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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

À l’aide de trois couleurs frette de molécules simples pour étudier la corrélation des Interactions de protéine

Published: January 30, 2018 doi: 10.3791/56896
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Institute of Physical Chemistry, University of Freiburg, 2Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

Summary

Nous présentons ici un protocole afin d’obtenir des données de trois couleurs smFRET et son analyse avec un ensemble 3D modèle de Markov caché. Avec cette approche, les scientifiques peuvent extraire informations cinétiques systèmes complexe des protéines, y compris coopérativité ou interactions corrélées.

Abstract

Transfert d’énergie unique molécules Förster (smFRET) est devenu une technique largement utilisée biophysique pour étudier la dynamique des biomolécules. Pour beaucoup de machines moléculaires dans une protéines cellulaires ont à agir conjointement avec des partenaires d’interaction dans un cycle fonctionnel pour remplir leur mission. L’extension de deux couleurs à multicolore smFRET permet de sonder simultanément plus d’une interaction ou changement conformationnel. Cela non seulement ajoute une nouvelle dimension à des expériences de smFRET, mais il offre aussi la possibilité unique d’étudier directement la séquence des événements et de détecter des interactions corrélées lorsque vous utilisez un échantillon immobilisé et une fluorescence de la réflexion totale interne microscope (TIRFM). SmFRET multi-color est donc un outil polyvalent pour l’étude biomoléculaire complexes de manière quantitative et dans un détail auparavant irréalisable.

Ici, nous démontrons comment surmonter les défis particuliers de multicolore smFRET expériences sur les protéines. Nous présentons des protocoles détaillés pour obtenir les données et d’extraction d’informations cinétiques. Cela comprend les critères de sélection de trace, la séparation de l’État et la récupération des trajectoires de l’État dans les données bruitées en utilisant un ensemble 3D modèle de Markov cachés (HMM). Par rapport aux autres méthodes, l’information cinétique n’est pas récupérée des histogrammes de temps de s’attarder, mais directement à partir de la HMM. Le cadre du maximum de vraisemblance nous permet d’évaluer de façon critique le modèle cinétique et d’incertitudes significatives pour les tarifs.

En appliquant notre méthode à la protéine de choc thermique 90 (Hsp90), nous sommes en mesure de démêler la liaison des nucléotides et les globales changements de conformation de la protéine. Cela nous permet d’observer directement la coopération entre les deux poches de liaison de nucléotides du dimère Hsp90.

Introduction

Beaucoup de protéines remplissent leur fonction dans les dynamiques complexes avec d’autres molécules, médiées par des changements de conformation et associations transitoires sur une large gamme d’échelles de temps1,2,3. Couplé à une source d’énergie externe (p. ex., ATP) ces interactions dynamiques peuvent conduire à la directionnalité dans un cycle fonctionnel et en fin de compte maintenir l’état d’équilibre hors de l’équilibre dans une cellule, la condition sine qua non pour la vie.

Pour bien comprendre ces machines moléculaires, une description statique, guidée par des études structurales n’est pas suffisante. En outre, il est essentiel d’avoir une connaissance du modèle cinétique sous-jacent et de déterminer les constantes cinétiques. Plusieurs méthodes existantes aux chercheurs d’étudier la dynamique des interactions binaires entre deux molécules d’intérêt, par exemple, la résonance plasmonique de surface, des méthodes de relaxation avec une lecture spectroscopique (p. ex., saut ou arrêt d’écoulement techniques) et la résonance magnétique nucléaire. Cependant, leur applicabilité est le plus souvent limitée à des systèmes simples de deux États (par exemple, une liaison et un État indépendant) en raison de l’étalement inhérente à l’expérimentation en vrac. Dans le cas où plusieurs États ou intermédiaires sont impliqués, ils donnent seulement un mélange complexe des constantes de vitesse. Méthodes de molécules simples tels que des pinces optiques ou magnétiques ou deux couleurs smFRET, c.-à-d. un donneur et un accepteur fluorophore, auprès d’un échantillon de surface immobilisée peuvent récupérer les constantes de vitesse pour tous observé des changements de conformation. Cependant, quand il s’agit d’interactions qui touchent plus d’un accepteur, ces méthodes restent limitées et les informations sur les interactions de la corrélation possible entre les deux (ou plus) ne seront accessibles par l’intermédiaire de conclusions indirectes d’un ensemble d’expériences.

Multi-color smFRET4,5,6,7,8,9 offre la possibilité d’étudier l’interaction entre ces éléments directement, en temps réel et sous des conditions physiologiques près de10. Cela permet d’étudier par exemple, la liaison de conformation dépendant d’un ligand ou d’une autre protéine8,9,11. L’approche générale présentée ici est d’étiqueter les protéines d’intérêt aux positions spécifiques, d’attacher une protéine à la surface de la chambre de mesure et de suivre l’intensité de la fluorescence au fil du temps sur un TIRFM type de prisme (pour détails voir 9 , 12). la proximité spatiale des différents colorants peut décider du transfert d’énergie entre eux. Stratégies d’étiquetage peut varier de protéine à la protéine (évaluée à 13) et il existait des directives pour éviter les artefacts dans les mesures smFRET14.

Puisqu’un colorant donneur peut transférer l’énergie aux colorants différents accepteurs dans une expérience multi-color smFRET, la position relative de tous les colorants n’est pas accessible depuis l’excitation d’un colorant seul15,16. Mais en combinaison avec une alternance d’excitation de laser (ALEX17et examiné dans 18), cette méthode fournit toutes les informations spatio-temporelles à la seconde et résolution sous nanomètre.

En principe, haute résolution informations structurelles peuvent être réalisées en utilisant les distances inter-colorants calculée à partir de la combinaison de toutes les intensités de fluorescence dans une expérience multi-color smFRET avec ALEX. Cependant, ici, nous nous concentrons sur l’identification de l’État et de séparation, mais aussi l’extraction des modèles cinétiques, où smFRET multicolore est indispensable. Lorsque vous souhaitez « seulement » détermination de structure par triangulation, une série d’expériences de deux couleurs smFRET plus simples avec rapport signal-bruit élevé peut être effectué12,19.

Nous utilisons la fluorescence partielle (Equation 1) comme un proxy pour le transfert d’énergie entre deux fluorophores7. Le PF est calculée à partir de l’intensité de fluorescence analogue à l’efficacité FRET d’une expérience de deux couleurs :

Equation 2

Où, Equation 3 est l’intensité d’émission canal em après excitation avec couleur ex, et c est l’accepteur avec la longueur d’onde plus longue. Canaux de détection représente la même position dans le compartiment de mesure mais enregistrer différentes gammes spectrales de la lumière de fluorescence. Le même identificateur pour l’excitation et d’émission sont utilisés dans le présent protocole (c'est-à-dire, « bleu », « vert » et « rouge »).

En raison de lacunes expérimentales, les intensités de fluorescence mesurée dépendent non seulement sur le transfert d’énergie, mais aussi sur les propriétés de configuration / fluorophore. Afin d’obtenir l’efficacité de transfert d’énergie véritable entre deux fluorophores, les intensités mesurées doivent être corrigées. La procédure suivante repose sur la référence9. Facteurs de correction pour la fuite apparente (lk, c'est-à-dire, la détection de photons d’un fluorophore dans un canal nommée pour un autre colorant) et gamma apparent (ag, c.-à-d. le rendement quantique de fluorescence du colorant et la efficacité de la détection du chenal) sont obtenus à partir des traces de molécules simples qui montrent un accepteur d’événement de blanchiment.

La fuite du colorant donneur dans tous les canaux possibles accepteur est calculée à partir de tous les points de données dans les traces de fluorescence enregistré où le colorant accepteur blanchi, mais le donateur est toujours fluorescent (Equation 4) :

Equation 5

La médiane de l’histogramme de fuite est utilisée comme le facteur de fuite apparente. Après correction des fuites, le facteur gamma apparent est déterminé de la même série de traces. Il est calculé en divisant le changement de la fluorescence dans le canal de l’accepteur par le changement de fluorescence dans le chenal de donneur sur le blanchiment de la teinture de l’accepteur :

Equation 6

Où c est encore une fois le canal de détection pour l’accepteur avec la longueur d’onde plus longue. La médiane de la distribution qui en résulte est utilisée comme le facteur de correction apparente.

Les intensités corrigées dans chaque canal sont obtenues par :

Equation 7

Le PF est ensuite calculé selon :

Equation 8

Des populations différentes peuvent être séparées dans l’espace multidimensionnel, enjambé par le s PF. La position et la largeur de chaque État est déterminé en ajustant les données avec des fonctions gaussiennes multidimensionnelles. Optimisation ultérieure d’un HMM global basé sur toutes les traces PF fournit une description quantitative de la cinétique observée. Même les petits changements des tarifs sont détectables.

HMMs permettent de déduire un modèle d’état d’une collection de tracés chronologiques bruyant. Le système est considéré comme en partie d’une série de discret, États cachés à un moment donné et l’observation réelle (c'est-à-dire l’émission) est une fonction probabiliste de cet état masqué20. Dans le cas des données TIRFM de smFRET, l’émission probabilités bje par état j’ai peuvent être modélisés par des fonctions de densité de probabilité gaussienne continue. Aux points régulièrement espacés de temps discret, transitions à partir d’un autre État peuvent se produire selon la probabilité de transition qui est invariant et dépend seulement de l’état actuel. La matrice de transition A contient ces probabilités de transition unij entre tous les États cachés. La répartition de l’état initial Equation 9 donne les probabilités de spécifiques à l’état Equation 10 pour le premier point de temps d’une trace du temps. En utilisant une approche du maximum de vraisemblance, ces paramètres peuvent être optimisés pour décrire au mieux les données avec l’avant-arrière et algorithmes de Baum-Welch20,21. Cela donne les estimateurs du maximum de vraisemblance (MLE). Enfin, la séquence de l’État qui a probablement produit la trajectoire des observations peut être déduite avec l’algorithme de Viterbi. Contrairement à d’autres analyses HMM des smFRET données24,25,26 , nous n’utilisons pas le HMM comme un simple « lissage » des données, mais le modèle cinétique état extrait le jeu de données sans avoir besoin pour ajuster les temps de pause histogrammes27. HMM analyse se fait avec les scripts internes à l’aide de Igor Pro. Mise en œuvre du code repose sur21de référence. Nous fournissons un kit logiciel et données exemplaires sur notre site Web afin de suivre les sections 5 et 6 du présent protocole (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Logiciel complet est disponible sur demande.

Fois points dans les données avec PF < -1 ou PF > 2 dans n’importe quel canal de détection sont assignés à la probabilité d’émission minimal pour tous les États (10-200). Vous éviterez les transitions artificielles à ces points de données.

Les paramètres pour les probabilités des émissions proviennent de l’ajustement de l’histogramme 3D de PF avec fonctions gaussiennes comme indiqué au point 5.7. Ces paramètres sont maintenus fixes durant l’optimisation de la HMM.

Dans l’approche présentée, le vecteur de distribution état initial et la matrice de transition sont utilisés dans le monde pour décrire l’ensemble entier de traces. Elles sont mises à jour basées sur toutes les molécules de N de l’ensemble des données selon la référence27.

Les paramètres de démarrage pour la distribution de l’état initial sont déterminés à partir des projections 2D de l’histogramme PF (étape 5.3) et les probabilités de transition sont définies à 0,05 à l’exception des probabilités de rester dans le même État, qui sont choisis de telle que la probabilité de quitter un certain état est normalisée à l’unité.

Une méthode de profilage de probabilité est utilisée pour donner des intervalles de confiance (IC) pour toute transition taux21,22, qui servent des estimations significatives pour leur incertitude. Pour calculer les limites de la CI pour un taux spécifique, la probabilité de transition d’intérêt est fixée à une valeur autre que le MLE. Cela donne le test modèle λ'. Un test du rapport (LR) de probabilité du risque Equation 16 compte tenu de l’ensemble de données 0 est effectuée conformément à :

Equation 11

La confiance de 95 % liée pour le paramètre est atteinte lorsque LR dépasse 3.841, la quantile de 95 % d’un x2-distribution avec un seul degré de liberté22,23.

La puissance de la méthode est démontrée à l’aide de la Hsp90. Cette protéine abondante se trouve chez les bactéries et des eucaryotes et fait partie de la réponse de stress cellulaire28. C’est une cible de médicament prometteur dans le traitement de cancer du29. HSP90 est un homodimère avec une poche de liaison de nucléotides dans le domaine N-terminal de chaque sous-unité30. Il peut subir une transition entre au moins deux conformations globalement distinctes, l’un fermé et un N-terminal conformation ouverte en forme de V,19,31,32. La nature dimère pose directement la question de l’interaction entre les deux sites de liaison de nucléotides dans Hsp90.

Par la suite, nous fournissons un protocole étape par étape d’acquisition de données et d’analyse d’une expérience de trois couleurs smFRET sur levure Hsp90 et nucléotides. La liaison de conformation dépendant du fluorescent étiqueté AMP-PNP (AMP-PNP *, un analogue non hydrolysable de l’ATP) est analysé. L’application de la procédure décrite permet l’étude de la liaison de nucléotides et en même temps les changements de conformation de la Hsp90 et révèle ainsi la coopération entre les deux poches de liaison de nucléotides de Hsp90.

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Protocol

1. installation et configuration requise

  1. Effectuer les mesures multicolore smFRET sur un TIRFM type de prisme. Une description d’une installation de deux couleurs comme une publication JoVE est donnée référence à12.
    1. Construire un TIRFM multicolore. Une présentation générale est détaillée dans 9.
    2. Utilisation commutable, diode pompé onde entretenue lasers à état solide, qui rendent l’utilisation des volets mécaniques dans les chemins de l’excitation inutile.
    3. Employer un prisme asymétrique, allongé qui empêche la réflexion arrière de la poutre de l’excitation de l’arrière pour entrer dans l’objectif.
    4. Utiliser des lentilles achromatiques pouces 2 asphériques en silice fondue dans les chemins de détection qui recueillent autant de lumière que possible et éviter l’auto-fluorescence et aberrations, par exemple, des distorsions dans les régions excentrées de l’image.
    5. Chaque chemin d’accès détection l’accent sur la puce de l’EMCCD avec un objectif distinct. Cela permet une mise au point optimale de chaque canal de détection.
      Mise en garde : Les lasers de classe 3 b sont utilisés dans le TIRFM. Cela signifie qu’ils sont dangereux si le œil est exposé directement, mais les réflexions diffuses ne sont pas nuisibles. Assurer la conformité avec laser précautions de sécurité conformément à la réglementation de l’administration locale avant que le système est exploité.
  2. Déterminer les facteurs de correction pour les propriétés de configuration et fluorophore au préalable à l’aide d’échantillons d’ADN double brin.
    1. Utiliser un échantillon d’ADN double brin haut-FRET pour chaque colorant en combinaison avec l’accepteur ayant la plus longue longueur d’onde d’excitation (pour la configuration présentée : Atto488-Atto647N, Atto550-Atto647N, Atto594-Atto647N). Assurez-vous que l’ADN est en outre modifié avec un biotine.
    2. Diluer l’échantillon à 5 nM avec un tampon TNM (5 mM Tris pH 7.5, 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2) et 2 mM Trolox (aussi utiliser cette mémoire tampon pour la mesure).
    3. Immobiliser le dsDNA comme décrit pour Hsp90 aux points 2.5 et 2.7.
    4. Calculer les facteurs de correction pour la fuite apparente (lk) et gamma apparent (ag) des traces de molécules simples qui montrent un événement blanchiment accepteur.
  3. Construire une chambre à flux qui est un "sandwich" d’une lame de quartz passivé PEG/biotine-PEG, une couche mince qui est adhésif sur les deux côtés et une lamelle couvre-objet. Protocoles de détail pour le nettoyage du quartz diapositives et passivation voir référence9.
    1. Utilisation (3 mm) d’épaisseur quartz glisse à géométriquement empêcher la collecte de la lumière laser dispersée à l’interface de quartz-glycérol-quartz entre le prisme et la lame de quartz fonctionnalisés.
    2. Utiliser un mince (40 µm) film qui est pulvérisé avec de la colle sur le côté non adhésif d’étanchéité. La couche mince permet de réduire la distance entre l’objectif et les molécules attachées à la surface. Chauffer à 80 ° C et appuyez sur.
    3. Placez une lamelle couvre-objet sur le dessus. Chauffer à 80 ° C et appuyez sur. Utiliser une goutte de glycérol lorsque vous placez la chambre flow sur le prisme.
      Remarque : Les matériaux de prisme et les lames de quartz ainsi que le glycérol sont appariés selon l’indice.
  4. Exprimer la Hsp90 chez Saccharomyces cerevisiae , sous la forme de deux mutants de point unique de cystéine aux positions D61 ou Q385. Ajouter un motif C-terminal de coiled-coil pour éviter la dissociation dimère picomoles concentrations. Étiqueter les protéines mutantes séparément et échanger les monomères pour obtenir des hétérodimères marquée à Atto488 à la position de l’acide aminé 61 et Atto550 à l’acide aminé poste 3859.

2. mesure

  1. Lancez le logiciel de la caméra et régler les paramètres d’imagerie tel que précisé ci-dessous :
    1. Régler la température pour le capteur de refroidissement aussi bas que possible (-95 ° C à refroidissement par eau externe) pour diminuer le bruit courant sombre.
    2. Utiliser les réglages de l’appareil qui sont optimisés pour l’enregistrement de la molécule unique : 3,3 µs décalage vertical Vitesse, tension normale horloge verticale, 17 MHz 16-bit horizontal donne lecture, gain de pré-amplification 3, gain d’électrons multiplicateur 1 000.
    3. Définissez le déclenchement de l’acquisition à le « Extérieur » et le temps d’exposition à 70 films Record de Mme avec une longueur de 750 cycles d’acquisition.
      NOTE : Éteindre la lumière lorsque la caméra fait l’acquisition pour éviter la saturation du capteur EMCCD.
  2. Créez un dossier sur le SSD local pour la mesure. Dans le logiciel paramètres aller au coureur < Auto-Save > Activer < Auto-save > et choisissent le format de fichier « Tiff » pour l’acquisition de film. Sélectionnez le dossier sur le SSD comme emplacement de sauvegarde automatique.
  3. Démarrez le logiciel qui filtre accordable contrôles acousto-optique (AOTF), le logiciel qui contrôle le fonctionnement des lasers et le logiciel de déclencheur qui synchronise les lasers, AOTF, volets dans le chemin d’accès détection et des caméras. Ajuster la puissance du laser avec le AOTF (ca. 3 mW avant d’entrer dans le prisme) et charger le modèle correct de déclenchement.
  4. Monter le porte-échantillon avec le prisme et la chambre de flux, raccorder le tube, placer le tuyau d’arrivée dans une tasse de microcentrifuge et raccordez le tuyau de sortie d’une pompe à seringue. Rincer la chambre avec environ 150 µL de tampon, alignez l’excitation faisceau et se concentrer. Tout contaminant fluorescent sur la surface d’eau de Javel en déplaçant lentement le long de la plage de détection complète de la lame avec une puissance de laser d’environ 10 mW pour tous les lasers. Cela prend environ 1 h.
    Remarque : si pas d’indication contraire, le tampon utilisé contient 40 mM HEPES pH 7.5, KCl, de 150 mM et 10 mM MgCl2.
  5. Rincer environ 300 µL d’une solution de neutravidine (0,25 mg/mL dans le tampon) dans la chambre et incuber pendant 1 min. Flush out neutravidine indépendant avec tampon et chasse environ 300 µL d’une solution de BSA (0,5 mg/mL dans le tampon) dans la chambre.
    Remarque : Les défauts de ce bloc restant la fonctionnalisation de surface par adsorption non spécifique de BSA à la surface.
  6. Immobiliser l’échantillon en chargeant la chambre flow avec environ 150 µL de la biotinylé et étiqueté Hsp90 à la hausse des concentrations (diluées dans le tampon + 0,5 mg/mL de BSA) jusqu'à atteindre une densité de surface suffisante, qui est généralement le cas à une concentration de 5-22:00. Laver des protéines non lié avec environ 300 µL de tampon + BSA de 0,5 mg/mL.
  7. RAS dans 150 µL de 25 nM AMP-PNP * tampon + 0,5 mg/mL de BSA. Laisser incuber pendant 5 minutes et répétez cette étape une fois afin d’assurer la concentration correcte nucléotides.
    NOTE : Pour des expériences en présence de l’AMP-PNP supplémentaire, sans étiquette, il faut ajouter également 250 µM AMP-PNP.
  8. Commencer par l’acquisition de données. Pour une quantité appropriée de données acquérir environ 20 films, ce qui prend environ 1,5 h.
    1. Modifie la position de la chambre de mesure perpendiculairement à la poutre d’excitation avec un stepper piezo pour modifier le champ de vision.
    2. Ajuster la mise au point avec le z-piezo qui contrôle la hauteur de l’objectif si nécessaire. Cela ne devrait pas être nécessaire trop souvent lorsque la chambre de mesure est montée sans inclinaison.
    3. Préparer l’enregistrement des caméras en appuyant sur < prendre Signal > dans le logiciel de la caméra et de commencer les cycles d’excitation/acquisition en utilisant < Démarrer > dans le logiciel de déclencheur. Cette opération démarre l’acquisition de l’intensité de la fluorescence.
  9. Effectuez un enregistrement canal par le premier enregistrement d’un film avec des perles fluorescentes qui montrent l’émission de fluorescence dans le domaine spectral de tous les canaux de détection de l’installation. Puis, détecter les positions de perle dans le film de calibrage en recherchant les endroits les plus brillants et déterminer que la position centrale d’une gaussienne correspondait au profil d’intensité. Enregistrez les coordonnées de perles qui sont trouvent dans tous les canaux et s’adapter tant le décalage de la cartographie dans x - et y-direction avec un 2D polynôme de degré trois9.

3. sélection des Traces de molécules simples

  1. Analyse des données se fait avec les scripts internes à l’aide de Igor Pro. Chargez tous les scripts nécessaires en ouvrant « iniTIRF.ipf » et sélectionnez le type d’expérience.
    Remarque : dans ce qui suit, < Button > spécifie les éléments cliquables dans le menu ou l’interface utilisateur. Appels de fonction sont indiqués entre guillemets, par exemple, « Print « Bonjour tout le monde » ». Ces commandes peuvent être collés à la ligne de commande de Igor Pro (sans les guillemets englobants).
  2. Assurez-vous que les paramètres pour l’enregistrement de canaux de détection sont chargés.
  3. Démarrer l’interface graphique en cliquant sur < smFRET nouveau | Analyse GUI >.
  4. Charger les films (c'est-à-dire, la séquence d’images avec 512 x 512 pixels, stockées sous forme de piles TIFF 16 bits) qui détiennent l’intensité dans les canaux. Le faire en appuyant sur le bouton < charge Film > et en sélectionnant les fichiers dans les caméras dites de « maîtres » et « esclave » un après l’autre.
  5. Identifier les positions des molécules simples possibles en recherchant les endroits les plus brillants dans la somme des cinq premiers cadres dans un certain canal de détection. Calculer les positions correspondantes à tous les autres canaux de détection de la cartographie de la chaîne. Pour obtenir la trace d’intensité de fluorescence, somme l’intensité d’un carré de pixel autour de la position centrale de chaque image. Le faire en appuyant sur le bouton < trouver Traces > dans l’interface GUI.
    Remarque : La longueur du côté du carré (en pixel) est donnée par : 2 * < Pxs somme > + 1.
  6. Pour chaque molécule, calculer une trace commune d’intensité brute comme la somme de toutes les traces de cet endroit avec la même couleur d’excitation. Évaluer le profil d’intensité de la molécule dans tous les canaux pour les critères suivants :
    1. Un plateau à peu près plat à l’intensité brute mixte et un blanchiment simple étape pour toutes les couleurs de l’excitation, anthropogéniques comportement dans les canaux appropriés de détection, détection de fluorescence rouge (indiquant la frette pour une AMP lié-PNP *) au moins une fois dans la trace et pas plusieurs étapes dans la fluorescence rouge, ce qui laisse supposer la présence de deux AMP-PNP * lié à un dimère de Hsp90.
  7. Enregistrer les traces de la fluorescence de la place pour une analyse ultérieure si ces critères sont remplis. Cela en sélectionnant la trace avec le curseur et en appuyant sur le bouton < enregistrer > dans le graphique « échéancier ». Inspecter manuellement les traces d’intensité sur les trois canaux de détection après excitation bleue pour environ 200 molécules par film.

4. calcul des Traces Fluorescence partielle

  1. Afficher toutes les traces d’intensité de fluorescence pour l’une des molécules enregistrées. Utilisez les curseurs dans le graphique pour sélectionner des plages horaires.
  2. Sélectionnez un intervalle de temps où les fluorochromes sont déjà blanchies. L’intensité moyenne de fond est calculée à partir de cette gamme et soustrait de la trace de l’intensité de chaque canal. Cela en appuyant sur le bouton < arrière-plan >.
  3. Sélectionnez la plage de rendement frette, où au moins deux les colorants attachés à Hsp90 (Atto488 et Atto550) sont présents. N’oubliez pas d’exclure les traces qui contiennent un événement clignotant (voir la Figure 3 b). Ces événements sont caractérisés par une intensité de fluorescence encastrée dans un seul canal sans accompagnement augmentation dans n’importe quel autre canal.
  4. Calculer les traces PF . Cela en appuyant sur le bouton < PF Calc >. Les facteurs de correction prédéfinie pour fuite apparente (lk) et gamma apparent (ag) sont appliquées à l’intensité brute afin de corriger photo-physiques et les propriétés de configuration.

5. population sélection et ajustement de l’histogramme 3D

  1. Enlever les molécules qui montrent un faible rapport signal-bruit dans les traces PF . Les molécules qui dépassent l’intervalle [-1 ; 2] dans n’importe quelle trace PF pour plus de 10 % des cadres sont supprimés de l’ensemble de données. Cela en exécutant « RemoveTracesLowSNR() » dans la fenêtre commande.
  2. Calculer des projections 2D des données PF . Terrain Equation 12 sur Equation 13 et Equation 14 sur Equation 13 dans l’intervalle [-0.5 ; 1,5] avec une résolution de 100 x 100 emplacements. Pour ce faire, exécutez :
    1. « HistFret2D ("r_b", "sofiene", binHist = 100) »
    2. « HistFret2D ("r_b", "g_b", binHist = 100) ; MoveWindow 553,5, 42,5, 1055.25, 508,25"
  3. Déterminer la population relative de chaque État distingue dans les projections en 2D.
    1. Le graphique approprié de porter à l’avant et exécuter « panelHist2DCount() ».
    2. Appuyez sur le bouton < Init > et dessiner un polygone à main levée autour du pic.
    3. Cliquez sur le bouton < nombre >. Le nombre de points de données dans le polygone et le nombre total de points de données dans la projection sont imprimés dans la fenêtre commande.
  4. Préparer un histogramme 3D des données PF en exécutant « HistFret3D ("g_b", "r_b", "sofiene") ».
  5. Normaliser l’histogramme 3D à une intégrale de 1. Exécutez ce qui suit :
    1. « NewDataFolder/S fit0 »
    2. « Duplicata/O :: frette : Hist3D, Hist3D »
    3. « Div variable/g = sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0)) ^ 3 »
    4. « Hist3D / = div ; Impression div »
  6. Contient les paramètres initiaux de la gaussienne 3D s’adapter et préparent les structures de données nécessaires.
    1. Exécutez « Gauss3D_initParam() ; modifier W_coef_old. »
    2. Ajouter les populations de l’État à la fin du vecteur paramètre.
    3. Exécuter « Gauss3D_prepareFit(). »
      Remarque : W_coef_old est un vecteur qui contient les paramètres initiaux pour l’ajustement. Cela signifie que chaque état Equation 15 et la population de l’État, qui est concaténée à la fin du vecteur. Assurez-vous que la matrice de covariance est symétrique.
  7. La somme des fonctions gaussiennes 3D de S à l’histogramme 3D de PF , équipés de S étant le nombre d’États distinguables.
    1. Exécuter « do3D(). » Cela peut prendre une heure ou plus sur un PC, de bureau normal selon la qualité des paramètres initiaux.
    2. Exécutez « postprocessFitMultiGauss3D() ; evalFitMultiGauss3D() ; modifier W_coef. »
  8. Afficher le bon résultat. Pour chacun des deux projections 2D, utilisez les commandes suivantes :
    1. « contourPF3D_new(0) ; contourPF3D_new(1) ; contourPF3D_new(2) ; contourPF3D_new(3) ; contourPF3D_new(4) »
    2. « contourPF3D_colorize() »

6. analyse cinétique avec Ensemble 3D HMM

  1. Préparer un ensemble HMM exécuter pour extraire les informations cinétiques. Un HMM est optimisé de toutes les molécules dans le jeu de données. Utiliser les informations obtenues à l’étape précédente pour définir la position et la largeur de chaque État dans l’espace 3D de PF .
    1. Initialiser l’interface utilisateur HMM (< HMM | Init HMM >) et choisissez le nombre approprié d’États (dans le cas des données de Hsp90, cela signifie < NumStates > = 5), le nombre de dimensions du signal d’entrée (< NumDims > = 3) et le type de l’entrée (< Input Type > = « Frette bgr 3D »).
  2. Optimiser les paramètres de la HMM en laissant le logiciel convergent la probabilité de la HMM (exécuter « prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1), -14) ») jusqu'à ce que le changement de la matrice de transition par rapport à l’itération précédente tombe au-dessous d’un seuil (10-14 pour la somme de la variation absolue pour chaque probabilité de transition). Cela donne l’EMV pour les probabilités de transition en environ une heure sur un PC de bureau normal.
  3. Répétez la sélection de la population, raccord gaussien et l’optimisation HMM pour des sous-ensembles des données (par exemple, 75 % de l’ensemble de données complet). Si l’ensemble de données complet a été fusionné à partir de différentes expériences, répétez l’optimisation également pour chacune des expériences unique. Analyse des sous-ensembles permet d’estimer l’incertitude de la sélection manuelle de la population et de la variabilité au sein de l’ensemble de données.
  4. Calculer le CI pour les probabilités de transition, qui compte sur l’hétérogénéité de l’ensemble des données et la précision de la HMM.
    1. Obtenir une estimation approximative des limites CI en exécutant « cd $(racine : path3Dimport + "HMM") ; loop_getCI_estimate_limits(). »
    2. Calculer les limites exactes de la CI en exécutant :
    3. « loop_getCI_HMM_converge(1) »
    4. « CIresults_conv_new() »
    5. « cd :: HMM_CIresult ; reportCI_conv() »
    6. « cd :: cmp_CI_conv ; CI_plot2 ("HMM", doAppend = 0) »
  5. Condenser les informations cinétiques disponibles pour simplifier l’interprétation.
    1. Collecter des informations sur le temps, un nucléotide marqué reste obligé de Hsp90. Pour ce faire s’effondrer les Etats qui sont liés à l’AMP-PNP * (c.-à-d., S1, S2 et S3, voir aussi la Figure 2) et compilez l’histogramme de temps de s’attarder. Exécuter « cd $(racine : path3Dimport + "HMM") ; collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0}) «, qui combine la demeure des États S0 et S4 ainsi que S1, S2et S3.
    2. Extrait le chemin d’accès de Viterbi pour chaque État de l’intérêt des temps de pause et de comparer l’histogramme résultant du temps s’attarder pour différentes conditions expérimentales. Exécuter « plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1). »
    3. Pour un aperçu plus détaillé, s’effondrer les États qui ont distincts PF mais sont fonctionnellement identiques afin de faciliter l’analyse des données supplémentaire, par exemple, dans le cas d’une expérience de trois couleurs avec marqué Hsp90 et nucléotides, États S2 et S 3 peut être réduit. Exécuter « collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4}). »

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Representative Results

Multi-color smFRET mesures permettent la détection directe de la corrélation entre deux ou plusieurs sites distincts d’interaction. Cela rend la technique unique pour étudier les systèmes à composants multiples, tels que des complexes protéiques. Nous nous concentrons sur la présentation d’une expérience de trois couleurs smFRET ici, qui sert d’illustration.

Le déroulement général de la méthode est montré dans la Figure 1. La première partie comprend l’enregistrement des données multi-color smFRET sur microscope TIRF-type de prisme. La stratégie de la surface de fixation et les schémas de l’installation sont représentés dans la Figure 2 a. Pour une description plus détaillée de l’installation, se reporter à la référence9. La deuxième partie de la méthode présentée se concentre sur l’analyse des données. Traces d’intensité de fluorescence exemplaire sont indiquées dans la Figure 2 b. Traces de temps convenable Voir la : (i) une étape de blanchiment claire pour les deux fluorophores attachés à Hsp90, plateaux d’intensité (ii) plat, (iii) anti-corrélés comportement dans les canaux correspondants et (iv) au moins une liaison événement des AMP-PNP * (Figure 3). Plus de 400 molécules qui répondent aux critères de sélection ont été sélectionnés pour produire des statistiques fiables. Dans le système étudié, cinq Etats se distingués par l’intensité de fluorescence, avec quatre États étant fonctionnellement distinctes (Figure 2).

L’intensité de la fluorescence traces que la fluorescence partielle (PF, l’extension de l’efficacité de la frette pour expériences multicolore smFRET) peut être calculé (Figure 4 a). Le PF est liée à la proximité des colorants. Dans une expérience de trois couleurs smFRET, les données s’étend sur un espace 3D (Figure 5 b). Les projections de l’histogramme 3D 2D ont avéré utile pour la séparation de l’État (Figure 4 b, C). Dans une expérience réussie, tous les États qui sont théoriquement prévues dans les conditions expérimentales appliquées sont distinguent par leur PF dans les projections en 2D.

Les populations relatives des États sont déterminées à partir des projections en 2D en dessin à main levée polygones qui entourent le sommet (Figure 5). Cette approche s’est avérée être exactes et fiables9. Les probabilités d’émission pour le HMM sont obtenues en ajustant l’histogramme 3D de PF avec la somme des fonctions gaussiennes 3D, où S est le nombre d’États distinguables (cinq dans le cas présenté ; La figure 5). Pour cette forme de converger correctement, seulement la population relative pj’ai de chaque état j’ai doit être maintenue constante, tandis que la position et la largeur de la gaussiennes sont libres.

Un ensemble HMM est optimisé sur l’ensemble de données complet avec les probabilités d’émission fixées pour les paramètres obtenus à partir de l’ajustement gaussien (Figure 6). Afin d’obtenir une mesure de l’incertitude de la probabilité de transition extraites, IC de 95 % pour chaque transition est déterminé (Figure 7).

En outre, la moyenne de temps que les nucléotides marqués journaliste AMP-PNP * reste lié à la Hsp90 peut être extraite dans des conditions expérimentales différentes (Figure 8 a). Ceci aide à réduire la complexité des résultats. De le faire, les États qui représentent AMP-PNP * conformations dépendants et indépendants sont réduites dans les trajectoires de l’État, respectivement. De cette moyens dwell time pour l’AMP-PNP * dissociation peut être calculée (Figure 8 b).

En comparant la cinétique observée en l’absence et la présence de supplémentaires, non étiquetées AMP-PNP, uniques des informations sur la corrélation entre les changements de conformation de la Hsp90 et l’état de nucléotides peuvent être obtenues. Cela rend possible d’étudier directement la coopération entre les deux poches de liaison de nucléotides de Hsp90. En outre, elle contourne la nécessité d’expériences de titrage qui mesurent l’occupation de site de liaison en fonction de la concentration du substrat (par exemple, les parcelles de Hill). Pour les systèmes de hautement dynamique de protéine Hsp90, cette approche est également sensible aux petits changements dans le taux à11.

Figure 1
Figure 1 : Déroulement général de l’acquisition de données et d’analyse. Données sont acquis sur un microscope à fluorescence multicolore smFRET réflexion totale interne (TIRFM). Après sélection de la trace et le calcul de la fluorescence partielle (PF), l’histogramme 3D de PF et 2D projections de celle-ci sont compilées. En utilisant les 2D projections, la population de tous les États distinguables peut être déterminée. Ils sont utilisés comme une contrainte pour une gaussienne 3D apte à l’histogramme PF . Les fonctions de densité de probabilité gaussienne servent de probabilités d’émission pour l’ensemble 3D subséquent de modélisation de Markov cachés (HMM). Cela donne la description cinétique du système. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Schéma de l’acquisition de données. Pictogramme (A) du système étudié consistant en un dimère de Hsp90 (ovales jaunes représentent la structure de domaine) attachés à la surface avec les labels Atto488 (bleu) et Atto550 (vert) et le nucléotide de journaliste AMP-PNP * en solution, marquées avec Atto647N (rouge). Données sont enregistrées sur un microscope TIRF de prism-type avec une alternance d’excitation de laser (ALEX). (B) les traces de fluorescence exemplaire intensité (Fl. Int.) après excitation bleue et verte. Pictogrammes (C) des États conformationnels distinguables de Hsp90 (S,0, S1, S2, S3, S4) et leur identifiant respectif pour l’état fonctionnel (O, C, O *, C *) utilisée dans ce travail. Fluorophore postes sont indiqués en bleu, vert et rouge. Deux populations représentent l’état de fonctionnement même, à savoir ouvrir Hsp90 avec AMP-PNP * lié (S2 et S3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Critères de sélection. Molécule de (A) A sélectionné pour une analyse plus approfondie. (B, C) Molécules non sélectionné pour une analyse ultérieure. (B) aucun plat plateaux et Atto550 n’est à l’État foncé autour de 30 s après excitation verte (indiquée par des flèches). (C) blanchiment plusieurs étapes après excitation verte (indiquée par des flèches). FL. Int. : intensité de fluorescence, bleue : Atto488, vert : Atto550, Atto647N rouge, ex : excitation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Calcul des traces PF et histogrammes représentant. (A) représentant fluorescence intensité (Fl. Int.) traces et les traces de fluorescence partielle (PF) correspondante. (B) deux projections 2D de l’histogramme 3D de PF pour la mesure en absence des nucléotides supplémentaires, sans étiquette. (C) les mêmes projections pour l’expérience en présence de plus de 250 µM AMP-PNP. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Processus de sélection de la population. (A) la position des cinq populations distinguées les deux projections 2D. (B) copie des pictogrammes dans la Figure 2. (C) représentant nuage 3D des données PF . Coloration des points de données est seulement pour la visualisation. Le même code de couleur comme dans B est utilisé. (D) Détermination des populations relatives se faite par le dessin de polygones mains libres autour des sommets dans l’histogramme 2D. En utilisant une combinaison des deux projections représenté à la Figure 3, on peuvent distinguer les cinq populations. (E) des résultats de la gaussienne 3D apte à l’histogramme des données PF indiquées dans A. S sont les isosurfaces à mi-hauteur, qui représentent les cinq différentes populations. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Organigramme de l’optimisation de HMM 3D ensemble. Un modèle est optimisé pour toutes les molécules de l’ensemble de données. Les valeurs de départ sont donnés par le modèle d’entrée (avec un nombre prédéfini des États). La vraisemblance du modèle compte tenu des données (les traces PF 3D) est évalué avec l’algorithme Forward-Backward (FB). L’algorithme de Baum-Welch (BW) donne une estimation de maximum local de vraisemblance (MLE) des paramètres. Le MLE global puis se trouvent par itération. L’algorithme de Viterbi calcule la trajectoire d’État probablement un modèle donnée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Estimation des incertitudes significatives avec CI. (A) Détermination de l’industrie communautaire pour une constante de vitesse exemplaire. Le rapport de vraisemblance (LR) du modèle de test par rapport au modèle d’estimateur (MLE) maximum de vraisemblance est calculé dans la région autour de l’EMV pour la constante de vitesse. La confiance de 95 % liée est atteint lorsque la LR dépasse 3.841 (ligne grise foncé horizontal). (B) le taux d’extraction constantes sans nucléotides supplémentaires (rouge) et AMP-PNP (bleu) et leur IC à 95 %. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : La moyenne habiter le temps du nucléotide journaliste AMP-PNP * limite de Hsp90 est prolongée en présence de nucléotides complémentaires. (A) pictogramme de la dissociation observée des étiquetés AMP-PNP * partir du dimère de Hsp90, moyenne pour toutes les conformations de Hsp90. La structure de domaine de Hsp90 est représentée par des ovales jaunes et la flexibilité conformationnelle est indiquée en superposant un dimère ouvert et fermé. (B) moyenne habiter le temps d’AMP-PNP * lié à Hsp90 en absence de nucléotides supplémentaires (rouge) et en présence de 250 µM non AMP-PNP (bleu). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous présentons la procédure expérimentale pour obtenir des données de trois couleurs smFRET pour un système complexe des protéines ainsi qu’une description étape par étape de l’analyse de ces mesures. Cette approche offre la possibilité unique pour évaluer directement la corrélation entre plusieurs sites d’interaction ou de changements de conformation.

Pour obtenir des données de molécules simples multicolores adaptées sur les protéines, il est important d’effectuer des mesures reproductibles à un faible niveau sonore. Ceci peut être réalisé en utilisant un protocole de passivation de surface efficace et fiable pour le flux chambre9. Une densité suffisante des molécules immobilisée à la surface devrait servir à augmenter le rendement des molécules par film enregistré. Cela signifie que fluorescence lumineuse de molécules simples devrait tomber à environ 5 à 10 % des pixels dans les images enregistrées. En même temps une surcharge devrait être empêchée, parce qu’elle se traduirait par un chevauchement des voisins des molécules. Quand une espèce étiquetée est libre en solution (AMP-PNP * dans l’étude présentée), veillez à ce que la concentration est suffisamment basses pour ne pas interférer avec la mesure par excitation directe de lasers à ondes plus courtes (c'est-à-dire, généralement bien en dessous un micromolaires (concentration). En outre, s’assurer que la concentration de ces composés n’est pas plus faible que prévu en raison de la liaison non-spécifique aux interfaces. En outre, la puissance d’excitation optimal représente un compromis entre le rapport signal-bruit et le photoblanchiment des fluorophores.

Sans oxygène, système de nettoyage est employée dans le protocole présenté. Les colorants utilisés d’Atto-Tec n’apparaissent pas significatifs clignotant sur l’échelle de temps de l’expérience (70 ms illumination par cycle d’excitation) et pas de diminution du taux d’eau de Javel photo a été observée par un système de piège consistant à la glucose oxydase, catalase et le Trolox33 ,,34. Absence de désoxygénant évite aussi, artefacts en raison des interactions des protéines non spécifiques, comme les systèmes d’évacuation d’oxygène contiennent habituellement des constituants protéiques jusqu'à une concentration micromolaire35.

Une autre étape critique est la sélection de la trace. La taille de la zone pour la somme de l’intensité d’un fluorophore seul est choisie pour être aussi petit que possible, mais encore plus grande que le point de fonction de la configuration d’étalement. Sachez que les facteurs un plateau plat dans l’intensité commune traces seulement peuvent s’attendre si les canaux de détection sont similaire gamma apparent, car les traces ne sont pas corrigées à ce stade de l’analyse. Seules les molécules qui répondent à des critères bien définis pour les traces d’intensité de fluorescence sont inclus dans l’analyse (Section 3). Molécules avec un rapport signal-bruit pauvre dans les traces PF sont exclus de l’analyse et n’affectent pas l’évaluation des données comme sélection claire sont les critères utilisés.

Selon la qualité des données, moyens faire attribution de l’état optimal. Un ensemble multidimensionnel gratuit HMM basé soit sur la fluorescence intensité traces27 ou les traces PF pourraient être appliquées pour allouer les États sous-jacents en optimisant les probabilités d’émission correspondante (par exemple, gaussienne PDFs) alors qu’en même temps optimiser le modèle cinétique. Les deux approches ont leurs avantages et leurs inconvénients. Traces PF peuvent contenir des pointes défavorables tandis que les niveaux d’intensité de fluorescence varient de molécules. Le protocole présenté résout ce problème en prévenant les transitions artificielles lorsque surviennent des pics et en estimer que les probabilités d’émission d’une gaussienne 3D apte à l’histogramme PF et seulement optimiser les probabilités de transition dans la suite ensemble HMM exécuter.

L’approche présentée est limitée par la nécessité d’un partenaire d’interaction marquée qui se lie avec une affinité comparablement élevée afin d’être compatible avec les faibles concentrations nécessaires pour les mesures classiques de molécule unique. Cela peut être surmonté par stratégies pour augmenter la concentration locale (attachant de l’interaction partenaires36, encapsulation dans des vésicules37,38) ou des méthodes pour diminuer le volume excité (par exemple, zéro-mode guides d’ondes39). En outre, étiquetage des positions doivent être choisis avec soin et des expériences de contrôle sont nécessaires pour exclure les effets secondaires graves des fluorophores. Dans le cas de Hsp90, c’est généralement vérifiée par un test de l’ATPase, qui prouve l' activité enzymatique40. Si disponibles, des informations structurales de cristal ou structure RMN doivent envisager. Des positions privilégiées sont en boucles surface exposée, loin des interfaces d’interaction et pas enterré dans une poche de surface de protéine. Cela garantit un grand volume accessible pour la teinture.

Le cadre est idéal pour une expérience smFRET multicolore avec un nombre arbitraire de couleurs. Nous nous concentrons sur trois couleurs Mensurations ici, car elles prévoient déjà la caractéristique qui les rend distinctes d’autres expériences de la molécule unique, à savoir la possibilité d’observer directement la corrélation entre les deux processus (par exemple, la liaison d’un partenaire de l’interaction et des changements de conformation). Cette information est inaccessible dans une expérience smFRET de deux couleurs standard, mais est d’un intérêt fondamental pour comprendre la fonction de n’importe quelle machine moléculaire.

L’expérience présentée et l’analyse est capable de caractériser les systèmes de protéine, qui peuvent afficher dynamique sur un large éventail d’échelles de temps entre les États qui sont elles-mêmes très flexibles3. Elle diffère des expériences publiées antérieurement multicolore smFRET, qui mettait l’accent sur les systèmes de modèle ADN ou d’ARN, comme Holliday jonctions4, présentant des transitions entre États bien définies (généralement deux). Dans les systèmes de protéine, le rapport signal sur bruit est plus faible et extraire l’ensemble des probabilités de transition est difficile en raison de la largeur de bande limitée temporelle dans les expériences de smFRET en raison de photoblanchiment. Ici, nous montrons que - si appliqué avec soin et avec des contraintes raisonnables - les obstacles en protéines les ensembles de mesurage peuvent être surmontées avec smFRET multicolore à l’aide de répartition État multidimensionnel et ensemble hidden Markov analyse9.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Acknowledgments

Ce travail est financé par la Fondation de recherche allemande (INST 39/969-1) et le Conseil européen de la recherche par le biais de la Convention de subvention ERC n. 681891.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Setup
vibration-damped optical table   Newport, Irvine, CA, USA RS2000
OBIS 473nm LX 75mW LASER Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA 1185052
OBIS 532nm LS 50mW LASER Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA 1261779
OBIS 594nm LS 60mW LASER Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA 1233470
OBIS 637nm LX 140mW LASER Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA 1196625
laser control unit Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA 1234465 Scientific Remote
aspheric telescope lenses Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA d=25.4mm, f=50mm and f=100mm
CF ex1 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany ZET 473/10 cleanup filter excitation
CF ex2 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany ZET 532/10 cleanup filter excitation
CF ex3 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany ZET 594/10 cleanup filter excitation
CF ex4 Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA FL635-10 cleanup filter excitation
DM ex1 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany ZQ594RDC dichroic mirror excitation
DM ex2 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany 570DCXR dichroic mirror excitation
DM ex3 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany ZQ491RDC dichroic mirror excitation
AOTFnC-Vis AA Opto-Electronic, Orsay, France
λ/4 plate Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA AQWP05M-600
CFI Apo TIRF 100x Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA high-NA objective
piezo focus positioner MIPOS 250 CAP piezosystem jena GmbH, Jena, Germany Piezo Controller NV 40/1 CLE
piezo stepper Newport, Irvine, CA, USA PZA12 PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit
achromatic aspheric lenses Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, Germany G322-304-000 d=50mm, f=200mm
adjustable optical slit Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany 27.160.1212 max. aperture 12 x 12 mm
DM det1 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany T 600 LPXR dichroic mirror detection
DM det2 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany H 560 LPXR superflat dichroic mirror detection
DM det3 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany HC BS R635 dichroic mirror detection
BP det1 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany 525/40 BrightLine HC bandpass filter detection
BP det2 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany 586/20 BrightLine HC bandpass filter detection
BP det3 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany 631/36 BrightLine HC bandpass filter detection
BP det4 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany 700/75 ET Bandpass bandpass filter detection
optical shutters detection Vincent Associates, Rochester, NY, USA Uniblitz VS25S2T0 
EMCCD iXon Ultra 897 Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland
digital I/O card, PCIe-6535 National Instruments, Austin, Texas, USA
syringe pump Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA PHD22/2000
Name Company Catalog Number Comments
Flow chamber
quartz slides G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA Spectrosil2000, h=3mm
TEGADERM film 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany 1626W 10 x 12cm
spray adhesive 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany Photo Mount 050777
glycerol Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany Immersol G
immersion oil OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, Germany IMMOIL-F30CC
prism Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany Suprasil1
aluminium prism holder custom built
hollow setscrews Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA with custom drilling
Tygon S3 E-3603 tubing neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany 2-4450 ACF00001
PTFE tubing Bohlender GmbH, Grünsfeld, Germany S1810-08
Name Company Catalog Number Comments
Sample
yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin UniProt ID P02829
Maleimide derivatives of Atto488, Atto550 ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany
AMP-PNP* Jena Bioscience, Jena, Germany γ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N
Fluospheres Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA F8764 amine-modified, 0.2 μm, yellow-green fluorescent
Name Company Catalog Number Comments
Software
Andor Solis Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland version 4.30
LabVIEW National Instruments, Austin, Texas, USA version 2012, 32bit; misc. hardware control
MDS control software AA Opto-Electronic, Orsay, France version 2.03a
Coherent Connection Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA version 3
Igor Pro WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA version 6.37

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Biochimie biophysique cinétique de protéine numéro 131 smFRET multicolore FRBR HMM Hsp90 coopérativité molécule unique vous inquiétez
À l’aide de trois couleurs frette de molécules simples pour étudier la corrélation des Interactions de protéine
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Götz, M., Wortmann, P., Schmid, … More

Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions. J. Vis. Exp. (131), e56896, doi:10.3791/56896 (2018).

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