegir un compuesto de hidrocarburos que cumpla con el objetivo final del experimento (ver tabla 1). Exceso de solución fuera del fieltro golpeando suavemente la cuadrícula en papel de filtro e inmediatamente Coloque la parrilla en el centro del cubierta de vidrio. Permita que el tolueno secar durante 2 minutos antes de proceder al siguiente paso.
- Asegúrese de que la cuadrícula se enlaza al vidrio invirtiendo suavemente el vidrio. Si la rejilla desprende Repita el paso 3.2 usando un nuevo vidrio de cobertura.
Nota: Si no hay un limpiador de plasma, omite el paso 3.4. - Plasma Limpie el vidrio de cubierta por el tratamiento con plasma de vacío.
Nota: La red buscador actúa como una máscara para proteger la superficie subyacente adsorbida con hidrocarburos de cadena larga del plasma. Las regiones que son desprotegidas por la red son prestadas no fusogénicas por exposición al plasma. La cantidad de tiempo que el cristal es expuesto al plasma debe determinarse empíricamente. - Con unas pinzas de punta fina, retire con cuidado la rejilla de la superficie de cristal para exponer la micropattern.
4. fabricación de platos de fondo de vidrio
- Perfore un agujero circular de 6-10 mm en la parte inferior de un plástico de 35 mm placa de Petri con una broca de paso.
Nota: Es fundamental utilizar una broca de paso para crear los bordes lisos. Si los bordes son demasiado ásperos, el cristal no se adherirá plano hasta el fondo del plato. Superficies planas imperfecto dificultan la microscopia. - Mezclar cuidadosamente y desgasifica el elastómero de silicona según las instrucciones del fabricante(es decir, polidimetilsiloxano; PDMS).
- Aplique una fina capa de elastómero a próximas al borde de (es decir, circunscribir) el agujero.
Nota: El elastómero debe aparecer como una banda continua aunque delgada que rodea el agujero. - Aplique suavemente el vidrio de cubierta fusogénica (descrito en la sección 2), o el vidrio de cubierta de limpieza ácido seco (descrito en la sección 1) al plato con el fin de cubrir el agujero rodeado de elastómero. Asegúrese de que el vidrio de la cubierta aparece al ras con la parte inferior del plato y se extiende más allá del diámetro del agujero para que una porción substancial del vidrio está en contacto con el plástico. Curar el elastómero por la hornada a 50 ° C para 2-3 h.
- Si prefiere vidrio fusogénica, UV esterilizar las células de plato y de la cultura según protocolos estándar. Sin embargo, si prefiere un micropattern, proceda al paso 3.2 preparación micropattern (el plasma del gas utilizado durante micropatterning esteriliza el plato y fuertemente parejas PDMS para vidrio).
5. recoger los macrófagos sacados de tioglicolato
- Inyectar ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad con 0,5 mL de una solución estéril de tioglicolato de Brewer 4% como se describió anteriormente3,4,6.
- Setenta y dos horas más tarde, eutanasia animal según el cuidado de los animales aprobado utilizar pautas y recoger los macrófagos mediante lavado peritoneal con solución salina tamponada con fosfato helada con 5 mM ethylenediaminetetraacetate.
- Centrifugue los macrófagos a 300 x g durante 3 min y resuspender en 1 mL de DMEM:F12 con 15 mM HEPES, 10% FBS y 1% antibióticos (medio de cultivo).
Nota: Posteriormente se cuentan las células con un hemocitómetro de Neubauer. Los macrófagos son diluidos a la concentración adecuada y aplicados a las superficies. Debe considerarse cuidadosamente el número de células para aplicar a una superficie dada por el investigador con el propósito de la pregunta experimental. Consultar estándares conocidos en la literatura primaria. - Después de 30 minutos lavar las superficies con HBSS con 0.1% de BSA para eliminar las células no adherente y reemplazar con medio de cultivo fresco. Vuelva las culturas a la incubadora (5% CO2 en aire a 37 ° C).
- 2 h más tarde, aspirar el medio y reemplazar con medio de cultivo suplementado con 10 ng/mL de IL-4. Imagen de las células como se describe en otra parte4.
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Representative Results
Parámetros fisicoquímicos de los materiales tienen efectos dramáticos en la medida de macrófagos fusión7,8,9,10. Además, contaminantes de la superficie se saben para promover la fusión de macrófagos11. Por lo tanto, es importante comenzar con limpia vidrio de cubierta como un control negativo para la fusión de macrófagos. Cuando limpiarse según lo descrito en el protocolo 1, el vidrio de cubierta es excepcionalmente plana con ninguna superficie características obvias, mientras que la adsorción de los hidrocarburos de cadena larga seguida de pulido superficial crea un grado de nanotopography (figura 1).
En las superficies de cristal limpio, macrófagos fusionan a una tasa muy baja (figura 2). En cambio, después de 24 h en presencia de IL-4, los macrófagos que se aplica a las superficies adsorbidas con compuestos que contengan hidrocarburos de cadena larga experimentan la fusión sólida (figura 2). Además, adsorción del disolvente solo (p. ej., tolueno, isopropanol) no tiene vidrio una superficie fusogénica (figura 2).
Aunque es poco probable que una capa de 10 nm de hidrocarburos adsorbidos afecta dramáticamente la resolución, sin embargo es importante evaluar cuantitativamente la diferencia de potencial en la resolución entre las diferentes superficies. Resolución se define típicamente por el criterio de Rayleigh. Una métrica alternativa que a menudo se usa para aproximar la resolución es ancho en el medio máximo (FWHM) de las estructuras más pequeñas que el límite de difracción de la luz. Lo importante, no es ninguna diferencia aparente en la FWHM de 100 perlas fluorescentes nm entre las diferentes superficies (Figura 3A), sugiriendo que las características de vidrio necesarios para la proyección de imagen fluorescente suficientemente fueron preservadas. Además, hemos sido capaces de generar un campo evanescente y ejecutar la microscopia 3D directo reconstrucción óptica estocástica de los macrófagos aplicado a las superficies que contienen hidrocarburos de cadena larga (figura 3B). Una variedad de técnicas de imagen en vivo son factibles cuando los macrófagos se aplican a las superficies (figura 4, suplemento Video 1, Video suplementario 2).
La ventaja de cada superficie se describe en la tabla 1. Tenga en cuenta que la mayoría de las técnicas de imagen avanzadas que requieren alta objetivos de inmersión de aceite NA es incompatible con la mayoría de las superficies de plástico fusogénicas ya que son gruesas y tienen un grado de autofluorescencia. Cabe señalar que las superficies adsorbidas con hidrocarburos de cadena larga permiten un gran número de técnicas de imagen incluyendo12 Palma/dSTORM/GSDIM13,14,15,16, 17, DIC y otros18,19,20,21 (tabla 1). Además, no sólo un gran número de técnicas de imagen posible (tabla 1), pero el uso de un micropattern permite un alto grado de control spatiotemporal sobre formación de MGC (Figura 4B; Video suplementario 1).
Figura 1 : Superficies de parafina fijado por adsorción tienen un grado de topografía superficial nanoescala. Análisis AFM (5 x 5 μm) de superficies de vidrio no muestran características topográficas evidentes mientras que superficies adsorbido de parafina contienen arreglos de material de decoración de la superficie. La escala de intensidad en el lado derecho de cada micrografía muestra la altura a lo largo del eje z. Las barras de escala son 500 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Superficies adsorbidas con hidrocarburos de cadena larga favorecer la fusión de macrófagos en cristal. (A) en ausencia de IL-4, parece que hay muy pocas células multinucleadas en superficies de vidrio limpio por tinción de Wright. (B) después de 24 h en presencia de IL-4, superficies adsorbidas con el solvente utilizado para solubilizar la cadena larga de hidrocarburos (p. ej., tolueno o isopropanol) tienen algunas células multinucleadas. (C–E) Por el contrario, las superficies adsorbidas con hidrocarburos de cadena larga promoción fusión y formación de MGC. Resultados de adsorción de parafina en el grado más alto de la IL-4 inducida por el fusión. MGCs se contornean en negro. (F) el grado de formación de MGC en plástico de permanox se muestra para la comparación. En cada imagen, azul claro muestra los núcleos y el citoplasma aparece púrpura. Las barras de escala son 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Superficies adsorbidas con hidrocarburos de cadena larga no afectan dramáticamente resolución. (A) comparación de 100 perlas fluorescentes nm iluminado con microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total (TIRF). La inserción en el panel superior de la izquierda es una vista ampliada de una sola tira fluorescente. La línea roja se superpone para mostrar un perfil de línea de ejemplo permite calcular FWHM. No observó ninguna diferencia aparente en la FWHM de 100 granos de nm. Las barras de escala son 5 μm. (B) comparación de la distribución de la integrina Mac-1 según lo determinado por la microscopia 3D directo reconstrucción óptica estocástica y TIRF. Macrófagos se aplica a una superficie que contiene oleamide y se incubaron con IL-4 para 24 h. El recuadro blanco en B destaca la región reflejada en imágenes posteriores. Las barras de escala son 5 μm para las imágenes de la TIRF y 2 para 3D tormenta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Superficies adsorbidas con hidrocarburos de cadena larga permiten vistas tiempo-resolved de la fusión de macrófagos y separarse. (A) el diagrama muestra el procedimiento utilizado para generar un micropattern. (B) superficies Micropatterned imparten control espacio-temporal de la fusión de macrófagos. Varias horas después de la aplicación de la IL-4, los macrófagos eran imágenes con contraste de fases. Tenga en cuenta la migración de células desde el interior de la rejilla en el micropattern. Fusión se observó solamente en el micropattern. Los guiones blanco delinear la extensión de un MGC. Tiempo se muestra en la esquina superior izquierda de cada micrografía como HH. Las barras de escala son 50 μm. (C) hoja de luz de celosía microscopia20 revela alta spatiotemporal dinámica de un macrófago extendiendo sobre una superficie adsorbidas de parafina. Color codifica la distribución de intensidad (amarillo es más intenso) de eGFP-LifeAct. Tiempo se muestra en la esquina superior derecha de cada micrografía como mm:ss. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Superficie: | ||||||
| Técnica | Parafina | Oleamide | Vaselina | Parafina de MP | Permanox | Limpia vidrio |
| contraste de fases | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| Brightfield | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| DIC | √ | √ | N/T | √ | x | √ |
| epifluorescencia | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| confocal | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| TIRF | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| Palma/dSTORM/GSDIM | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| SIM | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T |
| STED | N/T | √ | N/T | N/T | N/T | √ |
| LLSM | √ | N/T | N/T | √ | N/T | √ |
| Índice de fusión | intermedio | intermedio | intermedio | alta | intermedio | baja |
| Ubicación de fusión | al azar | al azar | al azar | define | al azar | al azar |
| MP-micropattern | ||||||
| DIC - contraste de interferencia diferencial | ||||||
| TIRF - fluorescencia de reflexión interna total | ||||||
| PALM - microscopía de localización fotoactivado | ||||||
| dSTORM - microscopia directa reconstrucción óptica estocástica | ||||||
| Agotamiento del estado seguido de molécula individual de GSDIM - volver | ||||||
| SIM - iluminación estructurada | ||||||
| STED - agotamiento de la emisión estimulada | ||||||
| LLSM - microscopia de luz hoja de enrejado | ||||||
| √ - compatible | ||||||
| x - incompatible | ||||||
| √ * - posible sólo con objetivos de inmersión, LWD y ampliación baja | ||||||
| N/T - no probado | ||||||
Cuadro 1: potencial de uso de cada superficie. Tenga en cuenta que las superficies plásticas impiden el uso de técnicas de imagen más.
1 Video suplementario: vista de contraste de fase tiempo-resolved de formación MGC. Tenga en cuenta la aparente sincronía de la formación del MGC. HH en la esquina superior izquierda muestra el tiempo. Es la barra de escala 50 μm. haga clic aquí para descargar este video.
Suplemento Video 2: microscopía de luz de enrejado de la hoja 20 de un macrófago sacados de tioglicolato eGFP-LifeAct extendiendo sobre una superficie de adsorción de parafina. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
La necesidad de identificar y desarrollar posteriormente las superficies de cristal de calidad óptica que favorecer la fusión de macrófagos derivan del hecho de que hasta hace poco no publicarse directamente visualizada fusión de macrófagos en el contexto de la vida de muestras3, 4. Esto es debido a que fusogénicas superficies plásticas que se utilizan requieren objetivos LWD y son en gran parte limitadas a la óptica de contraste de fase. Estas barreras fueron superadas por la ingeniería de una superficie de cristal de calidad óptica que no sólo había promovido extraordinarias tasas de fusión de macrófagos, pero que imparte un grado sorprendente de control espacial de la formación del MGCs.
Aunque esta tecnología permite el uso de técnicas de imagen avanzadas para controlar la fusión de macrófagos, no viene sin limitación. Aunque las superficies pulidas adsorbidas con hidrocarburos de cadena larga (por ejemplo, oleamide, cera de parafina, etc.) producen extraordinarias tasas de fusión de macrófagos en comparación con las superficies de plástico fusogénica, fusion sigue siendo un espacial estocástico proceso (figura 2). Esta limitación impide el uso de objetivos de gran aumento para visualizar la fusión con ejemplares vivos ya que es imposible predecir donde se producirá la fusión. Para superar esta limitación, nos micropatterned parafina para limitar el proceso de fusión a regiones previamente (figura 4; Video suplementario 1). Fusión de macrófagos a la micropattern el confinamiento espacial nos permitió predecir donde la fusión se utilizan por lo tanto más altos objetivos de ampliación para estudiar este evento muy animado.
¿Cuál es la importancia de la utilización de una superficie de calidad óptica que imparte control espacial de la fusión de macrófagos? En primer lugar, ya que estas superficies promoción altas tasas de fusión, es posible monitorizar la fusión de los especímenes vivos dentro de un plazo razonable. Esto es esencial en el caso de microscopía de fluorescencia, puesto que la mayor exposición de las células a la luz conduce al fotoblanqueo y fototoxicidad. En segundo lugar, estas superficies permiten avanzadas técnicas de imagen basadas en la fluorescencia o la polarización ser empleado (figura 4; Tabla 1; Video suplementario 1; Video suplementario 2). Por último, el control espacio-temporal que ofrecen las superficies micropatterned descritas en el presente Protocolo debe agilizar estudios destinados a identificar los mecanismos celulares y subcelulares que rigen la fusión de macrófagos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Queremos agradecer a miembros del laboratorio Ugarova y los investigadores en el centro de Biología Vascular y metabólica útil discusión de este trabajo. James Faust desea expresar su agradecimiento a los instructores en el curso de Biología Molecular europeo laboratorio Super resolución microscopia en 2015. Queremos agradecer los Satya Khuon en Janelia para ayuda con la preparación de muestras para LLSM. Durante la revisión y rodajes porciones de este trabajo James Faust fue apoyado por una beca de T32 (5T32DK007569-28). El componente de hoja de luz de celosía de este trabajo fue apoyado por el HHMI y la Betty y Gordon Moore Foundation. T.U. es financiado por los NIH grant HL63199.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
References
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
- Helming, L., Gordon, S. Molecular mediators of macrophage fusion. Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
