Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att få tre färger smFRET data och dess analys med en 3D ensemble dold Markovmodell. Med detta synsätt, kan forskarna extrahera kinetiska information från komplexa protein system, inklusive kooperativitet eller korrelerade interaktioner.
Abstract
Singel-molekyl Förster resonans energiöverföring (smFRET) blivit en allmänt använd biofysiska teknik att studera dynamiken i biomolekyler. För många molekylära maskiner i en cellproteiner har att agera tillsammans med interaktion partner i en funktionell cykel för att fullgöra sin uppgift. Tillägget av två-färg till flera smFRET gör det möjligt att samtidigt söka mer än en interaktion eller conformationaländring. Detta inte bara tillför en ny dimension till smFRET experiment men det erbjuder också den unika möjligheten att direkt studera händelseförloppet och att upptäcka korrelerade interaktioner när du använder en immobiliserade prov och en totalreflexion fluorescens Mikroskop (TIRFM). Flerfärgade smFRET är därför ett mångsidigt verktyg för att studera Biomolekylär komplex på ett kvantitativt sätt och i en tidigare ouppnåeliga detalj.
Här visar vi hur att övervinna de särskilda utmaningarna som flerfärgade smFRET experiment på proteiner. Vi presenterar detaljerade protokoll för att erhålla data och extrahera kinetiska information. Detta inkluderar trace urvalskriterier, staten separering och återvinning av statens banor från bullriga data med hjälp av en 3D ensemble dold Markovmodell (HMM). Jämfört med andra metoder, återvinns den kinetiska informationen inte från dwell time histogram men direkt från HMM. Ramen för högsta sannolikheten tillåter oss att kritiskt utvärdera den kinetiska modellen och ge meningsfull osäkerheter för priserna.
Genom att använda vår metod heat shock protein 90 (Hsp90), kan vi särskilja nukleotid bindningen och de globala konfirmerande förändringarna av protein. Detta tillåter oss att direkt observera kooperativitet mellan två nukleotid bindande fickor Hsp90 dimeren.
Introduction
Många proteiner uppfylla sin funktion i dynamiska komplex med andra molekyler, medieras av konfirmerande förändringar och övergående föreningar på ett brett spektrum av tidsskalor1,2,3. Kopplat till en extern energikälla (t.ex. ATP) dessa dynamiska interaktioner kan leda till riktningen i en funktionell cykel och slutligen bevara icke-jämvikt steady-state i en cell, en förutsättning för liv.
För att fullt förstå dessa molekylära maskiner, är en statisk Beskrivning styrs av strukturella studier inte tillräckligt. Dessutom är det viktigt att ha kunskap om den underliggande kinetiska modellen och bestämma de kinetiska konstanterna. Flera befintliga metoder tillåter forskare att studera dynamiken i binärt interaktioner mellan två molekyler av intresse, t.ex. ytan plasmon resonans, avslappningsmetoder med en spektroskopisk avläsning (t.ex. hoppa eller stoppas-flöde tekniker), och kärnmagnetisk resonans. Deras tillämplighet är dock oftast begränsad till enkla två-påstå-system (t.ex. en bunden och en obunden stat) på grund av den i genomsnitt inneboende till bulk experiment. I fall där fler stater eller intermediärer är inblandade, ger de bara en komplex blandning av konstanterna. Singel-molekyl metoder såsom optisk eller magnetisk pincett eller två-färg smFRET, dvs en givare och en acceptor fluorophore, med en yta-orörlig prov kan återställa konstanterna för alla observerade konfirmerande förändringar. Men när det gäller interaktioner som påverkar mer än en bindning webbplats, dessa metoder förbli begränsade och informationen på det möjliga samband mellan två (eller mer) samspelet kommer endast vara tillgänglig via indirekta slutsatser från en uppsättning experiment.
Flerfärgade smFRET4,5,6,7,8,9 erbjuder möjlighet att studera samspelet mellan dessa komponenter direkt, i realtid och under nära-fysiologiska villkor10. Detta tillåter en att undersöka exempelvis konformationsberoende bindningen av en ligand eller ett annat protein8,9,11. Den övergripande strategi som presenteras här är att märka proteinernas sevärdheter på specifika positioner, bifoga ett protein på ytan av mätning kammaren, och att spåra fluorescensintensiteten över tid på en prisma-typ TIRFM (för detaljer se 9 , 12). den rumsliga närheten av de olika färgämnena kan sedan bestämmas från energiöverföring mellan dem. Märkning strategier kan variera från protein till protein (över 13) och riktlinjer för att undvika artefakter i smFRET mätningar finns14.
Eftersom givaren färgämne kan överföra energi till olika acceptor färgämnen i en multi-färg smFRET experiment, är den relativa positionen för alla färgämnen inte tillgänglig från excitation av ett färgämne ensam15,16. Men i kombination med omväxlande laser excitation (ALEX17och granskade i 18) denna metod ger alla plats och tid information på under en sekund och sub nanometers upplösning.
I rektor beräknade hög upplösning strukturell information kan uppnås med hjälp av avstånden mellan färgämne från kombinationen av alla fluorescens stödnivåer i en multi-färg smFRET experiment med ALEX. Men fokuserar här vi på statliga identifiering och separering samt utvinning av kinetiska modeller, där flerfärgade smFRET är oumbärlig. När ”bara” strukturbestämning av triangulering önskas, kan en uppsättning enklare tvåfärgad smFRET experiment med hög signal-brus-förhållande vara utförda12,19.
Vi använder den partiella fluorescensen (
) som en proxy för energiöverföring mellan två fluorophores7. PF beräknas från fluorescensintensiteten analogt med bandet effektiviteten av en två-färg experiment:
Där 
är intensiteten i utsläpp kanal em efter excitation med färg exoch c är acceptorn med längsta våglängden. Samma ståndpunkt upptäckt kanaler i provkammaren men spela in olika spektrala spänner av fluorescens ljuset. Samma identifierare för magnetisering och utsläpp används i detta protokoll (dvs, ”blå”, ”gröna” och ”röda”).
På grund av experimentella brister beror uppmätta fluorescens stödnivåer inte bara på energiöverföring utan även på fluorophore och setup egenskaper. För att erhålla sann energieffektiviteten överföring mellan två fluorophores, har de uppmätta stödnivåerna rättas. Följande procedur bygger på referens9. Korrektionsfaktorer för uppenbara läckage (lk, dvs detektion av fotoner från en fluorophore i en kanal utsetts för ett annat färgämne) och uppenbara gamma (ag, d.v.s. fluorescens kvantutbyte av färgämnet och upptäckt effektivitet av kanalen) erhålls från singel-molekyl spår som visar en acceptor blekning händelse.
Läckage av givare färgämnet i varje möjligt acceptor kanal beräknas från alla datapunkter i inspelade fluorescens spår där acceptor färgen blekt men givaren är fortfarande fluorescerande (
):
Medianen av läckage histogrammet används som den skenbara läckage faktorn. Efter korrigering för läckage bestäms den skenbara gamma faktorn från samma uppsättning spår. Det beräknas genom att dividera ändringen av fluorescens i acceptor kanalen vid ändringen av fluorescens i kanalen givare vid blekning av acceptor färgen:
Där c är igen upptäckt kanalen för acceptorn med längsta våglängden. Medianen av den resulterande fördelningen används som uppenbart korrektionsfaktorn.
De korrigera stödnivåerna i varje kanal erhålls genom:
PF beräknas då enligt:
Olika populationer kan separeras i flerdimensionella utrymmet korsas av PFs. Position och bredd i varje medlemsstat bestäms av passande data med flerdimensionella Gaussisk funktioner. Efterföljande optimering av en global HMM baserat på alla PF spår ger en kvantitativ beskrivning av den observerade kineticsen. Även små förändringar av räntorna kan påvisas.
HMMs tillhandahåller ett sätt att dra slutsatsen att en stat modell från en samling av bullriga tid spår. Systemet anses vara i en av en uppsättning diskreta, dolda lägen vid varje given tidpunkt och faktiska observationen (dvs utsläpp) är en probabilistisk funktion av denna dolda stat20. När det gäller TIRFM smFRET data, kan den utsläpp sannolikheter bjag per stat jag modelleras genom kontinuerlig Gaussisk sannolikhetsdensiteten funktioner. Vid regelbundet fördelade diskret tidpunkter, kan övergångar från en till en annan stat uppstå enligt övergången sannolikheten att tajma-invariant och bara beror på det aktuella läget. Den övergången matrisen A innehåller dessa övergången sannolikheter enij mellan alla dolda lägen. Starttillstånd fördelningen 
ger delstatsspecifik sannolikheterna 
för den första tiden en tid spårning. Med en maximal-sannolikheten metod, kan dessa parametrar optimeras för att bäst beskriva data med framåt-bakåt och Baum-Welch algoritmer20,21. Detta ger de högsta sannolikheten estimatorer (MLE). Slutligen, den statliga sekvens som troligen produceras banan för observationer kan utläsas med Viterbis algoritmen. I motsats till andra HMM analyser av smFRET data24,25,26 använder vi inte HMM som en enbart ”utjämning” av data men extraktet den kinetiska stat modellen från datauppsättningen utan behov för montering uppehållstid histogram27. HMM analys sker med egna skript med Igor Pro. Genomförandet av koden är baserad på referens21. Vi tillhandahåller en software kit och exemplarisk data på vår webbsida för att följa avsnitten 5 och 6 i detta protokoll (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Fullständig programvara finns tillgänglig på begäran.
Tidpunkter i data med PF < -1 eller PF > 2 i någon upptäckt kanal tilldelas minimala utsläpp sannolikheten för alla stater (10-200). Detta förhindrar artificiella övergångarna på dessa datapunkter.
Parametrarna för utsläpp sannolikheterna erhålls från passformen i 3D PF histogrammet med Gaussisk funktioner som beskrivs i steg 5,7. Dessa parametrar hålls fast under optimering av HMM.
I den presenterade metoden används starttillstånd distribution vektorn och övergången matrisen globalt att beskriva hela ensemblen spår. De uppdateras baserat på alla N molekyler från datauppsättningen enligt referens27.
Startparametrar för starttillstånd fördelningen bestäms från 2D projektioner av PF histogrammet (steg 5.3) och övergångssannolikheter ställs till 0,05 med undantag av sannolikheterna i samma stat som väljs så att sannolikheten att lämna en viss stat är normaliserat till enighet.
En sannolikhet profilering metoden används för att ge konfidensintervall (CI) för alla övergången priser21,22, som tjänar som meningsfulla beräkningar för deras osäkerhet. För att beräkna gränserna för CI för en bestämd hastighet, fast övergången sannolikheten för intresse till ett annat värde än MLE. Detta ger den test modell λ'. En sannolikhet baserat (LR) test av sannolikheten 
tanke datauppsättningen 0 utförs enligt:
Den 95% konfidens bunden för parametern är nått när LR överskrider 3.841, den 95% quantile av en x2-distribution med en grad av frihet22,23.
Kraften i metoden demonstreras med Hsp90. Detta rikligt protein finns i bakterier och Eukaryoter och är en del av den cellulära stress svar28. Det är ett lovande läkemedel mål i cancer behandling29. Hsp90 är en homodimer med en nukleotid bindande ficka i den N-terminala domänen varje subenhet30. Det kan genomgå övergångar mellan minst två globalt olika konformationer, en stängd och en N-terminal öppen, V-formad konformation19,31,32. Dimeriskt natur väcker direkt frågan om samspelet mellan de två nukleotid bindningsställen i Hsp90.
I följande ger vi ett stegvisa protokoll för datainsamling och analys av tre färger smFRET experiment på jäst Hsp90 och nukleotid. Konformationsberoende bindningen av fluorescently märkt AMP-PNP (förstärkare-PNP *, en icke-hydrolyserbar analog av ATP) analyseras. Tillämpningen av förfarandet som beskrivs tillåter studiet av nukleotid bindningen och samtidigt konfirmerande ändringarna av Hsp90 och avslöjar därmed kooperativitet mellan två nukleotid bindande fickor Hsp90.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. inställning och förutsättningar
- Utföra de flerfärgade smFRET mätningarna på en prisma-typ TIRFM. En beskrivning av en två-färg setup som en JoVE publikation ges referens12.
- Konstruera en flerfärgade TIRFM. En allmän layout är detaljerad i 9.
- Användning omkopplingsbar, diod pumpas halvledar-kontinuerlig våg lasrar, vilket gör användningen av mekaniska fönsterluckor i excitation sökvägar onödiga.
- Anställa en asymmetrisk, avlånga Prisma som förhindrar tillbaka reflektion av magnetiseringen strålen från baksidan att ange målet.
- Använd 2-tums akromatisk asfäriska smält kiseldioxid linser i de upptäckta sökvägar som samlar in så mycket ljus som möjligt och förhindra auto-fluorescens och avvikelser, t.ex. snedvridning i off-center regioner av bilden.
- Fokus varje upptäckt sökväg på chip av elektrisk med en separat lins. Detta tillåter optimal fokusering av varje upptäckt kanal.
Varning: Klass 3B lasrar används i TIRFM. Detta innebär att de är farliga om ögat utsätts direkt, men diffusa reflektioner inte är skadliga. Säkerställa överensstämmelse med laser säkerhetsföreskrifter enligt lokala myndighetsregler innan systemet tas i bruk.
- Fastställa Korrektionsfaktorerna för installation och fluorophore egenskaper i förväg med hjälp av dsDNA prover.
- Använda ett hög-bandet dsDNA prov för varje färg i kombination med den acceptor som har den längsta excitation våglängden (för den presenterade setup: Atto488-Atto647N, Atto550-Atto647N, Atto594-Atto647N). Kontrollera att DNA dessutom modifieras med en biotin.
- Späd provet till 5 nM med TNM buffert (5 mM Tris pH 7.5, 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2) och 2 mM Trolox (Använd denna buffert också för mätning).
- Immobilisera dsDNA som beskrivits för Hsp90 2.5 och 2.7.
- Beräkna Korrektionsfaktorerna för uppenbara läckage (lk) och uppenbara gamma (ag) från singel-molekyl spår som visar en acceptor blekning händelse.
- Konstruera en flöde kammare som är en smörgås på en PEG/biotin-PEG passiverad quartz-bild, en tunn film som är lim på båda sidor, och ett täckglas. För detalj protokoll för rengöring av kvartarna se diabilder och passivering hänvisning9.
- Använd tjock (3 mm) kvarts glider geometriskt förhindra insamling av laserljus utspridda i kvarts-glycerol-kvarts gränssnittet mellan prismat och functionalized kvarts bilden.
- Använd en tunn (40 µm) tätning film som sprutas med klister på den icke-häftande sidan. Tunna filmen minskar avståndet mellan surface-anslutna molekyler och mål. Värm till 80 ° C och tryck på.
- Placera ett täckglas på toppen. Värm till 80 ° C och tryck på. Använd en droppe av glycerol när du placerar flöde kammaren över prismat.
Obs: Material av prismat samt kvarts bilderna och glycerol är index-matchade.
- Express Hsp90 från Saccharomyces cerevisiae i form av två enda cystein punkt mutanter på positionerna D61 eller Q385. Lägg till en C-terminal dubbeltvinnade motiv för att förhindra dimer dissociation vid picomolar koncentrationer. Märka de muterade proteinerna separat och utbyta monomerer för att erhålla heterodimerer märkt med Atto488 vid aminosyra position 61 och Atto550 på aminosyran position 3859.
2. mätning
- Starta kameran och ange tänkbar parametrarna som anges nedan:
- Ställa in temperaturen för sensorn kylning så lågt som möjligt (-95 ° C med extern vattenkylning) för att minska mörka nuvarande buller.
- Använd kamerainställningar som är optimerade för singel-molekyl inspelning: 3,3 µs vertikala skift hastighet, normala vertikala klocka spänning, 17 MHz 16-bitars horisontell läsa ut, före förstärkning vinst 3, få av elektron multiplikator 1 000.
- Ange utlösning av förvärvet till ”externa” och exponeringstiden till 70 ms. spela in filmer med en längd av 750 förvärv cykler.
Obs: Stäng av ljusets rum när kameran förvärvar för att förhindra mättnad av elektrisk sensor.
- Skapa en mapp på den lokala SSD för mätning. I programmet inställningar gå till < Auto-Spara > ryttaren Aktivera < Auto-Spara > och Välj filformat ”Tiff” för filmen förvärv. Välj mappen på SSD som auto-spara plats.
- Starta programvaran som styr acousto-optisk avstämbara filter (AOTF), den programvara som styr driften av lasrar och programvaran trigger som synkroniserar lasrar, AOTF, fönsterluckor i upptäckt sökväg och kameror. Justera laser kraften med AOTF (ca. 3 mW innan prismat) och ladda rätt utlösande mönstret.
- Montera provhållaren med prismat och flöde kammare, bifoga slangar, placera inlopp slangen i en mikrocentrifug kopp och ansluta outlet slangen till en sprutpump. Spola kammaren med cirka 150 µL buffert, justera magnetiseringen beam, och fokus. Bleka några fluorescerande föroreningar på ytan genom att sakta flytta längs komplett detektionsområdet av bilden med en lasereffekt på ca 10 mW för alla lasrar. Detta tar ca 1 h.
Obs: om inte annat anges, används bufferten innehåller 40 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, och 10 mM MgCl2. - Spola ca 300 µL av en NeutrAvidin lösning (0,25 mg/mL i buffert) in i kammaren och inkubera i 1 min. spola ut obundna NeutrAvidin med buffert och spola ca 300 µL av en BSA lösning (0,5 mg/mL i buffert) genom kammaren.
Obs: Detta block återstående ytan funktionalisering defekter av ospecifika adsorption av BSA till ytan. - Immobilisera provet genom laddar flöde kammaren med cirka 150 µL av biotinylerade och märkt Hsp90 vid stigande koncentrationer (utspädd i buffert + 0,5 mg/mL BSA) tills en tillräcklig Ytors nås, vilket oftast är fallet vid en koncentration av 5-10 pM. Tvätta ut obundna protein med cirka 300 µL buffert + 0,5 mg/mL BSA.
- Spola i 150 µL 25 nM AMP-PNP * i buffert + 0,5 mg/mL BSA. Låt Inkubera i 5 minuter och upprepa detta en gång för att säkerställa rätt nukleotid koncentration.
Obs: För experiment i närvaro av ytterligare, omärkt AMP-PNP, även lägga till 250 µM AMP-PNP. - Börja med dataförvärvet. För en lämplig mängd data förvärva cirka 20 filmer som tar ca 1,5 h.
- Flytta provkammaren vinkelrätt mot excitation balken med en piezo stepper ändra synfältet.
- Justera fokus med den z-piezo som styr höjden på målet om det behövs. Detta bör inte vara nödvändigt alltför ofta när mätning kammaren är monterad utan Lutning.
- Förbereda inspelning av kameror genom att trycka på < ta Signal > i kameraprogramvaran och börja excitation/förvärv cykler med knappen < Start > i programvaran trigger. Detta startar förvärvet av fluorescensintensiteten.
- Utföra en kanal registrering av första inspelning av en film med fluorescerande pärlor som visar fluorescens utsläpp i spektrala spänna av alla upptäckt kanaler av installationen. Sedan upptäcka pärla positioner i filmen kalibrering genom att söka efter de ljusaste fläckarna och fastställa centrala position från en Gaussisk passa till intensiteten profil. Spara koordinaterna för pärlor som finns i alla kanaler och passar både kartläggning förskjutningen i x - och y-riktning med en 2D polynom av grad tre9.
3. urval av Single-molekyl spår
- Analys av data sker med egna skript med Igor Pro. Läsa alla nödvändiga skript genom att öppna ”iniTIRF.ipf” och välj rätt typ av experiment.
Obs: I följande < knappen > anger klickbara element i menyn eller användargränssnittet. Funktionsanrop anges inom citationstecken, t.ex., ”Print” Hej världen ””. Dessa kommandon kan klistras på kommandoraden av Igor Pro (utan omslutande citattecken). - Kontrollera parametrarna för upptäckten kanal registreringen är påfyllt.
- Starta det grafiska Användargränssnittet genom att klicka på < smFRET nya | Analys GUI >.
- Ladda filmer (dvs, sekvensen av ramar med 512 x 512 pixlar lagras som 16 bit TIFF högar) som håller intensiteten i de respektiva kanalerna. Gör detta genom att trycka på knappen < belastning Film > och välja filerna från den så kallade ”master” och ”slave” kameror en efter den andra.
- Identifiera potentiella enstaka molekyler ståndpunkter genom att söka efter de ljusaste fläckarna i summan av fem första bildrutorna i en viss upptäckt kanal. Beräkna de motsvarande positionerna i alla andra upptäckt kanaler från den kanal kartläggningen. För att erhålla fluorescens intensitet tracen, summera intensiteten av en pixel kvadrat runt mittläget för varje bildruta. Gör detta genom att trycka på knappen < hitta spår > i GUI.
Obs: Den side längden på torget (i pixel) ges av: 2 * < summan Pxs > + 1. - För varje molekyl, beräkna gemensamma raw intensitet spår som summan av alla spår av denna plats med samma färg för magnetisering. Utvärdera den intensitet profilen av molekylen i alla kanaler för följande kriterier:
- En ungefär platt platå i den gemensamma raw intensiteten och en enda blekning steg för alla excitation färger, anticorrelated beteende i kanalerna som ändamålsenlig detektering, identifiering av röd fluorescens (som visar bandet till en bunden AMP-PNP *) minst en gång inom den spår och inga flera steg i den röd fluorescens, vilket visar att förekomsten av två AMP-PNP * bunden till en Hsp90 dimer.
- Spara fluorescens tracesna av plats för ytterligare analys om dessa kriterier är uppfyllda. Gör detta genom att välja spåret med markören och trycka på knappen < Spara > i figuren ”tidslinjer”. Inspektera manuellt intensitet spår i alla tre upptäckt kanalerna efter blå magnetisering för ca 200 molekyler per film.
4. beräkning av partiell fluorescens spår
- Visa alla fluorescens intensitet spår för en av de Spara molekylerna. Använd markörknapparna i diagrammet för att välja tidsintervall.
- Välj ett tidsintervall där alla fluorophores är blekt redan. Genomsnittlig bakgrund intensitet beräknas detta intervall och subtraheras från intensitet spårningen i varje kanal. Gör detta genom att trycka på knappen < bakgrund >.
- Markera intervallet bandet effektivitet, där åtminstone både färgämnena fäst Hsp90 (Atto488 och Atto550) är närvarande. Se till att utesluta spår som innehåller en blinkande händelse (se figur 3B). Dessa händelser kännetecknas av en drop-in fluorescensintensiteten i en kanal utan en åtföljande ökning av någon annan kanal.
- Beräkna PF spår. Gör detta genom att trycka på knappen < PF Calc >. De fördefinierade Korrektionsfaktorerna för uppenbara läckage (lk) och uppenbara gamma (ag) tillämpas på raw intensiteten för att korrigera för foto-fysiska och setup boenden.
5. befolkningen urval och 3D Histogram montering
- Ta bort molekyler som visar en låg signal-brus-förhållande i PF spår. Molekyler som överskrider intervallet [-1; 2] i PF spår för mer än 10% av ramar tas bort från datauppsättningen. Gör detta genom att köra ”RemoveTracesLowSNR()” från kommandofönstret.
- Beräkna binned 2D projektioner av PF data. Rita
över 
och 
över i intervallet [-0,5; 1,5] med en upplösning på 100 x 100 lagerplatser. Till gör så, kör:- ”HistFret2D (” r_b ”,” Johnny ”, binHist = 100)”
- ”HistFret2D (” r_b ”,” g_b ”, binHist = 100); MoveWindow 553,5, 42,5, 1055.25, 508.25 ”
- Bestämma den relativa befolkningen varje distinguishable stats i 2D prognoser.
- Ta lämpliga grafen till fronten och kör ”panelHist2DCount()”.
- Tryck på knappen < Init > och rita en fri hand polygon runt toppen.
- Klicka på knappen < antal >. Antalet datapunkter i polygonen och det totala antalet datapunkter i projektionen trycks i kommandofönstret.
- Förbereda ett 3D histogram av PF data genom att köra ”HistFret3D (” g_b ”,” r_b ”,” Johnny ”)”.
- Normalisera 3D histogrammet till en integrerad del av 1. Utföra följande:
- ”NewDataFolder/S fit0”
- ”Duplikat/O:: bandet: Hist3D, Hist3D”
- ”Variabel /G div = sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0)) ^ 3”
- ”Hist3D = div; Skriv ut div ”
- Ge initial parametrar för den 3D Gaussian passar och förbereda nödvändiga datastrukturer.
- Utföra ”Gauss3D_initParam(); redigera W_coef_old ”.
- Lägg till staten befolkningarna i slutet av parametern vektor.
- Utföra ”Gauss3D_prepareFit()”.
Obs: W_coef_old är en vektor som innehåller de ursprungliga parametrarna för passform. Per stat innebär
och den statliga befolkningen, vilket är sammanfogat i slutet av vektorn. Kontrollera att matrisen kovariansen är symmetriska.
- Passa summan av S 3D Gaussisk funktioner till 3D PF histogrammet, med S är antalet distinguishable stater.
- Utföra ”do3D()”. Detta kan ta en timme eller mer på en normal kontor PC, beroende på kvaliteten på de ursprungliga parametrarna.
- Utföra ”postprocessFitMultiGauss3D(); evalFitMultiGauss3D(); redigera W_coef ”.
- Fit resultatet visas. För varje två 2D prognoserna, använder du följande kommandon:
- ”contourPF3D_new(0); contourPF3D_new(1); contourPF3D_new(2); contourPF3D_new(3); contourPF3D_new(4) ”
- ”contourPF3D_colorize()”
över 
och 
över 
och den statliga befolkningen, vilket är sammanfogat i slutet av vektorn. Kontrollera att matrisen kovariansen är symmetriska.6. kinetic analys med 3D Ensemble HMM
- Förbereda en ensemble HMM kör till extraktet den kinetiska informationen. En HMM är optimerad från alla molekyler i datauppsättningen. Använd den information som erhållits i föregående steg för att definiera placering och bredd för varje stat i 3D PF utrymmet.
- Initiera HMM användargränssnittet (< HMM | Init HMM >) och väljer lämpligt antal stater (för Hsp90 data innebär detta < NumStates > = 5), antal dimensioner av insignalen (< NumDims > = 3), och vilken typ av input (< Input Type > = ”FRET 3D bgr”).
- Optimera parametrarna för HMM genom att låta programvaran konvergerar sannolikheten för HMM (execute ”prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1), -14)”) tills förändringen i övergången matrisen jämfört med den föregående iterationen sjunker under ett tröskelvärde (10-14 för summan av den absoluta förändringen för varje övergång sannolikhet). Detta ger MLE för övergångssannolikheter i ungefär en timme på en normal kontorsdator.
- Upprepa befolkningen valet, Gaussisk montering och HMM optimering för delmängder av data (t.ex. 75% av hela datamängden). Om hela datamängden slogs samman från olika experiment, kan du upprepa optimering också för var och en av de enda experiment. Analys av delmängder tillstånd för att beräkna osäkerheten i manuell befolkningen valet och variabiliteten i datauppsättningen.
- Beräkna CI för de övergångssannolikheter, som rapportera om datauppsättningen heterogenitet och precisionen av HMM.
- Få en grov uppskattning av CI gränserna genom att köra ”cd $(rot: path3Dimport +” HMM ”); loop_getCI_estimate_limits() ”.
- Beräkna de exakta gränserna för CI genom att köra:
- ”loop_getCI_HMM_converge(1)”
- ”CIresults_conv_new()”
- ”cd:: HMM_CIresult; reportCI_conv() ”
- ”cd:: cmp_CI_conv; CI_plot2 (”HMM”, doAppend = 0) ”
- Kondensera tillgängliga kinetiska uppgifter för att förenkla tolkningen.
- Samla in information om tid en märkt nukleotid förblir bunden till Hsp90. Gör detta genom att kollapsa de stater som är bundna till AMP-PNP * (dvs., S1, S2 och S3, se även figur 2) och sammanställa dwell time histogrammet. Utföra ”cd $(rot: path3Dimport +” HMM ”); collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0}) ”, som kombinerar bor i staterna S0 och S4 samt S1, S2och S3.
- Extrahera uppehållstid från Viterbis sökvägen för varje stat av intresse och jämföra det resulterande dwell time histogrammet för olika experimentella förhållanden. Utföra ”plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1)”.
- För en mer detaljerad bild, komprimera stater som har distinkta PF men är funktionellt identiska att underlätta ytterligare dataanalys, t.ex., i fråga om ett tre-Color experiment med märkta Hsp90 och nukleotid, stater S2 och S 3 kan vara dolda. Utföra ”collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4})”.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flerfärgade smFRET mätningar tillåta direkt påvisande av samband mellan två eller flera distinkta interaktion platser. Detta gör tekniken unika att undersöka multi-Component system, såsom proteinkomplex. Vi fokuserar på presentationen av ett tre-Color smFRET experiment här, som fungerar som ett belysande exempel.
Det allmänna arbetsflödet för metoden visas i figur 1. Den första delen omfattar registrering av flerfärgade smFRET uppgifter på prism-typ Frida Mikroskop. Strategin ytan fastsättning och schemat av installationen avbildas i figur 2A. För en mer detaljerad beskrivning av installationen, se hänvisning9. Den andra delen av den presenterade metoden fokuserar på dataanalys. Exemplarisk fluorescens intensitet spår visas i figur 2B. Lämplig tid spår Visa: (i) ett tydligt blekning steg för båda fluorophores som bifogas Hsp90, (ii) platt intensitet platåer, (iii) anti-korrelerade beteende i motsvarande kanaler och (iv) minst en bindande händelse av AMP-PNP * (figur 3). Mer än 400 molekyler som uppfyller urvalskriterierna valdes för att ge tillförlitlig statistik. I det studera systemet, kan fem stater särskiljas genom fluorescens stödnivåerna, med fyra stater att vara funktionellt distinkta (figur 2 c).
Från fluorescensintensiteten beräknas spår den partiella fluorescensen (PF, förlängning av bandet effektiviteten för flerfärgade smFRET experiment) kan (figur 4A). PF är relaterad till närheten av färgerna. I ett experiment med tre färger smFRET data sträcker sig över en 3D-rymden (figur 5B). 2D projektioner av 3D histogrammet har visat sig vara användbar för stat separation (figur 4B, C). I ett lyckat experiment är alla stater som förväntas teoretiskt på tillämpad experimentell villkor distinguishable av sin PF i 2D prognoser.
De relativa populationerna av staterna bestäms från 2D projektionerna av ritade på fri hand polygoner som omsluter toppen (figur 5 c). Denna strategi visade sig vara korrekt och tillförlitlig9. Utsläpp sannolikheterna för HMM erhålls genom att montera 3D PF histogrammet med summan av 3D Gaussisk funktion, där S är antalet distinguishable stater (fem i presenterade fall; Figur 5 d). För detta passar att konvergera ordentligt, har bara den relativa befolkningen pjag i varje stat jag hållas konstant medan position och bredd av Gaussians är gratis.
En ensemble HMM optimeras över hela datamängden med utsläpp sannolikheterna fast de parametrar som erhålls från den Gaussisk fit (figur 6). För att få ett mått för osäkerheten i de extraherade övergångssannolikheter, 95% KI för varje övergång är beslutsamt (figur 7).
Dessutom, Genomsnittligt tid som den märkta reporter nukleotid AMP-PNP * förblir bunden till Hsp90 kan utvinnas under olika experimentella förhållanden (figur 8A). Detta bidrar till att ytterligare minska komplexiteten i resultaten. Att göra så, stater som representerar AMP-PNP * bundna och obundna konformationer är dolda i de statliga banor, respektive. Från detta det genomsnittliga dwell time för de AMP-PNP * dissociation kan beräknas (figur 8B).
Genom att jämföra kinetiken hos frånvaro och närvaro av ytterligare, kan omärkt AMP-PNP, unik information om sambandet mellan konfirmerande ändringarna av Hsp90 och nukleotid staten vinnas. Detta gör det möjligt att direkt studera kooperativitet mellan två nukleotid bindande fickor Hsp90. Dessutom kringgår det behovet av titrering experiment som mäter bindande webbplats ockupationen som en funktion av substrat koncentrationen (t.ex. Hill tomter). För högdynamiska protein system såsom Hsp90 är detta tillvägagångssätt också känslig för små förändringar i priser11.
Figur 1 : Allmänna arbetsflödet av datainsamling och analys. Data förvärvas på flerfärgade smFRET totalreflexion fluorescens Mikroskop (TIRFM). Efter spårningen urval och beräkning av den partiella fluorescensen (PF) sammanställs den 3D PF histogram och 2D prognoser därav. Med hjälp av 2D prognoserna, kan befolkningen i alla distinguishable stater bestämmas. Dessa används som ett tvång för en 3D Gaussisk passar till PF histogrammet. Gaussisk sannolikhetsdensiteten funktioner fungera som utsläpp sannolikheter för efterföljande 3D ensemblen dolda Markov modellering (HMM). Detta ger den kinetiska beskrivningen av systemet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Systemet av dataförvärvet. (A) piktogram av det studera systemet bestående av en Hsp90 dimer (gula ovaler representera domänstrukturen) bifogas ytan med etiketterna Atto488 (blå) och Atto550 (grön) och den reporter nukleotid AMP-PNP * i lösning, märkt med Atto647N (röd). Data registreras på prism-typ Frida Mikroskop med omväxlande laser excitation (ALEX). (B) exemplariska fluorescens intensitet (Fl. Int.) spår efter blå och gröna excitation. (C) piktogram av distinguishable konfirmerande påstår av Hsp90 (S0, S1, S2, S3, S4) och deras respektive identifierare för funktionella staten (O, C, O *, C *) används i detta arbete. Fluorophore positioner anges i blått, grönt och rött. Två populationer representerar samma funktionella tillstånd, nämligen öppna Hsp90 med AMP-PNP * bunden (S2 och S3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Urvalskriterier. (A) A molekyl valts för ytterligare analys. (B, C) Molekyler inte valts för vidare analys. (B) ingen platta platåer och Atto550 är i ett mörkt runt 30 s efter gröna excitation (anges med pilar). (C) flera blekning kliver efter gröna excitation (anges med pilar). Fl. Int.: fluorescensintensiteten, blå: Atto488, grön: Atto550, röd Atto647N, ex: excitation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Beräkning av PF spår och representativa histogram. (A) representativa fluorescens intensitet (Fl. Int.) spår och motsvarande partiell fluorescens (PF) spår. (B) två 2D projektioner av 3D PF histogrammet för mätning i avsaknad av ytterligare, omärkt nukleotid. (C) de samma prognoserna för experimentet i närvaro av ytterligare 250 µM AMP-PNP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Befolkningen urvalsprocessen. (A) positionen för de fem urskiljbara populationerna i två 2D prognoser. (B) kopia av symbolerna i figur 2 c. (C) representativa 3D spridningsdiagram PF data. Färgning av datapunkterna är endast för visualisering. Samma färgkod som i B används. (D) fastställande av de relativa populationerna görs genom att rita på fri hand polygoner runt topparna i 2D histogrammet. Använda en kombination av de två projektioner som avbildas i figur 3, kan alla fem populationer särskiljas. (E) resultaten av den 3D Gaussisk passar till histogrammet PF data visas i A. Depicted är den nivåytor på FWHM, som representerar de fem olika populationerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Flödesschema av ensemble 3D HMM optimering. En modell är optimerad för alla molekyler från datauppsättningen. Start värdena ges av de indata modellen (med ett fördefinierat antal stater). Sannolikheten för den modell som data (3D PF spår) är klassat med framåt-bakåt (FB) algoritmen. Baum-Welch (BW) algoritmen ger en lokal högsta sannolikheten uppskattning (MLE) av parametrarna. Den globala MLE kan då hittas iterativt. Viterbis algoritmen beräknar mest sannolikt staten banan givet modell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Meningsfull osäkerhet uppskattning med CI. (A) fastställande av CI för en exemplarisk konstant. Sannolikheten förhållandet (LR) av test modell jämfört med högsta sannolikhet estimator (MLE) modell beräknas i regionen runt MLE för konstanten. Den 95% konfidens bunden nås när LR överskrider 3.841 (horisontell mörk grå linje). (B) andelen extraherade konstanter utan ytterligare nukleotid (röd) och med AMP-PNP (blå) och deras 95% CI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 : Genomsnittligt dwell time av den reporter nukleotid AMP-PNP * bundet till Hsp90 förlängs i närvaro av ytterligare nukleotid. (A) piktogram av observerade dissociation av märkt AMP-PNP * från Hsp90 dimeren, genomsnitt över alla konformationer av Hsp90. Hsp90 domänstruktur avbildas av gula ovaler och konfirmerande flexibilitet indikeras genom att lägga till en öppen och stängd dimer. (B) genomsnitt dwell time av AMP-PNP * bunden till Hsp90 i avsaknad av ytterligare nukleotid (röd) och i närvaro av 250 µM omärkt AMP-PNP (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar det experimentella förfarandet för att erhålla tre färger smFRET data för en komplicerad protein system och en stegvis beskrivning av analysen av dessa mätningar. Denna metod erbjuder unika möjligheten att direkt bedöma korrelationen mellan flera interaktion platser eller konfirmerande förändringar.
För att erhålla lämpliga flerfärgade singel-molekyl data på proteiner är det viktigt att utföra reproducerbara mätningar på en låg ljudnivå. Detta kan uppnås genom att använda en effektiv och pålitlig ytan passivering protokoll för flöde kammare9. En tillräcklig täthet av molekyler immobiliserats till ytan bör användas för att öka avkastningen av molekyler per inspelad film. Detta innebär att fluorescens ljus från enstaka molekyler borde falla på ca 5-10% av bildpunkterna i de inspelade bilderna. Samtidigt bör överbelastning förhindras, eftersom det skulle leda till en överlappning av närliggande molekyler. När en märkta arter är fri i lösning (AMP-PNP * i presenterade studien), kontrollera koncentrationen är tillräckligt låg för att inte störa mätningen av direkta excitation från lasrar med kortare våglängd (dvs. normalt långt under en mikromolära koncentration). Kontrollera också att koncentrationen av dessa föreningar inte är lägre än avsett på ospecifik bindning till gränssnitt. Dessutom representerar optimal excitation kraften en kompromiss mellan det signal-brus-förhållandet och fotoblekning av fluorophores.
Inget syre rensning system är anställd i protokollet presenteras. De används Atto-Tec färgämnena visar inte betydande blinkar på tidsskalan för experimentet (70 ms belysning per excitation cykel) och ingen minskning av andelen foto blekmedel observerades av en gatsopare system bestående av glukosoxidas, katalas och Trolox33 ,34. Frånvaro av syre gatsopare undviker också, artefakter på grund av ospecifika proteininteraktioner, eftersom syre rensning system vanligtvis innehåller proteinkomponenter upp till en mikromolära koncentration35.
Ett annat viktigt steg är spåra markeringen. Storleken på området för summera intensiteten av en enda fluorophore väljs att vara så liten som möjligt men fortfarande större än punkten sprida funktion av installationen. Tänk på att en platt platå i gemensamma intensitet spår kan bara förväntas om de Upptäck kanalerna har liknande uppenbara gamma faktorer, eftersom spåren inte korrigeras i detta skede av analysen. Bara molekyler som uppfyller väl definierade kriterier för fluorescens intensitet spår ingår i analysen (avsnitt 3). Molekyler med en dålig signal-brus-förhållande i PF spår utesluts från vidare analys och påverkar inte data utvärdering som tydlig markering kriterier används.
Beroende på kvaliteten på uppgifterna ger alternativa metoder optimal statliga anslag. Ett gratis multi-dimensionell ensemble HMM baserat antingen på fluorescens intensitet spår27 eller PF spår skulle kunna tillämpas för att fördela de underliggande staterna genom att optimera motsvarande utsläpp sannolikheterna (t.ex. Gaussisk PDF-filer) samtidigt som den optimerar den kinetiska modellen. Båda metoderna har sina fördelar och nackdelar. PF spår kan innehålla unfavorable spikar medan fluorescens intensitet varierar från molekyl för molekyl. Presenterade protokollet löser detta problem genom att förhindra artificiella övergångarna när spikar uppstår och genom att uppskatta utsläpp sannolikheterna från en 3D Gaussisk passar till PF histogrammet och bara optimera övergångssannolikheter i den efterföljande Ensemble HMM kör.
Den presenterade metoden begränsas av behovet av en märkt interaktion partner binds med en jämförbar hög affinitet för att vara kompatibla med de låga koncentrationerna som är nödvändiga för konventionella single-molekyl mätningar. Detta kan lösas genom strategier för att öka den lokala koncentrationen (tjudra interaktion partners36, inkapsling i blåsor37,38) eller metoder för att minska volymen upphetsad (t.ex. noll-läge vågledare39). Dessutom märkning positioner måste väljas med omsorg och kontroll experiment är nödvändiga för att utesluta allvarliga biverkningar av fluorophores. Vid Hsp90, är detta vanligtvis kontrolleras genom ATPas test, som bevisar den enzymatiska aktivitet40. Om det finns bör strukturell information från crystal eller NMR struktur övervägas. Önskade positioner i ytan-utsatt loopar, från interaktion gränssnitt och begravd inte i en protein utanpåliggande ficka. Detta säkerställer en stor tillgänglig volym för färgen.
Ramen är lämpad för ett flerfärgade smFRET experiment med ett godtyckligt antal färger. Vi fokuserar på tre färger mätningar här, eftersom dessa redan ger funktionen som gör att de skiljer sig från andra singel-molekyl experiment, nämligen möjligheten att direkt observera korrelation mellan två processer (t.ex. bindning av en interaktion partner och konfirmerande förändringar). Denna information är inte tillgänglig i en standard två-färg smFRET experiment men är av grundläggande intresse för att förstå funktionen av någon molekylär maskin.
Den presenterade experimentet och analys kan karaktärisera protein system, som kan visa dynamics på en rad olika tidsskalor mellan stater som är mycket flexibel sig3. Detta kontrasterar tidigare publicerade flerfärgade smFRET experiment, som fokuserade på DNA eller RNA modellsystem, såsom Holliday korsningar4, uppvisar övergångar mellan (oftast två) väldefinierade stater. I protein system, signal-brus-förhållandet är lägre och utvinna komplett uppsättning av övergångssannolikheter är svårt på grund av den begränsa temporal bandbredden i smFRET experiment på grund av fotoblekning. Här visar vi att - om tillämpas noggrant och med rimliga begränsningar - hinder i protein mätsystem kan övervinnas med flerfärgade smFRET med flerdimensionella statligt anslag och ensemble dolda Markov analys9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete finansieras av den tyska forskningsfondens (INST 39/969-1) och Europeiska forskningsrådet genom om ERC bidragsavtalet n. 681891.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setup | |||
| vibration-damped optical table | Newport, Irvine, CA, USA | RS2000 | |
| OBIS 473nm LX 75mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1185052 | |
| OBIS 532nm LS 50mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1261779 | |
| OBIS 594nm LS 60mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1233470 | |
| OBIS 637nm LX 140mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1196625 | |
| laser control unit | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1234465 | Scientific Remote |
| aspheric telescope lenses | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | d=25.4mm, f=50mm and f=100mm | |
| CF ex1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 473/10 | cleanup filter excitation |
| CF ex2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 532/10 | cleanup filter excitation |
| CF ex3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 594/10 | cleanup filter excitation |
| CF ex4 | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | FL635-10 | cleanup filter excitation |
| DM ex1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZQ594RDC | dichroic mirror excitation |
| DM ex2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 570DCXR | dichroic mirror excitation |
| DM ex3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZQ491RDC | dichroic mirror excitation |
| AOTFnC-Vis | AA Opto-Electronic, Orsay, France | ||
| λ/4 plate | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | AQWP05M-600 | |
| CFI Apo TIRF 100x | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | high-NA objective | |
| piezo focus positioner MIPOS 250 CAP | piezosystem jena GmbH, Jena, Germany | Piezo Controller NV 40/1 CLE | |
| piezo stepper | Newport, Irvine, CA, USA | PZA12 | PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit |
| achromatic aspheric lenses | Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, Germany | G322-304-000 | d=50mm, f=200mm |
| adjustable optical slit | Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany | 27.160.1212 | max. aperture 12 x 12 mm |
| DM det1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | T 600 LPXR | dichroic mirror detection |
| DM det2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | H 560 LPXR superflat | dichroic mirror detection |
| DM det3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | HC BS R635 | dichroic mirror detection |
| BP det1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 525/40 BrightLine HC | bandpass filter detection |
| BP det2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 586/20 BrightLine HC | bandpass filter detection |
| BP det3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 631/36 BrightLine HC | bandpass filter detection |
| BP det4 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 700/75 ET Bandpass | bandpass filter detection |
| optical shutters detection | Vincent Associates, Rochester, NY, USA | Uniblitz VS25S2T0 | |
| EMCCD iXon Ultra 897 | Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland | ||
| digital I/O card, PCIe-6535 | National Instruments, Austin, Texas, USA | ||
| syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | PHD22/2000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow chamber | |||
| quartz slides | G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA | Spectrosil2000, h=3mm | |
| TEGADERM film | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | 1626W | 10 x 12cm |
| spray adhesive | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | Photo Mount 050777 | |
| glycerol | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | Immersol G | |
| immersion oil | OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, Germany | IMMOIL-F30CC | |
| prism | Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany | Suprasil1 | |
| aluminium prism holder | custom built | ||
| hollow setscrews | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | with custom drilling | |
| Tygon S3 E-3603 tubing | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | 2-4450 | ACF00001 |
| PTFE tubing | Bohlender GmbH, Grünsfeld, Germany | S1810-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sample | |||
| yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin | UniProt ID P02829 | ||
| Maleimide derivatives of Atto488, Atto550 | ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany | ||
| AMP-PNP* | Jena Bioscience, Jena, Germany | γ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N | |
| Fluospheres | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | F8764 | amine-modified, 0.2 μm, yellow-green fluorescent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Andor Solis | Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland | version 4.30 | |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, Texas, USA | version 2012, 32bit; misc. hardware control | |
| MDS control software | AA Opto-Electronic, Orsay, France | version 2.03a | |
| Coherent Connection | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | version 3 | |
| Igor Pro | WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA | version 6.37 |
References
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M.
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Henzler-Wildman, K., Kern, D.
- Hohng, S., Joo, C., Ha, T.
- Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy. ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).
- Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S.
- Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. Heat shock protein 90's mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).
- Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery. Nat Commun. 5, 4192 (2014).
- Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously. Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).
- Yengo, C. M., Berger, C. L. Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment. Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).
- Wortmann,P ,, Götz M,, Hugel T , Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1. Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).
- Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J Vis Exp. (120), e54782 (2017).
- Stephanopoulos, N., Francis, M. B. Choosing an effective protein bioconjugation strategy. Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).
- Sánchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Lee, N. K., et al. Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances. Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).
- Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).
- Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
- Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. 14, 174-180 (2017).
- Rabiner, L. R. A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition. Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).
- Fink, G. A. Markov Models for Pattern Recognition. , Springer London. London. (2014).
- Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models. Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).
- Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. Confidence intervals for hidden Markov model parameters. Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).
- McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling. Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).
- Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data. Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).
- Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data. PLoS ONE. 7 (2), e30024 (2012).
- Schmid, S., Götz, M., Hugel, T. Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium. Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).
- Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).
- Wayne, N., Bolon, D. N. Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers. J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).
- Ali, M. M. U., et al. Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex. Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).
- Southworth, D. R., Agard, D. A. Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle. Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).
- Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Ylänne, J., Rief, M. Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).
- Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic. Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
- Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).
