Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

استخدام ألوان جزيء واحد الحنق لدراسة الترابط بين تفاعلات البروتين

Published: January 30, 2018 doi: 10.3791/56896
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Institute of Physical Chemistry, University of Freiburg, 2Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

Summary

نقدم هنا، وضع بروتوكول للحصول على بيانات ألوان سمفريت وتحليلها مع فرقة 3D نموذج ماركوف المخفي. مع هذا النهج، يمكن استخراج العلماء المعلومات الحركية من نظم البروتين المعقدة، بما في ذلك كوبيراتيفيتي أو التفاعلات المرتبطة.

Abstract

جزيء واحد فورستر الرنين نقل الطاقة (سمفريت) أصبحت تقنية الفيزيائية مستخدمة على نطاق واسع لدراسة ديناميات الجزيئات الحيوية. للعديد من الأجهزة الجزيئية في بروتينات خلية يجب أن تعمل جنبا إلى جنب مع الشركاء التفاعل في دورة وظيفي إنجاز مهمتهم. التمديد اللونين إلى متعدد الألوان سمفريت يجعل من الممكن للتحقيق في وقت واحد أكثر من التفاعل أو تغيير كونفورماشونال. هذا ليس فقط يضيف بعدا جديداً إلى تجارب سمفريت ولكن كما يوفر إمكانية فريدة لمباشرة دراسة تسلسل الأحداث والكشف عن التفاعلات المرتبطة عند استخدام نموذج المعطل تداولها ومن الأسفار انعكاس داخلي الكلي مجهر (تيرفم). ولذلك، سمفريت متعدد الألوان أداة مرنة لدراسة المجمعات الجزيئية البيولوجية بطريقة كمية، وفي تفصيل سابقا لا يمكن تحقيقه.

هنا، نحن توضح كيفية التغلب على التحديات الخاصة لتجارب سمفريت متعدد الألوان على البروتينات. نقدم بروتوكولات مفصلة للحصول على البيانات واستخراج المعلومات الحركية. وهذا يشمل تتبع معايير الاختيار والفصل بين الدولة واستعادة مسارات الدولة من البيانات صاخبة باستخدام فرقة 3D نموذج ماركوف المخفي (هم). مقارنة بالأساليب الأخرى، المعلومات الحركية لا يتم استرداد من يسكن الوقت المدرج الإحصائي ولكن مباشرة من هم. إطار الحد الأقصى لاحتمال يسمح لنا لتقييم النموذج الحركي حاسمة وتوفير أوجه عدم اليقين ذات مغزى للمعدلات.

عن طريق تطبيق أسلوبنا لبروتين الصدمة الحرارة 90 (Hsp90)، نحن قادرون على تشابك الربط النوكليوتيدات والتغيرات العالمية كونفورماشونال من البروتين. وهذا يسمح لنا بمراقبة مباشرة كوبيراتيفيتي بين اثنين النوكليوتيدات ملزمة جيوب ديمر Hsp90.

Introduction

إنجاز العديد من البروتينات وظيفتها في مجمعات دينامية مع جزيئات أخرى، بوساطة التغيرات كونفورماشونال ورابطات عابرة على مجموعة واسعة من المقاييس الزمنية1،،من23. يقترن بمصدر الطاقة خارجي (مثل ATP) يمكن أن يؤدي إلى اتجاه في دورة وظيفي هذه التفاعلات الدينامية وفي النهاية الحفاظ على ثابت-حالة عدم التوازن في خلية، شرطا أساسيا للحياة.

أجل الفهم الكامل لهذه الآلات الجزيئية، وصف ثابتة يسترشد بدراسات الهيكلية غير كافية. وبالإضافة إلى ذلك، من الضروري الحصول على معرفة طراز الحركية الكامنة وتحديد الثوابت معدل الحركية. العديد من الأساليب القائمة السماح للباحثين بدراسة القوى المحركة للتفاعلات الثنائية بين اثنين من جزيئات الفائدة، مثلاً، السطحية مأكل مثل الطحين الرنين، وأساليب الاسترخاء مع قراءات الطيفية (مثلاً، القفز أو توقف تدفق تقنيات)، والرنين المغناطيسي النووي. ومع ذلك، قابليتها للتطبيق في معظم الحالات يقتصر على أنظمة الدولتين بسيطة (مثلاً، واحد محدد وإحدى الدول غير المنضمة) بسبب متوسط الملازمة للجزء الأكبر من التجارب. في الحالات التي تنطوي على مزيد من الدول أو وسيطة، أنها تعطي فقط خليط معقد من الثوابت معدل. يمكن استرداد طرق جزيء واحد مثل الملقط ضوئية أو مغناطيسية أو اللونين سمفريت و أي جهة مانحة و fluorophore يقبلون واحد، مع عينة المعطل تداولها سطح الثوابت معدل للجميع لاحظ التغييرات كونفورماشونال. ومع ذلك، عندما يتعلق الأمر بالتفاعلات التي تؤثر على موقع ربط واحد أو أكثر، هذه الأساليب لا تزال محدودة والمعلومات المتعلقة بالتفاعلات العلاقة المحتملة للاثنين (أو أكثر) سيكون متاحاً عن طريق الاستنتاجات غير المباشرة من مجموعة من التجارب فقط.

سمفريت متعدد الألوان4،5،،من67،،من89 يتيح الفرصة لدراسة التفاعل بين هذه المكونات مباشرة، في الوقت الحقيقي، وتحت 10من شروط قرب الفسيولوجية. وهذا يسمح أحد للتحقيق على سبيل المثال، ربط تعتمد على تكيف يجند أو البروتين8،،من911. النهج العام للمقدمة هنا لتسمية protein(s) الفائدة في مواقف محددة، تعلق بروتين واحد على سطح الدائرة بالقياس، وتتبع شدة الأسفار على مر الزمن في تيرفم نوع المنشور (للتفاصيل انظر 9 , 12). يمكن تحديده بالقرب المكاني من صبغات مختلفة ثم من نقل الطاقة بين البلدين. تصنيف استراتيجيات تختلف من البروتين للبروتين (استعرض في 13) وتوجد مبادئ توجيهية لتجنب القطع الأثرية في القياسات سمفريت14.

منذ صبغة الجهات مانحة قد نقل الطاقة إلى الأصباغ يقبلون مختلفة في تجربة سمفريت متعدد ألوان، الموضع النسبي لجميع الأصباغ غير قابل للوصول من الإثارة لصبغ واحد وحدها15،16. ولكن في تركيبة مع التناوب الإثارة الليزر (أليكس17، و استعرضت في 18) يوفر هذا الأسلوب جميع المعلومات الزمانية في الثانية الفرعية والقرار الفرعي نانومتر.

في رأس مال، حساب عالية الدقة يمكن أن يتحقق من المعلومات الهيكلية باستخدام المسافات بين صبغ من الجمع بين جميع الأسفار الكثافات في تجربة سمفريت متعدد ألوان مع أليكس. ومع ذلك، نركز هنا على تحديد هوية الدولة والانفصال، فضلا عن استخراج النماذج الحركية، حيث سمفريت متعدد الألوان أمر لا غنى عنه. عندما المطلوب هو "فقط" هيكل التصميم بالتثليث، مجموعة من التجارب سمفريت اللونين أبسط مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية يمكن أداء12،19.

ونحن نستخدم fluorescence جزئي (Equation 1) كوكيل لنقل الطاقة بين اثنين فلوروفوريس7. PF يحسب من الأسفار كثافة مماثلة لكفاءة الحنق تجربة اللونين:

Equation 2

فيها، Equation 3 الكثافة في الانبعاثات قناة م بعد الإثارة مع اللون السابق، وهو ج يقبلون مع الطول الموجي الأطول. وتمثل قنوات الكشف عن نفس الموقف في الدائرة عينة ولكن سجل نطاقات طيفية مختلفة من الضوء الفلورية. يتم استخدام نفس المعرف للإثارة والانبعاثات في هذا البروتوكول (أي، "الأزرق"، "الخضراء"، و "أحمر").

بسبب قصور تجريبية تعتمد كثافة fluorescence يقاس ليس فقط في نقل الطاقة ولكن أيضا على خصائص فلوروفوري والإعداد. بغية الحصول على كفاءة نقل الطاقة الحقيقية بين هذين فلوروفوريس، قد كثافات المقاسة ينبغي تصحيحها. يستند الإجراء التالي على المرجع9. عوامل التصحيح للتسرب الظاهر (lk، أي مكان مخصص للكشف عن الفوتونات من فلوروفوري في قناة لصبغ آخر) وغاما الظاهر (ag، أي العائد الكم الأسفار من الصبغة الكشف عن كفاءة القناة) تم الحصول عليها من آثار جزيء واحد تظهر يقبلون تبيض الحدث.

تسرب الصبغة المانحين في كل قناة يقبلون ممكن يتم حسابها من كافة نقاط البيانات في آثار fluorescence مسجل فيها مقصور صبغ يقبلون لكن الجهة المانحة لا تزال الفلورسنت (Equation 4):

Equation 5

الوسيط للرسم البياني التسرب كعامل التسرب الظاهر. بعد التصحيح للتسرب، يتم تحديد معامل جاما الظاهر من نفس المجموعة من آثار. فإنه يحسب بقسمة تغير الأسفار في قناة يقبلون على التغيير للأسفار في قناة المانحين على تبييض لصبغ يقبلون:

Equation 6

حيث c هو مرة أخرى قناة كشف يقبلون مع الطول الموجي الأطول. الوسيط لتوزيع الناتج كعامل التصحيح الظاهر.

يتم الحصول على كثافة تصحيحها في كل قناة من:

Equation 7

ثم يتم حساب الجبهة الوطنية استناداً إلى:

Equation 8

يمكن فصل مختلف قطاعات السكان في الفضاء المتعدد الأبعاد موزعة حسب PFs. الموقف وعرض كل دولة يتحدد باحتواء البيانات مع وظائف الضبابي متعدد الأبعاد. التحسين اللاحقة من هم عالمي واحد استناداً إلى جميع آثار PF يوفر وصفاً كمياً للحركية الملحوظة. حتى التغيرات الصغيرة معدلات قابلة للاكتشاف.

هممس توفر طريقة لاستنتاج نموذج دولة من مجموعة من آثار الوقت صاخبة. هذا النظام يعتبر أن في واحدة من مجموعة منفصلة، الدول المخفية في أي وقت من الأوقات والمراقبة الفعلية (أي الانبعاثات) دالة احتمالية لهذه الدولة الخفية20. في حالة البيانات سمفريت تيرفم، الانبعاثات الاحتمالات بأنا كل دولة وأنا يمكن أن تكون على غرار بوظائف مستمرة الكثافة الاحتمالية الضبابي. في نقاط زمنية منفصلة متباعدة بشكل منتظم، يمكن أن يحدث الانتقال من واحد إلى دولة أخرى وفقا لاحتمال انتقال الثابتة على الوقت ويعتمد فقط على الحالة الراهنة. مصفوفة الانتقال A يحتوي على هذه الاحتمالات الانتقال ij بين جميع الدول المخفية. توزيع الدولة الأولى Equation 9 يعطي على الاحتمالات الخاصة بالدولة Equation 10 لأول مرة نقطة تتبع الوقت. استخدام نهج الحد الأقصى-احتمال، يمكن تحسين هذه المعلمات لأفضل وصف البيانات مع الأمام-للخلف واوم-ولش خوارزميات20،21. وهذا ينتج المقدرات الحد الأقصى لاحتمال (MLE). وأخيراً، يمكن الاستدلال على تسلسل الدولة التي أنتجت على الأرجح مسار الملاحظات مع خوارزمية Viterbi. خلافا لغيرها من التحليلات هم سمفريت البيانات24،،من25إلى26 نحن لا نستخدم هم كمجرد "تجانس" من البيانات ولكن استخراج نموذج الدولة الحركية من مجموعة البيانات بدون الحاجة لتركيب الوقت يسكن 27من رسوم بيانية. ويتم تحليل هم مع البرامج النصية الداخلية باستخدام برو إيغور. ويستند تنفيذ المدونة مرجع21. نحن توفير مجموعة البرمجيات والبيانات النموذجية على لدينا صفحة ويب كي تتبع القسمين 5 و 6 من هذا البروتوكول (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). البرنامج الكامل متاح عند الطلب.

الوقت النقاط في البيانات مع الجبهة الوطنية <-1 أو PF > يتم تعيين 2 في أي قناة الكشف عن احتمال انبعاث الحد الأدنى لجميع الدول (10-200). وهذا ما يمنع التحولات المصطنعة في نقاط البيانات هذه.

يتم الحصول على المعلمات لاحتمالات الانبعاثات من تناسب الرسم البياني PF 3D مع وظائف الضبابي كما هو موضح في الخطوة 5، 7. وتحفظ هذه المعلمات ثابتة خلال الاستغلال الأمثل هم.

في النهج الذي قدم، تستخدم مصفوفة الانتقال وناقلات توزيع الدولة الأولى عالمياً لوصف فرقة كاملة من آثار. يتم تحديثها استناداً إلى جميع الجزيئات N من مجموعة البيانات وفقا لمرجعية27.

يتم تحديد معلمات البدء لتوزيع الدولة الأولى من إسقاطات 2D من الرسم البياني PF (الخطوة 5، 3) واحتمالات الانتقال يتم تعيين إلى 0.05 استثناء الاحتمالات البقاء في الدولة نفسها، التي يتم اختيار هذه أن احتمال مغادرة دولة معينة هو تطبيع للوحدة.

يتم استخدام أسلوب تنميط احتمال إعطاء فواصل الثقة (رابطة الدول المستقلة) لكل مرحلة انتقالية معدلات21،22، التي تكون بمثابة تقديرات ذات مغزى لعدم اليقين. لحساب حدود كاريتاس الدولية لمعدل معين، هو ثابت احتمال انتقال الاهتمام إلى قيمة أخرى MLE. وهذا ينتج λ نموذج اختبار '. اختبار نسبة (LR) احتمال من احتمالات Equation 16 نظراً لمجموعة البيانات تتم 0 استناداً إلى:

Equation 11

الثقة 95% ملزمة للتوصل إلى المعلمة عندما يتجاوز LR 3.841، كانتيل 95% من س2-التوزيع مع واحد من22،درجة من الحرية23.

هو أظهرت قوة الأسلوب باستخدام في Hsp90. هذا البروتين وفيرة وجدت في البكتريا، وحقيقيات النوى، وهو جزء من استجابة الإجهاد الخلوية28. وهدف المخدرات واعدة في علاج السرطان29. Hsp90 هوموديمير مع جيب ملزم النوكليوتيدات واحدة في المجال الطرفي ن لكل وحدة فرعية30. أنه يمكن أن يخضع للتحولات بين اثنين على الأقل والتشكلات متميزة على الصعيد العالمي، واحدة مغلقة و أحد الطرفي ن تكيف مفتوحة، على شكل V،19،31،32. طبيعة dimeric مباشرة يثير مسألة التفاعل بين هذين الموقعين النوكليوتيدات ملزمة في Hsp90.

في ما يلي، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة للحصول على البيانات وتحليلها لتجربة ألوان سمفريت الخميرة Hsp90 والنوكليوتيدات. ربط تعتمد على تكيف PNP أمبير المسمى فلوريسسينتلي (PNP أمبير *، النظير غير هيدروليزابل من ATP) يتم تحليل. تطبيق الإجراء وصف تصاريح دراسة الربط النوكليوتيدات، وفي نفس الوقت التغييرات كونفورماشونال من Hsp90 ومما يكشف عن كوبيراتيفيتي بين اثنين النوكليوتيدات ملزمة جيوب Hsp90.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-الإعداد والشروط المسبقة

  1. إجراء القياسات سمفريت متعدد الألوان على تيرفم نوع المنشور. وصف إعداد اللونين كما يرد منشور جوف مرجع12.
    1. بناء تيرفم متعدد ألوان. بالتفصيل تخطيط عام في 9.
    2. استخدام التحويل، ضخ صمام ثنائي ليزر الحالة الصلبة موجات مستمرة، مما يغني عن استخدام مصاريع الميكانيكية في مسارات الإثارة.
    3. توظيف المنشور غير المتماثلة، وممدود يمنع انعكاس شعاع الإثارة من الجانب الخلفي لإدخال الهدف مرة أخرى.
    4. استخدام عدسات والسليكا فوسيد اللاصقة متعامي 2 بوصة في مسارات الكشف الذي جمع الكثير من الضوء قدر الإمكان ومنع السيارات-الأسفار والانحرافات، مثلاً، من التشوهات في مناطق خارج مركز الصورة.
    5. تركز كل مسار الكشف على الرقاقة امككد مع عدسة منفصلة. يسمح هذا التركيز الأمثل لكل قناة الكشف.
      تنبيه: تستخدم فئة 3B أشعة الليزر في تيرفم. وهذا يعني أنها خطرة إذا العين يتم كشفها مباشرة، ولكن الأفكار المتفرقة غير ضارة. ضمان الامتثال لليزر احتياطات السلامة وفقا للوائح الحكومية المحلية قبل أن يتم تشغيل النظام.
  2. تحديد عوامل التصحيح لخصائص الإعداد و fluorophore مسبقاً باستخدام عينات دسدنا.
    1. استخدام عينة دسدنا الحنق عالية واحدة لكل صبغة في تركيبة مع يقبلون وجود الطول الموجي الإثارة أطول (للإعداد المقدمة: Atto488-Atto647N، Atto550-Atto647N، Atto594-Atto647N). تأكد من أن بالإضافة إلى ذلك يتم تعديل الحمض النووي مع بيوتين.
    2. تمييع العينة إلى 5 نانومتر مع تنم المخزن المؤقت (5 ملم تريس pH 7.5، 5 ملم كلوريد الصوديوم، 20 مم مجكل2) و 2 مم ترولوكس (استخدم هذا المخزن المؤقت أيضا للقياس).
    3. شل دسدنا كما هو موضح ل Hsp90 في الخطوات 2.5 و 2.7.
    4. حساب عوامل تصحيح التسرب الظاهر (lk) وجاما (ag) الظاهر من آثار جزيء واحد تظهر حدث تبيض يقبلون.
  3. بناء حجرة تدفق شطيرة شريحة الكوارتز تخميلها الوتد/البيوتين-شماعة، طبقة رقيقة هو مادة لاصقة على كلا الجانبين، وكشف الغطاء. لتفاصيل البروتوكولات لتنظيف الكوارتز الشرائح والتخميل انظر المرجع9.
    1. مرو سميكة (3 مم) استخدام الشرائح لمنع هندسيا جمع ضوء الليزر المنتشرة في الواجهة الكوارتز-الجلسرين-الكوارتز بين المنشور والشريحة الكوارتز فونكتيوناليزيد.
    2. استخدام رقيقة (40 ميكرومتر) ختم الفيلم الذي يتم رشها بمادة لاصقة على الجانب غير لاصقة. الفيلم رقيقة يقلل المسافة بين جزيئات السطح-المرفقة والهدف. الحرارة إلى 80 درجة مئوية ثم اضغط على.
    3. ضع بكشف الغطاء في الأعلى. الحرارة إلى 80 درجة مئوية ثم اضغط على. استخدم قطره والغليسيرول عند وضع الدائرة تدفق على المنشور.
      ملاحظة: المواد المنشور والشرائح الكوارتز، فضلا عن والغليسيرول الفهرس المطابقة.
  4. وأعرب عن Hsp90 من Saccharomyces cerevisiae في شكل طفرات نقطة سيستين واحد اثنين في المواقف التي D61 أو Q385. إضافة فكرة لفائف ملفوف ج--المحطة طرفية لمنع تفكك ديمر تركيزات بيكومولار. تسمية بروتينات متحولة كل على حدة وتبادل مونومرات للحصول على هيتيروديميرس المسمى Atto488 في موقف من الأحماض الأمينية 61 و Atto550 في الحمض الأميني موقف 3859.

2-قياس

  1. بدء تشغيل برنامج الكاميرا وتعيين معلمات التصوير كما هو موضح أدناه:
    1. ضبط درجة حرارة لاستشعار التبريد منخفضا قدر الإمكان (-95 درجة مئوية مع تبريد المياه الخارجية) لتقليل الضوضاء الحالية الظلام.
    2. استخدام إعدادات الكاميرا التي هي الأمثل لتسجيل جزيء واحد: 3.3 المايكروثانيه سرعة الانتقال الرأسي، الجهد العادي عمودي على مدار الساعة، 17 ميغا هرتز 16 بت أفقي تلا، قبل التضخيم كسب 3، اكتساب إلكترون مضاعف 1,000.
    3. قم بتحريك للحصول على "الخارجية" ووقت التعرض للسيدة 70 سجل الأفلام بطول 750 اقتناء دورات.
      ملاحظة: إيقاف تشغيل ضوء الغرفة عندما يتم الحصول على الكاميرا لمنع تشبع من أجهزة الاستشعار امككد.
  2. قم بإنشاء مجلد على فرقة محلية للقياس. في البرنامج تذهب إلى رايدر < الحفظ التلقائي > إعدادات وتمكين الحفظ التلقائي < > واختر تنسيق ملف "المشاجرة" للحصول على الفيلم. حدد مجلد على فرقة كموقع الحفظ التلقائي.
  3. بدء تشغيل البرامج التي مصاريع عامل تصفية الانضباطي المراقبة البصرية أكوستو (أوتف)، والبرنامج الذي يتحكم في العملية الليزر والبرنامج المشغل يقوم بمزامنة الليزر، أوتف، في الكشف عن المسار، والكاميرات. ضبط السلطة الليزر مع أوتف (ca. 3 ميغاواط قبل إدخال منظور) وتحميل نمط تحريك الصحيح.
  4. جبل صاحب العينة مع المنشور وقاعة تدفق وإرفاق الأنابيب ووضع أنابيب مدخل في كأس ميكروسينتريفوجي وتوصيل الأنابيب منفذ لمضخة الحقن. مسح الدائرة مع حوالي 150 ميليلتر العازلة، ومحاذاة الإثارة شعاع، والتركيز. بليتش أي ملوثات الفلورسنت على السطح التي تتحرك ببطء على الكشف عن كامل نطاق الشريحة مع قوة ليزر حوالي 10 ميغاواط لكل أجهزة الليزر. وهذا يأخذ حوالي 1 ساعة.
    ملاحظة: إذا لم ينص على خلاف ذلك، يحتوي المخزن المؤقت المستخدمة 40 مم هيبيس درجة الحموضة 7.5، 150 مم بوكل، و 10 مم مجكل2.
  5. تدفق ما يقرب من 300 ميليلتر لحل نيوترافيدين (0.25 مغ/مل في المخزن المؤقت) في الدائرة واحتضانها للحد الأدنى 1 تدفق خارج نيوترافيدين غير منضم مع ميليلتر المخزن المؤقت وتدفق ما يقرب من 300 من حل جيش صرب البوسنة (0.5 ملغ/مل في المخزن المؤقت) عن طريق الدائرة.
    ملاحظة: هذه الكتلة المتبقية الروغان السطحية العيوب من الامتزاز غير محدد لجيش صرب البوسنة إلى السطح.
  6. شل العينة عن طريق تحميل الدائرة تدفق مع حوالي 150 ميليلتر من بيوتينيلاتيد والمسمى Hsp90 في ارتفاع تركيزات (مخففة في المخزن المؤقت + 0.5 ملغ/مل جيش صرب البوسنة) حتى يتم التوصل إلى كثافة سطحية كافية، وهي عادة ما تكون الحالة بتركيز من 5-10:00 م. تغسل البروتين غير منضم مع حوالي 300 ميليلتر العازلة + 0.5 ملغ/مل جيش صرب البوسنة.
  7. تدفق في 150 ميليلتر من 25 نانومتر PNP أمبير * في المخزن المؤقت + 0.5 ملغ/مل جيش صرب البوسنة. وليكن احتضانها لمدة 5 دقائق وكرر هذه الخطوة مرة واحدة لضمان تركيز النوكليوتيدات الصحيح.
    ملاحظة: لإجراء التجارب على حضور إضافية، غير مسمى PNP أمبير، أيضا إضافة ميكرومتر 250 أمبير PNP.
  8. تبدأ بالحصول على البيانات. لمبلغ مناسب للبيانات الحصول على حوالي 20 الأفلام التي تأخذ حوالي 1.5 ساعة.
    1. نقل موضع قاعة نموذج عمودي على شعاع الإثارة مع السائر بيزو لتغيير مجال الرؤية.
    2. ضبط التركيز مع z-بيزو يتحكم ارتفاع الهدف إذا لزم الأمر. يجب أن لا يكون هذا ضروريا في كثير من الأحيان عندما شنت قاعة القياس دون الميل.
    3. إعداد تسجيل الكاميرات بالضغط على < "تأخذ إشارة" > برنامج الكاميرا وبدء دورات الإثارة/اقتناء استخدام الزر < ابدأ > في البرنامج المشغل. ويبدأ هذا الحصول على كثافة الأسفار.
  9. إجراء تسجيل قناة بتسجيل أول فيلم مع الخرز الفلورسنت التي تظهر الأسفار الانبعاثات في النطاق الطيفي لجميع قنوات الكشف عن برنامج الإعداد. ثم الكشف عن مواقف حبة في الفيلم المعايرة عن طريق البحث عن البقع ألمع وتحديد موقف وسط من ضبابي تلائم الشخصية كثافة. حفظ إحداثيات الخرز التي تم العثور عليها في جميع القنوات وتناسب كلا تعيين الإزاحة في العاشر--وفي اتجاه-ص مع متعدد حدود 2D من درجة ثلاثة9.

3-اختيار آثار جزيء واحد

  1. ويتم تحليل البيانات مع البرامج النصية الداخلية باستخدام برو إيغور. تحميل كافة البرامج النصية الضرورية عن طريق فتح "iniTIRF.ipf"، وحدد النوع الصحيح من التجربة.
    ملاحظة: في ما يلي، < الزر > تحديد عناصر قابلة للنقر في القائمة أو في واجهة المستخدم. يتم الإشارة إلى استدعاءات دالة في علامات اقتباس، مثل "طباعة" Hello World "". يمكن لصق هذه الأوامر في سطر الأوامر للمحترفين إيغور (بدون علامات اقتباس مضمنة).
  2. تأكد من أن يتم تحميل المعلمات لتسجيل القناة الكشف.
  3. بدء تشغيل واجهة المستخدم الرسومية بواسطة النقر فوق < سمفريت جديدة | تحليل واجهة المستخدم الرسومية >.
  4. تحميل الأفلام (أي تسلسل الإطارات مع 512 × 512 بكسل مخزنة كرزمة TIFF 16 بت) التي تعقد الكثافة في القنوات الخاصة بكل منها. القيام بذلك بالضغط على الزر < "تحميل الفيلم" > وتحديد الملفات من الكاميرات ما يسمى "سيد" و "الرقيق" واحداً تلو الآخر.
  5. تحديد مواقف الجزيئات الوحيدة المحتملة عن طريق البحث عن البقع ألمع في مجموع الإطارات الخمسة الأولى في الكشف عن قناة معينة. حساب مواقف المقابلة في جميع قنوات الكشف عن غيرها من تعيين القناة. للحصول على تتبع كثافة الأسفار، مجموع كثافة بكسل مربعا حول المكانة المركزية لكل إطار. القيام بذلك عن طريق الضغط على الزر < "العثور على آثار" > في واجهة المستخدم الرسومية.
    ملاحظة: طول الجانب على الساحة (بكسل) وترد عليه: 2 * < مجموع Pxs > + 1.
  6. لكل جزيء، حساب تتبع كثافة خام مشتركة كمجموع لجميع آثار هذا المكان بنفس لون الإثارة. تقييم الشخصية كثافة جزيء في جميع القنوات للمعايير التالية:
    1. هضبة مسطحة تقريبا في كثافة الخام مشتركة وتبيض واحدة خطوة لجميع ألوان الإثارة، والسلوك أنتيكوريلاتيد في قنوات الكشف الملائمة، والكشف عن ومضان أحمر (تشير إلى الحنق على أمبير-PNP منضم *) مرة واحدة على الأقل داخل تتبع، وأية خطوات متعددة في ومضان أحمر، مما يدل على وجود اثنين PNP أمبير * منضمة إلى واحد Hsp90 ديمر.
  7. حفظ آثار fluorescence الحال لمزيد من التحليل في حالة الوفاء بهذه المعايير. القيام بذلك بتحديد التتبع مع المؤشر ثم الضغط على الزر < حفظ > في الرسم البياني "الجدول الزمني". يدوياً فحص آثار كثافة في جميع قنوات الكشف عن ثلاثة بعد الإثارة الأزرق لحوالي 200 من الجزيئات للفيلم الواحد.

4-حساب لآثار Fluorescence جزئي

  1. عرض كل آثار شدة الأسفار لواحدة من الجزيئات المحفوظة. استخدام المؤشرات في الرسم البياني لتحديد النطاقات الزمنية.
  2. حدد فترة الزمنية حيث يتم المبيضة fluorophores جميع فعلا. كثافة الخلفية يعني يحسب من هذا النطاق وطرح من التتبع كثافة في كل قناة. القيام بذلك عن طريق الضغط على الزر < الخلفية >.
  3. حدد نطاق الكفاءة الحنق، حيث يقل كلا الأصباغ تعلق على Hsp90 (Atto488 و Atto550) موجودة. تأكد من استبعاد آثار تحتوي على حدث وامض (انظر الشكل 3). هذه الأحداث تتميز كثافة fluorescence المقحمة في قناة واحدة دون حدوث زيادة مصاحبة في أي قناة أخرى.
  4. حساب آثار PF . القيام بذلك عن طريق الضغط على الزر < احسب PF >. يتم تطبيق عوامل تصحيح المعرفة مسبقاً للتسرب الظاهر (lk) وغاما الظاهر (ag) لكثافة الخام بغية تصحيح للصورة المادية وإعداد خصائص.

5-السكان اختيار وتركيب الرسم البياني ثلاثي الأبعاد

  1. إزالة الجزيئات التي تظهر نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة في آثار PF . تتم إزالة الجزيئات التي تتجاوز الفاصل الزمني [-1؛ 2] في أي تتبع PF لأكثر من 10% الإطارات من مجموعة البيانات. القيام بذلك قبل تنفيذ "RemoveTracesLowSNR()" من "إطار الأوامر".
  2. حساب الإسقاطات 2D إهمال البيانات PF . الأرض Equation 12 على Equation 13 و Equation 14 على Equation 13 في النطاق [-0.5؛ 1.5] مع قرار سلال 100 × 100. للقيام بذلك، تنفيذ:
    1. "HistFret2D (" r_b "،" r_g "، بينهيست = 100)"
    2. "HistFret2D (" r_b "،" g_b "، بينهيست = 100)؛ 553.5 MoveWindow، 42.5، 1055.25، 508.25 "
  3. تحديد السكان النسبي لكل دولة يمكن تمييزها في 2D الإسقاطات.
    1. إحضار الرسم البياني المناسب إلى الأمام وتنفيذ "panelHist2DCount()".
    2. اضغط على الزر < Init > ورسم مضلع خالية من ناحية حول الذروة.
    3. انقر فوق الزر < Count >. يتم طباعة عدد نقاط البيانات في المضلع، والعدد الإجمالي لنقاط البيانات في الإسقاط في "إطار الأوامر".
  4. إعداد رسم بياني ثلاثي الأبعاد للبيانات الجبهة الوطنية المنفذة "HistFret3D (" g_b "،" r_b "،" r_g ")".
  5. تطبيع الرسم البياني ثلاثي الأبعاد ليتجزأ 1. تنفيذ ما يلي:
    1. "Fit0 نيوداتافولدير/S"
    2. "مكررة/س:: بكى: Hist3D، Hist3D"
    3. "Div/G متغير = sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0)) ^ 3"
    4. "Hist3D/= div؛ شعبة الطباعة "
  6. توفر المعلمات الأولية غاوسي 3D تناسب وإعداد هياكل البيانات اللازمة.
    1. تنفيذ "Gauss3D_initParam()؛ تحرير W_coef_old ".
    2. إضافة سكان الدولة إلى نهاية الموجه المعلمة.
    3. تنفيذ "Gauss3D_prepareFit()."
      ملاحظة: W_coef_old هو موجه الذي يحمل المعلمات الأولية للاحتواء. وهذا يعني كل دولة Equation 15 وسكان الدولة، التي هي متصلاً بنهاية الموجه. تأكد من أن مصفوفة التباين المشترك متماثل.
  7. تتناسب مع مجموع وظائف غاوسي 3D S إلى الرسم البياني PF 3D، مع S يجري العدد الدول يمكن تمييزها.
    1. تنفيذ "do3D()." وهذا قد يستغرق ساعة أو أكثر في مكتب عادي PC، اعتماداً على نوعية المعلمات الأولية.
    2. تنفيذ "postprocessFitMultiGauss3D()؛ evalFitMultiGauss3D()؛ تحرير W_coef ".
  8. عرض النتيجة مناسباً. لكل من هاتين 2D الإسقاطات، استخدم الأوامر التالية:
    1. "contourPF3D_new(0)؛ contourPF3D_new(1)؛ contourPF3D_new(2)؛ contourPF3D_new(3)؛ contourPF3D_new(4) "
    2. "contourPF3D_colorize()"

6-الحركية التحليل مع فرقة 3D هم

  1. إعداد فرقة هم تشغيل لاستخراج المعلومات الحركية. هم واحد هو الأمثل من جميع الجزيئات في مجموعة البيانات. استخدام المعلومات التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة لتحديد الموقف وعرض كل دولة في الفضاء PF 3D.
    1. تهيئة واجهة المستخدم هم (< هم | Init هم >) واختر العدد المناسب من الدول (وهذا يعني في حالة البيانات Hsp90 < نومستاتيس > = 5)، وعدد من الأبعاد لإشارة الإدخال (< نومديمس > = 3)، ونوع المدخلات (< "نوع الإدخال" > = "الحنق bgr 3D").
  2. تحسين المعلمات هم بترك البرنامج تتلاقى احتمال هم (تنفيذ "prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1)،-14)") حتى يقع التغيير في مصفوفة الانتقال بالمقارنة مع التكرار السابق عن عتبة (10-14 مجموع التغير المطلق لكل احتمال انتقال). وهذا ينتج MLE لاحتمالات الانتقال في حوالي ساعة في مكتب الكمبيوتر عادي.
  3. كرر اختيار السكان وتركيب الضبابي، والتحسين هم مجموعات فرعية البيانات (على سبيل المثال، 75% من مجموعة البيانات بالكامل). إذا تم دمج مجموعة البيانات بالكامل من تجارب مختلفة، كرر التحسين أيضا لكل من هذه التجارب واحدة. ويسمح تحليل لمجموعات فرعية لتقدير عدم التيقن من التحديد اليدوي السكان والتباين داخل مجموعة البيانات.
  4. حساب كاريتاس الدولية لاحتمالات الانتقال، تقرير عن عدم تجانس مجموعة البيانات والدقة في هم.
    1. الحصول على تقدير تقريبي لحدود CI المنفذة "القرص المضغوط $(الجذر: path3Dimport +" هم ")؛ loop_getCI_estimate_limits(). "
    2. حساب حدود الضبط من كاريتاس الدولية المنفذة:
    3. "loop_getCI_HMM_converge(1)"
    4. "CIresults_conv_new()"
    5. "مؤتمر نزع السلاح:: HMM_CIresult؛ reportCI_conv() "
    6. "مؤتمر نزع السلاح:: cmp_CI_conv؛ CI_plot2 ("هم"، دوابيند = 0) "
  5. تلخيص المعلومات المتاحة لتبسيط التفسير الحركية.
    1. جمع معلومات حول الوقت النوكليوتيدات مسمى يبقى منضم إلى Hsp90. القيام بذلك بانهيار الدول المنضمة للحزب الوطني التقدمي أمبير * (أي، ق1وق2 وق3، انظر أيضا الشكل 2)، وتجميع الرسم البياني الوقت يسكن. تنفيذ "القرص المضغوط $(الجذر: path3Dimport +" هم ")؛ collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0}) "، الذي يجمع بين يسكن من الدول S0 و S4 ، فضلا عن ق1وق2ق3.
    2. استخراج الأوقات يسكن من المسار Viterbi لكل دولة للفائدة ومقارنة الرسم البياني الوقت يسكن الناتجة عن ظروف تجريبية مختلفة. تنفيذ "plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1)."
    3. بالنسبة لصورة أكثر تفصيلاً، انهيار الدول التي متميزة PF لكن متطابقة وظيفيا لتسهيل مواصلة تحليل البيانات، مثلاً، في حالة تجربة ألوان مع المسمى Hsp90 والنوكليوتيدات والدول S2 S 3 يمكن أن تكون مطوية. تنفيذ "collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4})."

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تسمح القياسات سمفريت متعدد الألوان مباشرة الكشف عن العلاقة المتبادلة بين اثنين أو أكثر من مواقع التفاعل متميزة. وهذا يجعل التقنية فريدة من نوعها للتحقيق في نظم متعددة العناصر، مثل مجمعات البروتين. علينا أن نركز على عرض تجربة ألوان سمفريت هنا، هو بمثابة مثال توضيحي.

سير العمل العامة للأسلوب الذي يظهر في الشكل 1. الجزء الأول يشمل تسجيل البيانات سمفريت متعدد الألوان في مجهر TIRF نوع المنشور. استراتيجية مرفق السطحية والخطط للإعداد يرد في الشكل 2 ألف. للحصول على وصف أكثر تفصيلاً للإعداد، تشير إلى مرجع9. الجزء الثاني من طريقة عرض يركز على تحليل البيانات. آثار كثافة fluorescence المثالية مبينة في الشكل 2. وقت مناسب يتتبع العرض: (ط) خطوة تبيض واضحة لكلا فلوروفوريس تعلق على Hsp90، كثافة (ثانيا) شقة الهضاب، (ثالثا) مكافحة يرتبط السلوك في قنوات المقابلة، والحدث الملزم (رابعا) واحد على الأقل من الحزب الوطني التقدمي أمبير * (الشكل 3). واختير أكثر من 400 من الجزيئات التي تفي بمعايير الاختيار تسفر عن إحصاءات موثوق بها. في نظام الدراسة، يمكن التمييز بين الدول الخمس بكثافات الأسفار، مع أربع دول يجري متميزة وظيفيا (الشكل 2).

من شدة الأسفار تحسب آثار fluorescence جزئي (PF، تمديد كفاءة الحنق للتجارب سمفريت متعدد الألوان) يمكن أن يكون (الشكل 4 أ). PF تتصل بالقرب من الأصباغ. وفي تجربة ألوان سمفريت، يمتد البيانات مساحة ثلاثية الأبعاد (الشكل 5 (ب)). إسقاطات على الرسم البياني 3D 2D أثبتت أن تكون مفيدة لفصل الدولة (الشكل 4 باء، جيم). في تجربة ناجحة، جميع الدول التي يتوقع نظرياً الظروف التجريبية التطبيقية يمكن تمييزها بهذه الجبهة الوطنية في 2D الإسقاطات.

السكان النسبي للدول تتحدد من إسقاطات 2D رسم المضلعات خالية من ناحية أن أرفق الذروة (الشكل 5). تم العثور على هذا النهج لتكون دقيقة وموثوق بها9. يتم الحصول على احتمالات انبعاث هم باحتواء الرسم البياني PF 3D مع مجموع وظائف 3D الضبابي، حيث S هو عدد الدول يمكن تمييزها (خمسة في القضية المعروضة؛ الشكل 5). هذا مناسباً تلتقي بشكل صحيح، إلا السكان النسبي فأنا من كل دولة وأنا لم يعقد ثابتة بينما أحرار في الموقف وعرض جوسينس.

فرقة واحدة هم هو الأمثل عبر مجموعة البيانات بالكامل مع احتمالات الانبعاثات الثابتة للمعلمات التي تم الحصول عليها من احتواء الضبابي (الشكل 6). من أجل الحصول على مقياس لعدم التيقن احتمالات انتقال المستخرجة، CI 95% لكل انتقال تحديد (الشكل 7).

وبالإضافة إلى ذلك، أن متوسط الوقت الذي النوكليوتيدات مراسل المسمى PNP أمبير * يمكن استخراج رفات منضمة إلى Hsp90 تحت ظروف تجريبية مختلفة (الشكل 8 أ). وهذا يساعد على الحد من زيادة تعقيد النتائج. للقيام بذلك، الدول التي تمثل الحزب الوطني التقدمي أمبير * هي انهارت والتشكلات المنضمة وغير المنضمة في مسارات الدولة، على التوالي. من هذا الوقت يسكن متوسط للحزب الوطني التقدمي الامبير * الانفصال يمكن أن تحسب (8B الشكل).

وبمقارنة الحركية في الغياب ووجود إضافية، يمكن الحصول على المعلومات غير مسمى PNP أمبير، فريدة من نوعها حول العلاقة بين التغيرات كونفورماشونال من Hsp90 والدولة النوكليوتيدات. وهذا يجعل من الممكن لمباشرة دراسة كوبيراتيفيتي بين اثنين النوكليوتيدات ملزمة جيوب Hsp90. وإلى جانب ذلك، أنها تلتف الحاجة إلى تجارب المعايرة التي تقيس احتلال موقع ملزمة كدالة تركيز الركازة (مثلاً، قطع هيل). لنظم ديناميكية عالية البروتين مثل Hsp90، أن هذا النهج أيضا حساس للتغيرات الصغيرة في معدلات11.

Figure 1
الشكل 1 : سير العمل العامة للحصول على البيانات وتحليلها. هو الحصول على بيانات عن مجهر الأسفار انعكاس داخلي الكلي متعدد ألوان سمفريت (تيرفم). بعد اختيار تتبع وحساب fluorescence جزئي (PF)، يتم تصنيف 3D PF المدرج التكراري وإسقاطات 2D منه. استخدام الإسقاطات 2D، يمكن تحديد عدد سكان جميع الدول يمكن تمييزها. تستخدم هذه كقيد ضبابي 3D يصلح للرسم البياني PF . وظائف الكثافة الاحتمالية الضبابي بمثابة الانبعاث الاحتمالات للفرقة 3D اللاحقة مخفية ماركوف النمذجة (هم). وهذا ينتج الوصف الحركي للنظام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : مخطط للحصول على البيانات. الرسم التخطيطي (A) درس نظام يتألف من ديمر Hsp90 (الأشكال البيضاوية الصفراء تمثل بنية المجال) يعلق على السطح مع التسميات Atto488 (أزرق) و Atto550 (الأخضر) والنوكليوتيدات مراسل PNP أمبير * المسمى في الحل، مع Atto647N (أحمر). وتسجل البيانات على مجهر TIRF نوع المنشور مع الليزر الإثارة (أليكس) بالتناوب. (ب) آثار كثافة (int. fl.) الأسفار المثالية بعد الإثارة الأزرق والأخضر. الصور التوضيحية (ج) الدول conformational يمكن تمييزها في Hsp90 (S0، ق1، ق2، ق3، S4) وعلى معرف كل منهما للدولة الوظيفية (س، ج، س *، ج *) المستخدمة في هذا العمل. يشير إلى مواقف فلوروفوري الأزرق والأخضر والأحمر. اثنين من السكان تمثل نفس الحالة الوظيفية، وهي فتح Hsp90 مع الحزب الوطني التقدمي أمبير * ملزمة (ق2 وق3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : معايير الاختيار- (أ) ألف جزيء المختارة لإجراء مزيد من التحليل. (ب، ج) عدم تحديد الجزيئات لمزيد من التحليل. (ب) لا الهضاب المسطحة و Atto550 في حالة الظلام حوالي 30 ثانية بعد الإثارة الخضراء (المشار إليها بواسطة الأسهم). (ج) تبيض عدة خطوات بعد الإثارة الخضراء (المشار إليها بواسطة الأسهم). Int. سائلة: كثافة الأسفار، الأزرق: Atto488، الأخضر: Atto550، Atto647N الحمراء، ت: الإثارة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : الحساب من آثار PF ورسوم بيانية الممثل. (أ) الأسفار الممثل كثافة (int. fl.) آثار وآثار fluorescence جزئي (PF) المطابق. (ب) اثنين إسقاطات 2D 3D الرسم البياني PF للقياس في غياب النوكليوتيدات إضافية، غير مسمى. (ج) نفس إسقاطات التجربة حضور إضافية مكم 250 أمبير PNP. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : عملية اختيار السكان. (أ) موقف خمس السكان يمكن تمييزها في 2D الإسقاطات اثنين. (ب) نسخة من الصور التوضيحية في الشكل 2. (ج) مؤامرة مبعثر 3D الممثل لبيانات الجبهة الوطنية . تلوين نقاط البيانات فقط للتصور. يتم استخدام نفس رمز اللون كما هو الحال في ب. (د) تحديد السكان النسبي يتم عن طريق رسم المضلعات خالية من ناحية حول القمم في 2D الرسم البياني. باستخدام مزيج من الإسقاطات اثنين هو مبين في الشكل 3، يمكن التمييز بين كل خمسة من السكان. (ه) نتائج غاوسي 3D يصلح للرسم البياني للبيانات PF المبينة في ديبيكتيد أ هي إيسوسورفاسيس في فوم، التي تمثل خمس سكان مختلف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : مخطط التدفق الأمثل هم فرقة 3D- نموذج واحد هو الأمثل لجميع الجزيئات من مجموعة البيانات. يتم إعطاء القيم ابدأ بنموذج الإدخال (مع عدد محدد سلفا من الدول). يتم تصنيف احتمال النموذجي النظر إلى البيانات (3D آثار PF ) مع خوارزمية الأمام-للخلف (إف ب). الخوارزمية باوم-وولش (الأسلحة البيولوجية) غلة تقدير احتمالات الحد أقصى محلية (MLE) للمعلمات. MLE العالمية ثم يمكن العثور على شكل تكراري. خوارزمية Viterbi يحسب مسار الدولة الأكثر ترجيحاً نظراً لنموذج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 : تقدير عدم اليقين ذات مغزى مع CI. (أ) تحديد CI لواحد ثابت معدل المثالية. يتم حساب نسبة احتمال (LR) نموذج الاختبار مقارنة بالحد الأقصى لاحتمال مقدر (MLE) نموذج في المنطقة المحيطة MLE لمعدل ثابت. الثقة 95% الالتزام هو الذي تم التوصل إليه عندما يتجاوز LR 3.841 (خط رمادي داكن الأفقي). (ب) معدل المستخرج الثوابت دون النوكليوتيدات إضافية (أحمر) ومع أمبير PNP (أزرق) وعلى 95% CI. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8 : يسكن المتوسط وقت النوكليوتيدات مراسل PNP أمبير * أمده متجهة إلى Hsp90 في وجود إضافية النوكليوتيدات. (أ) الرسم التخطيطي للانفصال الملحوظ للمسمى PNP أمبير * من ديمر Hsp90، بلغ متوسطها خلال والتشكلات جميع من Hsp90. بنية المجال Hsp90 هو مبين بالأشكال البيضاوية الصفراء وهو مبين بالمرونة كونفورماشونال التي تتراكب ديمر المفتوحة والمغلقة. (ب) متوسط يسكن وقت PNP أمبير * منضمة إلى Hsp90 في غياب النوكليوتيدات إضافية (أحمر)، وفي وجود 250 ميكرون غير مسمى PNP أمبير (أزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقدم الإجراءات التجريبية للحصول على بيانات ألوان سمفريت لنظام معقد من بروتين، ووصف خطوة بخطوة لتحليل هذه القياسات. ويوفر هذا النهج إمكانية فريدة لتقييم العلاقة بين عدة مواقع التفاعل أو التغييرات conformational مباشرة.

من أجل الحصول على بيانات جزيء واحد متعدد الألوان مناسبة على البروتينات من المهم إجراء قياسات استنساخه على مستوى منخفض ضجيج. يمكن تحقيق ذلك باستخدام بروتوكول تخميل سطحية فعالة وموثوق بها ل الدائرة تدفق9. ينبغي استخدام كثافة الجزيئات معطلة إلى السطح كافية لزيادة عائد جزيئات كل فيلم مسجل. وهذا يعني أن الأسفار الخفيفة من الجزيئات واحدة ينبغي أن تقع على حوالي 5-10 ٪ من بكسل في الصور المسجلة. في نفس الوقت الزائد ينبغي منع، لأن ذلك سوف يؤدي في تداخل الجزيئات المجاورة. عندما يكون أحد أنواع مسماة حرة في الحل (PNP أمبير * في الدراسة المقدمة)، تأكد من أن تركيز منخفضة بما يكفي لعدم التدخل القياس بالإثارة المباشرة من أشعة الليزر بطول موجه أقصر (أي عادة أقل بكثير ميكرومولار تركيز). أيضا، تأكد من أن تركيز هذه المركبات ليس أقل من المنشود بسبب الربط غير محدد للواجهات. بالإضافة إلى ذلك، تمثل قوة الإثارة الأمثل مفاضلة بين نسبة إشارة إلى الضجيج وفوتوبليتشينج من فلوروفوريس.

يعمل الأكسجين لا مسح النظام في البروتوكول المقدم. لا تظهر الأصباغ أتو والتكنلوجيا المستخدمة كبيرة وامض على مقياس الوقت للتجربة (70 مرض التصلب العصبي المتعدد الإضاءة في كل دورة الإثارة) ولوحظ أي انخفاض معدل التبييض الصور بنظام الكسح يتكون من الجلوكوز أوكسيديز، الكاتالاز، وترولوكس33 ،34. أيضا، نظراً لغياب الأكسجين الكاسح يتجنب التحف بسبب تفاعلات البروتين غير محدد، كما نظم الكسح الأوكسجين عادة ما تحتوي على مكونات البروتين يصل إلى تركيز micromolar35.

خطوة حاسمة أخرى هي اختيار التتبع. حجم المنطقة لجمع كثافة فلوروفوري واحد يتم اختياره ليكون كما صغيراً قدر الإمكان ولكن لا يزال أكبر من انتشار النقطة مهمة للإعداد. كن على علم أن العوامل هضبة مسطحة في كثافة مشتركة ولا يمكن توقع آثار إذا قنوات الكشف عن أشعة غاما الظاهر مماثلة، حيث لم يتم تصحيح الآثار في هذه المرحلة من التحليل. إلا الجزيئات التي تفي بمعايير محددة جيدا لآثار كثافة fluorescence مدرجة في التحليل (الفرع 3). جزيئات مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء فقراء في آثار PF مستبعدة من مزيد من التحليل، ولا تؤثر على تقييم البيانات كما تستخدم معايير اختيار واضحة.

اعتماداً على نوعية البيانات، وتوفير نهج بديلة تخصيص الدولة الأمثل. فرقة متعددة الأبعاد حرة هم أساس أما على آثار كثافة fluorescence27 أو آثار PF يمكن تطبيقها بتخصيص الدول الأساسية عن طريق تحسين احتمالات انبعاث المقابلة (مثلاً، الضبابي ملفات Pdf) في الوقت نفسه تحسين النموذج الحركي. كلا النهجين لها مزاياها وعيوبها. قد تحتوي على آثار PF طفرات غير المواتية في حين تتفاوت مستويات الكثافة الأسفار من جزيء إلى جزيء. البروتوكول المقدم إلى حل هذه المشكلة منع التحولات الصناعية عند حدوث طفرات وتقدير احتمالات الانبعاثات من ضبابي 3D يصلح للرسم البياني الجبهة الوطنية وتحسين احتمالات الانتقال في اللاحقة فقط تشغيل الفرقة هم.

النهج الذي قدم يحد من الحاجة إلى شريك تفاعل مسمى الذي يربط مع تقارب عالية نسبيا كي تكون متوافقة مع التركيزات المنخفضة اللازمة للقياسات جزيء واحد التقليدية. وهذا قد يمكن التغلب عليها باستراتيجيات لزيادة تركيز المحلية (الربط من الشركاء التفاعل36، التغليف في حويصلات37،38) أو طرق لتقليل حجم متحمس (مثلاً صفر-الوضع 39من وافيجويديس). وبالإضافة إلى ذلك، يتم اختياره بعناية مواقف التوسيم ومراقبة التجارب ضرورية لاستبعاد الآثار الجانبية الحادة فلوروفوريس. في حالة Hsp90، هذا هو التحقق من عادة بمقايسة ATPase، مما يدل على النشاط الأنزيمي40. إذا كان متوفراً، ينبغي النظر في المعلومات الهيكلية من كريستال أو هيكل الرنين المغناطيسي النووي. المواقع المفضلة في الحلقات سطح مكشوف، بعيداً عن واجهات التفاعل وعدم دفن في جيب بروتين سطحي. وهذا ما يضمن وحدة تخزين كبيرة للوصول للصبغة.

الإطار مناسب لتجربة سمفريت متعدد ألوان مع عدد عشوائي من الألوان. ونحن نركز على قياسات ألوان هنا، كما سبق وتوفر هذه الميزة التي تجعلها متميزة عن غيرها من التجارب جزيء واحد، إلا وهي إمكانية مراقبة مباشرة العلاقة بين العمليتين (مثلاً، ملزمة شريك التفاعل والتغييرات كونفورماشونال). هذه المعلومات غير قابل للوصول في تجربة قياسية ثنائية اللون سمفريت ولكن هو من المصلحة الأساسية لفهم وظيفة أي آلة جزيئية.

قدم التجربة والتحليل غير قادرة على وصف نظم البروتين، مما قد يعرض ديناميات على مجموعة واسعة من المقاييس الزمنية بين الدول التي تكون مرنة للغاية نفسها3. ويتناقض هذا التجارب المنشورة سابقا متعدد الألوان سمفريت، والتي ركزت على الحمض النووي الريبي أو نظم نموذجية، مثل هوليداي تقاطعات4، نستعرض الانتقالات بين الدول المحددة جيدا (معظمها اثنين). في أنظمة البروتين، نسبة الإشارة إلى الضوضاء أقل واستخراج مجموعة كاملة من احتمالات الانتقال أمر صعب بسبب النطاق الترددي الزمنية المحدودة في تجارب سمفريت بسبب فوتوبليتشينج. هنا، نحن تبين أن-إذا طبقت بعناية ومع القيود المعقولة-العقبات في قياس نظم البروتين يمكن التغلب على مع سمفريت متعدد الألوان باستخدام تخصيص الدولة متعددة الأبعاد و تحليل ماركوف فرقة المخفية9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وتمول هذا العمل مؤسسة البحوث الألمانية (أنست 39/969-1) ومجلس البحوث الأوروبية من خلال "منسق الإغاثة الطارئة المنحة" نون 681891.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Setup
vibration-damped optical table   Newport, Irvine, CA, USA RS2000
OBIS 473nm LX 75mW LASER Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA 1185052
OBIS 532nm LS 50mW LASER Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA 1261779
OBIS 594nm LS 60mW LASER Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA 1233470
OBIS 637nm LX 140mW LASER Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA 1196625
laser control unit Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA 1234465 Scientific Remote
aspheric telescope lenses Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA d=25.4mm, f=50mm and f=100mm
CF ex1 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany ZET 473/10 cleanup filter excitation
CF ex2 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany ZET 532/10 cleanup filter excitation
CF ex3 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany ZET 594/10 cleanup filter excitation
CF ex4 Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA FL635-10 cleanup filter excitation
DM ex1 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany ZQ594RDC dichroic mirror excitation
DM ex2 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany 570DCXR dichroic mirror excitation
DM ex3 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany ZQ491RDC dichroic mirror excitation
AOTFnC-Vis AA Opto-Electronic, Orsay, France
λ/4 plate Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA AQWP05M-600
CFI Apo TIRF 100x Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA high-NA objective
piezo focus positioner MIPOS 250 CAP piezosystem jena GmbH, Jena, Germany Piezo Controller NV 40/1 CLE
piezo stepper Newport, Irvine, CA, USA PZA12 PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit
achromatic aspheric lenses Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, Germany G322-304-000 d=50mm, f=200mm
adjustable optical slit Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany 27.160.1212 max. aperture 12 x 12 mm
DM det1 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany T 600 LPXR dichroic mirror detection
DM det2 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany H 560 LPXR superflat dichroic mirror detection
DM det3 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany HC BS R635 dichroic mirror detection
BP det1 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany 525/40 BrightLine HC bandpass filter detection
BP det2 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany 586/20 BrightLine HC bandpass filter detection
BP det3 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany 631/36 BrightLine HC bandpass filter detection
BP det4 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany 700/75 ET Bandpass bandpass filter detection
optical shutters detection Vincent Associates, Rochester, NY, USA Uniblitz VS25S2T0 
EMCCD iXon Ultra 897 Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland
digital I/O card, PCIe-6535 National Instruments, Austin, Texas, USA
syringe pump Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA PHD22/2000
Name Company Catalog Number Comments
Flow chamber
quartz slides G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA Spectrosil2000, h=3mm
TEGADERM film 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany 1626W 10 x 12cm
spray adhesive 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany Photo Mount 050777
glycerol Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany Immersol G
immersion oil OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, Germany IMMOIL-F30CC
prism Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany Suprasil1
aluminium prism holder custom built
hollow setscrews Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA with custom drilling
Tygon S3 E-3603 tubing neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany 2-4450 ACF00001
PTFE tubing Bohlender GmbH, Grünsfeld, Germany S1810-08
Name Company Catalog Number Comments
Sample
yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin UniProt ID P02829
Maleimide derivatives of Atto488, Atto550 ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany
AMP-PNP* Jena Bioscience, Jena, Germany γ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N
Fluospheres Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA F8764 amine-modified, 0.2 μm, yellow-green fluorescent
Name Company Catalog Number Comments
Software
Andor Solis Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland version 4.30
LabVIEW National Instruments, Austin, Texas, USA version 2012, 32bit; misc. hardware control
MDS control software AA Opto-Electronic, Orsay, France version 2.03a
Coherent Connection Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA version 3
Igor Pro WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA version 6.37

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).
  2. Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
  3. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  4. Hohng, S., Joo, C., Ha, T. Single-Molecule Three-Color FRET. Biophys J. 87 (2), 1328-1337 (2004).
  5. Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy. ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).
  6. Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S. Single-molecule four-color FRET. Angew Chem Int Ed. 49 (51), 9922-9925 (2010).
  7. Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. Heat shock protein 90's mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).
  8. Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery. Nat Commun. 5, 4192 (2014).
  9. Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously. Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).
  10. Yengo, C. M., Berger, C. L. Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment. Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).
  11. Wortmann,P ,, Götz M,, Hugel T , Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1. Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).
  12. Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J Vis Exp. (120), e54782 (2017).
  13. Stephanopoulos, N., Francis, M. B. Choosing an effective protein bioconjugation strategy. Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).
  14. Sánchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).
  15. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  16. Lee, N. K., et al. Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances. Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).
  17. Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).
  18. Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
  19. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. 14, 174-180 (2017).
  20. Rabiner, L. R. A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition. Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).
  21. Fink, G. A. Markov Models for Pattern Recognition. , Springer London. London. (2014).
  22. Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models. Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).
  23. Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. Confidence intervals for hidden Markov model parameters. Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).
  24. McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling. Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).
  25. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data. Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  26. Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data. PLoS ONE. 7 (2), e30024 (2012).
  27. Schmid, S., Götz, M., Hugel, T. Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium. Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).
  28. Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).
  29. Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).
  30. Wayne, N., Bolon, D. N. Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers. J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).
  31. Ali, M. M. U., et al. Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex. Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).
  32. Southworth, D. R., Agard, D. A. Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle. Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).
  33. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  34. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  35. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  36. Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Ylänne, J., Rief, M. Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).
  37. Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic. Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).
  38. Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
  39. Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  40. Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 131، الفيزياء الحيوية، وحركية البروتين، ومتعدد الألوان سمفريت، TIRF، Hsp90، وهم كوبيراتيفيتي، جزيء واحد تآكل
استخدام ألوان جزيء واحد الحنق لدراسة الترابط بين تفاعلات البروتين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Götz, M., Wortmann, P., Schmid, … More

Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions. J. Vis. Exp. (131), e56896, doi:10.3791/56896 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter