Summary
Здесь мы представляем протокол для получения трехцветных smFRET данных и их анализ с 3D ансамбль скрытой марковской модели. С этим подходом ученые могут извлекать кинетическая информацию из сложных белковых систем, включая кооперативность или коррелированные взаимодействий.
Abstract
Одноместный молекула Фёрстер резонанс передачи энергии (smFRET) стала широко используемый биофизический метод для изучения динамики биомолекул. Для многих молекулярных машин в клетки белки должны действовать вместе с взаимодействия партнеров в функциональных цикла для выполнения их задачи. Расширение два цвета многоцветные smFRET позволяет одновременно исследовать более чем одной взаимодействия или конформационные изменения. Это не только добавляет новое измерение к smFRET эксперименты, но он также предлагает уникальную возможность непосредственно изучить последовательность событий и Обнаружение коррелированных взаимодействия при использовании иммобилизованных образца и полного внутреннего отражения флуоресценции Микроскоп (TIRFM). Таким образом многоцветные smFRET является универсальным инструментом для изучения биомолекулярных комплексов в количественном выражении и ранее недостижимое подробно.
Здесь мы продемонстрируем для преодоления особых проблем многоцветные smFRET экспериментов на белки. Мы представляем подробные протоколы для получения данных и извлечения кинетическая информации. Это включает в себя критерии отбора трассировки, разделение государства и восстановления государства траекторий от шумных данных с использованием 3D ансамбль скрытой марковской модели (HMM). По сравнению с другими методами, кинетическая информация не восстанавливается от гистограммы времени останавливаться, но непосредственно от Хм. Рамки максимального правдоподобия позволяет нам критически оценивать кинетическая модель и для обеспечения значимого неопределенности для ставок.
Применяя метод белка теплового шока 90 (Hsp90), мы в состоянии отделить нуклеотида привязки и глобальные конформационные изменения белка. Это позволяет нам непосредственно наблюдать кооперативность между двумя нуклеотидов привязки очагов Hsp90 димер.
Introduction
Многие белки выполняют свои функции в динамической комплексы с другими молекулами, посредничестве конформационные изменения и переходных ассоциаций по широкому спектру сроков1,2,3. В сочетании с внешнего источника энергии (например, АТФ) эти динамические взаимодействия может привести к получателю в цикле функциональных и в конечном счете сохранить неравновесного установившемся в клетке, необходимым условием для жизни.
Для того чтобы полностью понять эти молекулярные машины, статическое описание, руководствуясь структурных исследований не является достаточным. Кроме того важно иметь знания о базовой кинетической модели и определить константы кинетической скорости. Несколько существующих методов позволяют исследователям изучить динамику бинарных взаимодействий между двумя молекулами интерес, например, поверхностного плазмон резонанс, методы релаксации с спектроскопических индикация (например, прыгать или остановить поток методы) и ядерного магнитного резонанса. Однако их применимости, в большинстве случаев, ограничивается простых систем двух государств (например, одна граница и одно государство, несвязанных) благодаря усреднение присущие массовых экспериментов. В тех случаях, когда речь идет о более государств или промежуточных продуктов они дают только сложная смесь константы скорости. Одноместный молекула методы, такие как магнитные или оптические пинцеты или два цвета smFRET, то есть, один из доноров и один акцепторной Флюорофор, с образец поверхности прикол может восстановить константы скорости для всех наблюдаемых конформационных изменений. Однако когда дело доходит до взаимодействия, затрагивающих более одной привязки сайта, эти методы по-прежнему ограничены, и информация о возможной корреляции двух (или более) взаимодействия только будут доступны через косвенные выводы из набора экспериментов.
Многоцветные smFRET4,5,6,,78,9 предлагает возможность изучить взаимодействие между этими компонентами непосредственно в режиме реального времени и под рядом физиологические условия10. Это позволяет исследовать например, конформация зависимых Связывание лиганда или другой белок8,9,11. Общий подход, представленные здесь является маркировать белки интерес в определенных позициях, прикрепить один белка на поверхности измерительной камеры, а также отслеживать интенсивности флуоресценции со временем на призму типа TIRFM (для подробности см 9 , 12). пространственная близость различных красителей, затем может быть определено из передачи энергии между ними. Маркировка стратегии может варьироваться от белка белка (обзор в 13) и руководящие принципы, чтобы избежать артефактов в smFRET измерения существуют14.
Поскольку краска доноров может передавать энергию различных акцептора красителей в эксперименте многоцветные smFRET, относительное положение всех красителей не доступен от возбуждения одного красителя только15,16. Но в сочетании с чередующимися лазерного возбуждения (Алекс17и рассмотренных в 18) Этот метод обеспечивает все пространственно временной информации на секунды и резолюции Подкомиссии нанометров.
В принципе высоким разрешением, которую структурная информация может быть достигнуто с помощью расстояния между краситель рассчитывается из комбинации всех интенсивностью флюоресценции в многоцветные smFRET эксперимент с АЛЕКСОМ. Однако здесь мы сосредоточиться на идентификации состояний и разделения, а также добыча кинетической модели, где smFRET многоцветные незаменим. Когда «только» для определения структуры путем триангуляции, набор проще-двухцветный smFRET экспериментов с высоким соотношением сигнал шум может быть осуществляется12,19.
Мы используем частичное флюоресценция (
) как прокси для передачи энергии между двумя флуорофоров7. PF рассчитывается от интенсивности флуоресценции аналогична эффективности ладу-двухцветный эксперимента:
Где 
интенсивность выбросов канал ет после возбуждения с цветом ex, и c акцептор с длинной волны. Обнаружение каналов представляют собой ту же позицию в пример камеры, но записи различных спектральных диапазонах света флуоресцирования. Тот же идентификатор для возбуждения и выбросов используются в настоящем Протоколе (т.е., «синий», «зеленых» и «красных»).
Из-за экспериментальной недостатки интенсивностью флюоресценции измеренных зависит не только на передачу энергии, но и на Флюорофор и установки свойств. Чтобы получить истинное энергетической эффективности передачи между двумя флуорофоров, измеряемых интенсивностей должны быть исправлены. Следующая процедура основана на ссылку9. Поправочные коэффициенты для явного утечки (lk, т.е. обнаружение фотонов от Флюорофор в канале, предназначенные для другого красителя) и очевидной гамма (ag, т.е. квантовый выход флуоресценции красителя и эффективность обнаружения канала) получаются из одной молекулы следы, которые показывают акцептора отбеливания событие.
Утечки доноров красителя в каждый канал возможно акцептора рассчитывается от всех точек данных в записанных флуоресценции следы где краска акцептора отбеленная, но доноров до сих пор флуоресцентные (
):
Медиана утечки гистограммы используется как фактор явно утечки. После коррекции для утечки очевидной гамма фактор определяется из того же набора трассировок. Она рассчитывается путем деления изменения флюоресценции в акцепторной канал изменения флюоресценции в канале доноров после отбеливания акцептора красителя:
Где c снова является каналом обнаружения акцептор с длинной волны. Медиана распределения результирующей используется как очевидной поправочный коэффициент.
Исправленные интенсивностей в каждом канале получаются путем:
PF рассчитывается согласно:
Различные группы населения могут быть разделены в многомерном пространстве, занимаемых PFs. Положение и ширину каждого государства определяется путем установки данных с многомерной функции Гаусса. Последующей оптимизации одной глобальной Хм, основанные на все следы PF обеспечивает количественное описание наблюдаемых кинетики. Даже небольшие изменения ставок обнаруживаются.
HMMs обеспечивают способ выведение модель государства из коллекции шумных следы. Система считается одним из набора дискретных, скрытые состояния в любой момент времени и фактические наблюдения (т.е. выбросов) является вероятностное функцией этой скрытой государственной20. В случае TIRFM smFRET данных выбросов вероятностей b,я за государство, я могут быть смоделированы путем непрерывного Гауссова плотность вероятности функций. В точках через равные интервалы времени дискретных переходы от одного до другого государства может произойти согласно переход вероятность того, что время инвариантная и зависит только от текущего состояния. Матрицы перехода A содержит эти вероятности перехода ij между всеми скрытые государствами. Начальное состояние распространения 
дает вероятностей положени специфически 
для первой точки время время трассировки. Методом максимального правдоподобия, эти параметры могут быть оптимизированы, чтобы лучше всего описать данные с вперед-назад и Баум-Уэлч алгоритмов20,21. Это дает оценок максимального правдоподобия (MLE). Наконец государство последовательность, которая скорее производится траектории наблюдений может быть выведено с Витерби алгоритм. В отличие от других анализов Хм smFRET данных24,,2526 мы не используем HMM как всего лишь «разглаживание» данных но экстракт кинетическая общегосударственной модели из набора данных без необходимости для установки времени задержки гистограммы27. HMM анализ делается с собственных скриптов с использованием Игорь Pro. Реализация кода основана на ссылку21. Мы предлагаем комплект программного обеспечения и образцовые данные на нашем сайте для того, чтобы следовать разделы 5 и 6 настоящего Протокола (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Полное программное обеспечение предоставляется по запросу.
Времени точек данных с PF < -1 или PF > 2 в любой канал обнаружения назначаются минимальные выбросы вероятность для всех государств (10-200). Это предотвращает искусственных переходы в этих точках данных.
Параметры для вероятностей выбросов получаются из fit 3D PF гистограммы с гауссова функций, как описано в шаге 5.7. Эти параметры хранятся фиксированной во время оптимизации Хм.
В представленный подход начальное состояние распределение вектора и матрицы перехода используются глобально описать весь ансамбль следов. Они обновляются на основе всех N молекул из набора данных по ссылке27.
Параметры запуска для распространения начального состояния определяются из 2D прогнозы PF гистограммы (шаг 5.3) и вероятности перехода устанавливаются 0,05 за исключением вероятность остаться в том же состоянии, которые выбираются такие что вероятность оставить определенного состояния нормализуется к единству.
Метод профилирования вероятность используется дать доверительные интервалы (ди) для всех перехода ставки21,22, которые служат в качестве значимых оценок их неопределенности. Для вычисления границы CI для конкретной скорости, вероятность перехода интерес фиксируется значение, отличное от ОМП. Это дает тест модель λ'. Соотношение (LR) тест вероятности вероятности 
набора данных 0 выполняется согласно:
95% доверия, предназначенной для параметра достигается, когда LR превышает 3.841, 95% квантиль о x2-распределение с одной степенью свободы22,23.
Сила метода подтверждается с помощью Hsp90. Этот белок в изобилии встречается в бактерий и эукариот и является частью клеточного стресса ответ28. Это перспективные цели наркотиков в рака лечение29. Hsp90 является Антуану с один карман привязки нуклеотидов в N-концевой домен каждая субъединица30. Он может подвергнуться переходы между по крайней мере двух глобально собственный конформации, закрывается и один N-терминала открытым, V-образный конформации19,31,32. Димерной природы непосредственно поднимает вопрос о взаимосвязи между двумя сайтами привязки нуклеотидов в Hsp90.
В следующем, мы предоставляем пошаговые протокол для сбора и анализа данных эксперимента трехцветной smFRET дрожжи Hsp90 и нуклеотидов. Конформации зависимые привязки дневно обозначенные AMP-PNP (AMP-PNP *, не гидролизуется аналоговый АТФ) анализируется. Приложение описанная процедура позволяет исследование нуклеотида привязки и в то же время конформационные изменения Hsp90 и таким образом раскрывает кооперативность между двумя нуклеотидов привязки очагов Hsp90.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Установка и предпосылки
- Выполните измерения многоцветные smFRET Призма типа TIRFM. Описание установки двух цветные как Зевс публикации дается ссылка12.
- Постройте TIRFM многоцветные. Генеральный план подробно в 9.
- Использование переключаемый, диодной накачкой непрерывная волна Лазеры твердотельные, которые сделать ненужным использование механических жалюзи в пути возбуждения.
- Использовать асимметричный, удлиненные Призма, что предотвращает заднюю отражение луча возбуждения с задней стороны ввести цель.
- Используйте 2-дюймовый ахроматические асферические кварцевое линзы в пути обнаружения, которые собирать столько света как можно скорее и предотвратить auto флуоресценции и аберраций, например, искажения в нецентральных регионах изображения.
- Фокус каждого обнаружения пути на чипе EMCCD с объективом отдельно. Это позволяет оптимально сфокусировать каждого канала обнаружения.
Осторожностью: Класс 3B лазеры используются в TIRFM. Это означает, что они являются опасными, если глаз подвергается непосредственно, но, диффузные отражения не вредны. Обеспечить соблюдение лазерной предосторожности согласно местных правительственных постановлений, прежде чем система эксплуатируется.
- Определение поправочных коэффициентов для установки и Флюорофор свойств, заранее с помощью dsDNA образцов.
- Использовать один высокий ладу dsDNA образец для каждой краски в сочетании с акцептором, с длинной волны возбуждения (для представленных установки: Atto488-Atto647N, Atto550-Atto647N, Atto594-Atto647N). Убедитесь, что ДНК дополнительно изменена с биотин.
- Разбавить образца до 5 нм с TNM буфера (5 мм трис рН 7,5, 5 мм NaCl, 20 мм MgCl2) и 2 мм Trolox (также использовать этот буфер для измерения).
- Иммобилизации dsDNA, как описано для Hsp90 2,5 и 2.7.
- Вычислите поправочные коэффициенты для явного утечки (ЛК) и очевидной гамма (ag) из одной молекулы следы, которые показывают акцептора отбеливания событие.
- Постройте поток камеры, что бутерброд PEG/биотин PEG пассивированы кварц слайда, тонкая пленка, которая является клей с обеих сторон и крышка выскальзования. Для детализации протоколов для очистки кварцевых слайды и пассивации см ссылку9.
- Использование толстых (3 мм) кварцевые слайды геометрически предотвратить коллекции лазерного света, разбросанных на стыке призму и слайд функционализированных кварц кварц глицерин кварц.
- Используйте тонкий (40 мкм) пленки, которая распыляется с клеем на стороне non клей для запайки. Тонкая пленка уменьшает расстояние между придает поверхности молекул и цели. Нагрейте до 80 ° C и нажмите.
- Поместите крышку выскальзования на вершине. Нагрейте до 80 ° C и нажмите. Используйте капли глицерина при размещении камеры потока через призму.
Примечание: Материалы призму и кварц слайды, а также глицерина, соответствует индекс.
- Экспресс Hsp90 от Saccharomyces cerevisiae , в виде двух единого хвоща точки мутантов на позициях D61 или Q385. Добавьте Терминал C биспиральных мотив для предотвращения димер диссоциации в picomolar концентрациях. Ярлык мутантные белки отдельно и обмена мономеров для получения гетеродимерами, помечены Atto488 позиции 61 аминокислоты и Atto550 аминокислота позиции 3859.
2. измерение
- Запустите программное обеспечение камеры и изображений, задайте указанные ниже:
- Установите температуру охлаждения как низкий, как можно (-95 ° C с внешним водяным охлаждением) уменьшить темные текущей шум датчика.
- Используйте настройки камеры, которые оптимизированы для записи одной молекулы: 3.3 МКС вертикального сдвига скорости, напряжения обычных вертикальных часов, 17 МГц 16-битный горизонтальный зачитал, предварительного усиления получить 3, прирост электронный умножитель 1000.
- Задайте срабатывание приобретение «Внешних» и выдержка 70 г-жа записи фильмов с длиной 750 приобретение циклов.
Примечание: Выключите свет комнаты приобретая камеры для предотвращения насыщения EMCCD датчика.
- Создайте папку на локальном SSD для измерения. В программном обеспечении настройки перейдите к < Auto-Save > Райдер, включить < Auto-save > и выберите формат файла «Tiff» для приобретения кино. Выберите папку на SSD как auto сохранить местоположение.
- Запустите программное обеспечение, контроль Акусто оптический перестраиваемый фильтр (AOTF), программное обеспечение, которое управляет работой лазеров и триггер программное обеспечение, которое синхронизирует лазеры, AOTF, жалюзи в пути обнаружения и камеры. Отрегулируйте мощность лазера с AOTF (ОК. 3 МВт перед входом призму) и загрузить правильный шаблон запуска.
- Смонтировать держатель образца с призму и потока камеры, присоединить трубки, место впускной трубы в чашку microcentrifuge и подключите выход трубы к шприцевой насос. Потолочные камеры с приблизительно 150 мкл буфера, выровнять возбуждения луч и фокус. Отбеливать любой флуоресцентные загрязнений на поверхности, медленно перемещая вдоль дальность обнаружения полного слайда с лазера мощностью около 10 МВт для всех лазеров. Это занимает примерно 1 час.
Примечание: если не указано иное, используется буфер содержит 40 мм HEPES pH 7.5, 150 мм KCl и 10 мм MgCl2. - Промыть примерно 300 мкл раствора NeutrAvidin (0,25 мг/мл в буфере) в камеру и инкубировать 1 мин флеш из несвязанных NeutrAvidin с буфера и флеш примерно 300 мкл раствора БСА (0.5 мг/мл в буфере) через камеру.
Примечание: Этот блок, остальные поверхности функционализации дефектов на неспецифические адсорбции на поверхности БСА. - Иммобилизации образец путем загрузки потока камеры с приблизительно 150 мкл биотинилированным и помечены Hsp90 на рост концентрации (разводят в буфер + 0.5 мг/мл BSA) пока не будет достигнут достаточной поверхностной плотности, которая обычно происходит в концентрации из 5-10 вечера. Промойте несвязанных белка с приблизительно 300 мкл буфера + 0.5 мг/мл BSA.
- Заподлицо в 150 мкл 25 Нм, AMP-PNP * в буфер + 0.5 мг/мл BSA. Пусть это инкубировать в течение 5 минут и повторить этот шаг один раз для обеспечения правильного нуклеотидов концентрации.
Примечание: Для экспериментов при наличии дополнительных, неподписанном AMP-PNP, также добавить 250 мкм AMP-PNP. - Начнем с получения данных. Для соответствующего количества данных приобретают примерно 20 фильмов, которые занимает около 1,5 часа.
- Переместите позицию перпендикулярно возбуждения пучка с пьезо степпер для изменения поля зрения камеры образец.
- Отрегулируйте фокус с z пьезо, определяющее высоту цели при необходимости. Это не должно быть необходимости слишком часто когда измерительной камеры смонтированы без наклона.
- Подготовка записи камер, нажав < принимать сигнал > в программное обеспечение камеры и начать возбуждения/приобретение циклов, используя кнопку < Пуск > в программном обеспечении триггера. Это начинается на приобретение интенсивности флуоресценции.
- Первая запись фильма с флуоресцентные бусы, которые показывают флуоресценции выбросов в спектральном диапазоне всех каналов обнаружения установки для выполнения регистрации канала. Затем обнаружить позиции шарика в фильме калибровки, ища ярких пятен и определить, что центральное место от Гаусса подходят к профилю интенсивности. Сохраните координаты бусы, которые находятся во всех каналах и подходят оба сопоставления смещение x - и y-направлении с 2D многочлен степени три9.
3. Выбор одной молекулы следы
- Анализ данных делается с собственных скриптов с использованием Игорь Pro. Загрузить все необходимые скрипты, открыв «iniTIRF.ipf» и выберите правильный тип эксперимента.
Примечание: В следующих, < Button > указывает интерактивных элементов в меню или пользовательский интерфейс. Вызовы функций указаны в кавычки, например, «Print «Hello World»». Эти команды могут быть вставлены в командной строке Игорь Pro (без заключающих кавычек). - Убедитесь, что параметры для регистрации канала обнаружения загружаются.
- Запустить графический интерфейс пользователя, нажав кнопку < smFRET новые | Анализ GUI >.
- Загрузите фильмы (т.е., последовательность кадров с 512 x 512 пикселей, хранящиеся как 16-битных TIFF стеки), которые держат интенсивность на соответствующих каналах. Это можно сделать, нажав кнопку < нагрузки фильм > и выбрав файлы из так называемых «Мастер» и «slave» камеры один после другого.
- Определение позиции потенциальных одной молекулы путем поиска для ярких пятен в сумме первых пяти кадров в определенный канал обнаружения. Вычислите соответствующие позиции во всех других каналах обнаружения из сопоставления канала. Для получения трассировки интенсивности флуоресценции, сумма интенсивность пикселя вокруг центральной позиции для каждого кадра. Это можно сделать, нажав на кнопку < найти следы > в GUI.
Примечание: Длина стороны квадрата (в пикселях) дается: 2 * < Sum Pxs > + 1. - Для каждой молекулы Вычислите совместной интенсивности сырья следа как сумма всех следов этого места с тем же цветом возбуждения. Вычисления профиля интенсивности молекулы во всех каналах для следующих критериев:
- Примерно плоского плато в совместных сырье интенсивности и один отбеливания шаг для всех цветов возбуждения, anticorrelated поведения в соответствующих обнаружения каналов, обнаружение красной флуоресценцией (указанием лад для связанного AMP-PNP *) по крайней мере один раз в течение трассировки, а не несколько шагов в красной флуоресценцией, который будет указывать на наличие двух AMP-PNP * привязаны к одной Hsp90 димер.
- Если эти критерии выполнены сохраните флуоресценции следы местом для дальнейшего анализа. Это можно сделать, выбрав трассировки с помощью курсора и затем нажав кнопку < сохранить > в графе «сроки». Вручную проверяйте интенсивности следы во всех трех каналах обнаружения после синий возбуждения для около 200 молекул за фильм.
4. Расчет следы частичного флуоресцирования
- Отображать все следы интенсивности флуоресценции для одного из сохраненного молекул. Используйте курсоры в графе для выбора интервалов времени.
- Выберите интервал времени, где все флуорофоров отбеленные уже. Интенсивность средняя фон рассчитывается из этого диапазона и вычитается из интенсивности след в каждом канале. Это можно сделать, нажав на кнопку < фон >.
- Выберите диапазон эффективности ладу, где по крайней мере как красители прилагается к Hsp90 (Atto488 и Atto550) присутствуют. Убедитесь в том исключить следы, которые содержат мигающий событий (см. рисунок 3B). Эти события характеризуются падение интенсивности флуоресценции в одном канале без сопровождающих увеличение любой другой канал.
- Вычислите PF следы. Это можно сделать, нажав на кнопку < PF Calc >. Предопределенные поправочные коэффициенты для явного утечки (ЛК) и очевидной гамма (ag) применяются к сырой интенсивности для того чтобы исправить для фото физической и установки свойств.
5. население подбор и установку 3D гистограммы
- Удаление молекул, которые показывают низкое соотношение сигнал шум в PF следы. Молекулы, которые превышают интервал [-1; 2] следов PF для более чем 10% кадры удаляются из набора данных. Это можно сделать, выполнив «RemoveTracesLowSNR()» из окна команд.
- Вычислите сегментированием 2D прогнозы PF данных. Участок
над 
и 
за в диапазоне [-0,5; 1,5] с разрешением 100 x 100 бункеров. Чтобы сделать это, выполните:- «HistFret2D («r_b», «r_g», binHist = 100)»
- «HistFret2D («r_b», «g_b», binHist = 100); MoveWindow 553,5, 42,5, 1055.25, 508.25"
- Определите относительную населения каждого различимых государства в 2D прогнозы.
- Вывести соответствующий график на передний план и выполнить «panelHist2DCount()».
- Нажмите на кнопку < Init > и нарисовать многоугольник свободной рукой вокруг пика.
- Нажмите на кнопку < Count >. Количество точек данных в многоугольнике и общее количество точек данных в проекции выводятся в окне командной строки.
- Подготовка 3D гистограммы данных PF , выполнив» HistFret3D («g_b», «r_b», «r_g»)».
- Нормализовать 3D гистограммы для интеграла 1. Выполните следующее:
- «NewDataFolder/S fit0»
- «Дублировать/O:: лад: Hist3D, Hist3D»
- «Div переменной/g = sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0)) ^ 3»
- «Hist3D / = div; Печать div»
- Обеспечивают исходные параметры для 3D Гаусса подходят и подготовить необходимые данные структуры.
- Выполнить «Gauss3D_initParam(); редактировать W_coef_old.»
- Добавьте в конец вектора параметров состояния населения.
- Выполнение «Gauss3D_prepareFit().»
Примечание: W_coef_old представляет собой вектор, содержащий начальные параметры для fit. Состояние это значит
и населения государства, которое объединяется в конце вектора. Убедитесь, что ковариационная матрица симметрична.
- Подходят на сумму S 3D Гаусса функций 3D PF гистограммы, с S количество различимых государств.
- Выполнение «do3D().» Это может занять час или больше на обычный офисный компьютер, в зависимости от качества начальных параметров.
- Выполнить «postprocessFitMultiGauss3D(); evalFitMultiGauss3D(); редактировать W_coef.»
- Отображение результата подходят. Для каждого из двух 2D прогнозов используйте следующие команды:
- «contourPF3D_new(0); contourPF3D_new(1); contourPF3D_new(2); contourPF3D_new(3); contourPF3D_new(4)»
- «contourPF3D_colorize()»
над 
и 
за 
и населения государства, которое объединяется в конце вектора. Убедитесь, что ковариационная матрица симметрична.6. кинетический анализ с 3D ансамбль Хм
- Подготовьте ансамбль Хм, запустить для извлечения кинетическая информации. Один HMM оптимизирован от всех молекул в наборе данных. Используйте информацию, полученную на предыдущем шаге, чтобы определить положение и ширину каждого государства в 3D пространстве ПФ .
- Инициализировать пользовательский интерфейс Хмм (< Хм | Init Хм >) и выбрать соответствующее количество государств (в случае Hsp90 данных это означает < NumStates > = 5), количество размеры входного сигнала (< NumDims > = 3) и тип ввода (< Input Type > = «Ладу 3D bgr»).
- Оптимизировать параметры Хм, позволяя сходятся вероятность HMM программного обеспечения (выполнение «prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1), -14)») до тех пор, пока изменения матрицы перехода по сравнению с предыдущей итерации падает ниже порогового значения (10 -14 на сумму абсолютное изменение для каждой вероятности перехода). Это дает MLE для вероятностей перехода в около часа на обычный офисный ПК.
- Повторите выбор населения, Гаусса подгонки и HMM оптимизации для подмножеств данных (например, 75% из полного набора данных). Если полный набор данных был объединен с различных экспериментов, повторите оптимизации также для каждого единого экспериментов. Анализ подмножеств позволяет оценить неопределенности выбора ручного населения и изменчивости в пределах набора данных.
- Вычислите CI для вероятностей перехода, которые сообщают о неоднородности набор данных и точность HMM.
- Получить грубую оценку CI границы путем выполнения «cd $(корень: path3Dimport + «Хм»); loop_getCI_estimate_limits().»
- Рассчитайте точные пределы CI, выполнив:
- «loop_getCI_HMM_converge(1)»
- «CIresults_conv_new()»
- «cd:: HMM_CIresult; reportCI_conv()»
- «cd:: cmp_CI_conv; CI_plot2 («Хм», doAppend = 0)»
- Уплотнить кинетическая имеющейся информации для упрощения интерпретации.
- Соберите информацию о времени, что обозначенные нуклеотидов остается привязанным к Hsp90. Сделать это путем сворачивания государств, которые обязаны AMP-PNP * (т.е. S1,2 S и S3, см. также рис. 2) и компилировать гистограммы время останавливаться. Выполнение «cd $(корень: path3Dimport + «Хм»); collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0}) «, которая сочетает в себе пребывает из государства0 S и S4 , а также S1, S2и S3.
- Извлечь раз останавливаться из Витерби пути для каждого государства, интересов и сравнить время гистограмма останавливаться для различных экспериментальных условиях. Выполнение «plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1).»
- Для получения более подробной картины крах государств, которые имеют собственный PF , но функционально идентичны для облегчения дальнейшего анализа данных, например, в случае трехцветной эксперимент с надписью Hsp90 и нуклеотидов, государства S2 и S 3 может быть свернут. Выполнение «collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4}).»
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Многоцветные smFRET измерения позволяют прямое обнаружение корреляции между двумя или более сайтами различных взаимодействия. Это делает технику уникальный расследовать многокомпонентных систем, таких как белковых комплексов. Мы сосредоточены на презентации трехцветной smFRET эксперимента здесь, который служит наглядным примером.
На рисунке 1показан процесс общего метода. Первая часть включает в себя записи данных многоцветные smFRET на микроскопе TIRF Призма типа. Стратегия поверхности насадку и схемы установки изображены на рисунке 2A. Более подробное описание установки обратитесь к ссылка9. Вторая часть представленных метода сосредоточена на анализе данных. Образцовый флуоресценции интенсивности следы показаны на рисунке 2B. Подходящее время следы шоу: (i) ясно отбеливания шаг для обоих флуорофоров, придает Hsp90, (ii) плоская интенсивности плато, (iii) анти коррелированных поведение в соответствующие каналы и (iv), по крайней мере один привязки события AMP PNP * (рис. 3). Более чем 400 молекулы, которые удовлетворяют критериям отбора были отобраны для получения надежных статистических данных. В системе изучал пять государств можно отличить по интенсивности флуоресценции, с четырьмя государствами, что функционально различных (рис. 2 c).
От интенсивности флуоресценции следы частичное флюоресценция (PF, расширение ладу эффективности для экспериментов многоцветные smFRET) может быть рассчитана (рис. 4A). PF связано с близостью красителей. В эксперименте трехцветной smFRET данных охватывает 3D пространстве (Рисунок 5B). 2D проекции 3D гистограммы оказались полезными для разделения государства (рис. 4б, C). В успешный эксперимент все государства, которые теоретически ожидаются в прикладной экспериментальных условиях, отличаются по их PF в 2D прогнозы.
Относительный населения государств определяются от прогнозов, 2D рисования многоугольников свободной рукой, которые окружают пик (рис. 5 c). Этот подход оказался9точной и надежной. Вероятности выбросов для Хмм получаются путем установки 3D PF гистограммы с суммой 3D функции Гаусса, где S — количество различимых состояний (пять в представленном случае; Рисунок 5 d). Для этого подходят правильно сходятся только относительная населения p,я из каждого государства я должен проводиться постоянная в то время как положение и ширину по Гауссу бесплатно.
Один ансамбль HMM оптимизирована за полный набор данных с вероятностью выбросов, фиксированные параметры, полученные из Гаусса fit (рис. 6). Для того чтобы получить мера неопределенности извлеченные перехода вероятностей, 95% ДИ для каждого перехода определяется (рис. 7).
Кроме того, среднее время, что обозначенные репортер нуклеотидов, AMP-PNP * по-прежнему привязаны к Hsp90 могут быть извлечены в различных экспериментальных условиях (рис. 8A). Это помогает дальнейшему сокращению сложности результатов. Чтобы сделать это, государства, которые представляют AMP-PNP * связанные и несвязанные конформации свернуты в состояние траекторий, соответственно. От этого времени средний останавливаться для AMP-PNP * диссоциации может быть рассчитана (Рисунок 8B).
Сравнивая кинетики, наблюдается отсутствие и наличие дополнительных, могут быть получены немеченого AMP-PNP, уникальную информацию о взаимосвязи между конформационные изменения Hsp90 и состояние нуклеотидов. Это позволяет непосредственно изучать кооперативность между двумя нуклеотидов привязки очагов Hsp90. Кроме того он обходит необходимость титрование экспериментов, которые измеряют привязки сайта оккупации как функция концентрации субстрата (например, участки Хилл). Для высокодинамичных белка систем, таких как Hsp90 этот подход также чувствителен к небольшие изменения в тарифы11.
Рисунок 1 : Общий процесс сбора данных и анализа. Данные, полученные на микроскопе флуоресценции многоцветные smFRET полного внутреннего отражения (TIRFM). После трассировки подбор и расчет частичного флуоресценции (PF) компилируются 3D PF гистограммы и 2D прогнозы их. Используя 2D прогнозы, могут быть определены населения всех государств различимыми. Они используются как ограничение для 3D Гаусса, подходят для PF гистограммы. Гауссова плотность вероятности функции служат выбросов вероятностей для последующего 3D ансамбля скрытые марковские моделирования (HMM). Это дает кинетическое описание системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Схема приобретения данных. (A) пиктограмма изучал система, состоящая из Hsp90 димер (желтый овалы представляют структуры доменов) прилагается к поверхности с этикетки, Atto488 (синий) и Atto550 (зеленый) и репортер нуклеотидов, AMP-PNP * в растворе, помечены Atto647N (красный). Данные записываются на микроскопе TIRF Призма типа с чередующимися лазерного возбуждения (Алекс). (B) образцовый флуоресценции интенсивности (Fl. Int.) следы после возбуждения синий и зеленый. (C) пиктограммы различимых конформационные государств Hsp90 (S0, S1,2S, S3, S4) и их соответствующих идентификатор для функционального состояния (O, C, O *, C *) используются в этой работе. Флюорофор должности указаны в синий, зеленый и красный. Две популяции представляют же функциональное состояние, а именно: Откройте Hsp90 с AMP-PNP * (S2 и S-3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Критерии отбора. (A) A молекулы, отобранных для дальнейшего анализа. (B, C) Молекулы не выбран для дальнейшего анализа. (B) не плоского плато и Atto550 находится в состоянии темный около 30 сек после Зеленый возбуждения (обозначается стрелками). (C) несколько отбеливания шаги после Зеленый возбуждения (обозначается стрелками). FL. Int.: интенсивность флуоресценции, голубой: Atto488, зеленый: Atto550, красный Atto647N, ex: возбуждения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Расчет PF следы и представитель гистограммы. (A) представитель флуоресценции интенсивности (Fl. Int.) и соответствующие трассировки частично флуоресцирования (PF). (B) два 2D проекции 3D PF гистограммы для измерения в отсутствие дополнительных, неподписанном нуклеотидов. (C) же прогнозы для эксперимента в присутствии дополнительные 250 мкм AMP-PNP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Процесс отбора населения. (A) положение населения пяти различимы в двух проекциях 2D. (B) копия пиктограммы в рисунке 2 c. (C) представитель 3D точечная PF данных. Окраска точек данных предназначен только для визуализации. Используется один и тот же код цвета как B. (D) определение относительной населения осуществляется Рисование многоугольников свободной рукой вокруг пиков в 2D гистограммы. Используя сочетание двух прогнозов, изображенные на рисунке 3, можно выделить все пять популяций. (E) результаты 3D Гаусса, подходят для гистограммы PF данные, отображаемые в A. изображенные являются изоповерхности на Полувысоте, которые представляют пять различных популяций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Схема ансамбль оптимизации 3D HMM. Одна модель оптимизирована для всех молекул из набора данных. Начало значения даны по модели ввода (с предварительно определенное количество государств). Вероятность модели, учитывая данные (3D следы PF ) оценивается с использованием алгоритма вперед-назад (FB). Баум-Уэлч (BW) алгоритм дает оценку местных максимального правдоподобия (MLE) параметров. Глобальный MLE затем можно найти итеративно. Витерби алгоритм вычисляет скорее государства траектории, учитывая модель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Оценки значимого неопределенности с CI. (A) определение CI для одного образцовое константы. Коэффициент вероятности (LR) тест модели по сравнению с моделью оценщик (MLE) максимального правдоподобия рассчитывается в регионе вокруг MLE константа скорости. 95% доверия связаны достигается, когда LR превышает 3.841 (горизонтальная темно серая линия). (B) уровень извлечения константы без дополнительных нуклеотидов (красный) и с AMP-PNP (синий) и их 95% CI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8 : Средний останавливаться время репортер нуклеотидов, AMP-PNP * обязан Hsp90 продлена в присутствии дополнительных нуклеотидов. (A) пиктограмма наблюдаемых диссоциации помечены AMP-PNP * от Hsp90 димер, усреднение по всем конформации Hsp90. Доменной структуры Hsp90 изображен желтый овалов и конформационные гибкость указывается путем наложения открытые и закрытые димер. (B) в среднем живут время AMP-PNP * привязан к Hsp90, в отсутствие дополнительных нуклеотидов (красный) и в присутствии 250 мкм без маркировки AMP-PNP (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представляем экспериментальная процедура получения трехцветных smFRET данных для сложных белков системы и пошаговое описание анализа этих измерений. Этот подход предоставляет уникальную возможность непосредственно оценить взаимосвязь между несколькими взаимодействия сайтов или конформационные изменения.
Для того чтобы получить адекватные данные одной молекулы многоцветные на белки важно выполнять воспроизводимость измерений на низкий уровень шума. Это может быть достигнуто с помощью эффективной и надежной Поверхностная пассивация протокола для потока камеры9. Достаточной плотности молекул лишенных подвижности на поверхности должны использоваться для повышения урожайности молекул на записанный фильм. Это означает, что флюоресценция света из одной молекулы должны падать на около 5-10% пикселов записанных изображений. В то же время перегрузки следует избегать, поскольку это привело бы к дублированию соседних молекул. Когда помечены виды бесплатно в растворе (AMP-PNP * представлены исследования), убедитесь, что концентрация является достаточно низкой, чтобы не мешать измерения путем прямого возбуждения от лазеров с более короткие волны (т.е., обычно значительно ниже всех концентрация). Кроме того убедитесь, что концентрация этих соединений не меньше, чем назначению вследствие неспецифических привязки к интерфейсам. Кроме того мощность оптимальным возбуждением представляет собой компромисс между отношение сигнал шум и Фотообесцвечивание флуорофоров.
Без кислорода, очистки системы используется в протоколе представленных. Используются красители Атто-Tec не показывают значительные мигает на шкале времени эксперимента (70 мс освещение за цикл возбуждения) и не снижение ставки отбеливатель фото было отмечено мусорщик системой, состоящей из оксидаза глюкозы, каталазы и Trolox33 ,34. Кроме того отсутствие кислорода мусорщик избегает артефакты из-за неопределенного белковых взаимодействий, как системы кислородной очистки обычно содержат белковых компонентов до концентрации всех35.
Другим важным шагом является выбор трассировки. Размер области для суммирования интенсивность одного Флюорофор выбирается как малые, как возможно, но по-прежнему больше, чем точка распространения функция установки. Имейте в виду, что плоского плато в совместной интенсивности следы можно ожидать только если обнаружение каналы имеют аналогичные очевидным гамма факторы, так как следы не исправить на данном этапе анализа. Только молекулы, которые четко определенным критериям для следы интенсивности флуоресценции, включены в анализ (раздел 3). Молекулы с плохое отношение сигнал шум в PF следы исключены из дальнейшего анализа и не влияют на данные оценки как очистить выделение, которые используются критерии.
В зависимости от качества данных альтернативные подходы обеспечивают оптимальное состояние выделения. Бесплатный многомерного ансамбль HMM основаны либо на следы интенсивности флуоресценции27 или следы PF может применяться выделить основные государства путем оптимизации соответствующих выбросов вероятностей (например, Гаусса PDF-файлы) в то же время оптимизации кинетической модели. Оба подхода имеют свои преимущества и недостатки. PF следы могут содержать неблагоприятных шипы, в то время как уровни интенсивности флуоресценции варьируются от молекулы в молекуле. Представленные протокол решает эту проблему путем предотвращения искусственных переходы при возникновении пиков и оценки вероятности выбросов от 3D Гаусса подходят для PF гистограммы и только оптимизации вероятности перехода в последующем ансамбль HMM запуска.
Представленный подход ограничен потребность помечены взаимодействия партнера, который связывает с сравнительно высокое сродство для того, чтобы быть совместимым с низкой концентрации, необходимые для обычного измерения одной молекулы. Это могут быть преодолены путем стратегии увеличения местных концентрации (привязывая взаимодействия партнеров36, Инкапсуляция в везикулы37,38) или методы для уменьшения возбужденных громкости (например, ноль режим волноводы39). Кроме того маркировка позиции должны быть выбрано с большой осторожностью и управления эксперименты необходимо исключить серьезные побочные эффекты флуорофоров. В случае Hsp90 обычно это проверяется assay АТФазы, который доказывает ферментативную активность40. Если таковые имеются, должны рассматриваться структурную информацию из хрусталя или NMR структуры. Предпочтительные позиции в открытые поверхности петли, от интерфейсов взаимодействия и не похоронены в кармане поверхности белка. Это обеспечивает большой объем доступных для красителя.
Рамках подходит для многоцветной smFRET эксперимент с произвольным количеством цветов. Мы ориентируемся на трехцветной измерения здесь, как они уже предоставляют функцию, которая делает их отличается от других экспериментов сингл молекулы, а именно возможность непосредственно наблюдать корреляции между двумя процессами (например, связывание взаимодействия партнера и конформационные изменения). Эта информация является недоступным в эксперименте стандартное двухцветного smFRET но фундаментальный интерес для понимания функции любой молекулярные машины.
Представленные эксперимента и анализ способен характеризующие белка систем, которые могут отображать динамику на широкий спектр шкалы времени между государствами, которые сами являются весьма гибкими3. Это контрастирует ранее опубликованные многоцветные smFRET экспериментов, которые сосредоточены на ДНК или РНК модели систем, таких как Холлидей развязок4, переходы между (главным образом два) четко определенных государств-участниц. В системах белка отношение сигнал шум ниже и извлечения полный набор вероятностей перехода трудно из-за ограниченной временной пропускной способности в smFRET экспериментов из-за Фотообесцвечивание. Здесь мы показываем, что - если применяется тщательно и с разумными ограничениями - препятствия в белковых систем измерения могут быть преодолены с многоцветной smFRET с помощью многомерного государственного распределения и ансамбль скрытые марковские анализа9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа финансируется немецкого фонда научных исследований (INST 39/969-1) и Европейский исследовательский совет через соглашение грантов ЕИС n. 681891.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setup | |||
| vibration-damped optical table | Newport, Irvine, CA, USA | RS2000 | |
| OBIS 473nm LX 75mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1185052 | |
| OBIS 532nm LS 50mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1261779 | |
| OBIS 594nm LS 60mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1233470 | |
| OBIS 637nm LX 140mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1196625 | |
| laser control unit | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1234465 | Scientific Remote |
| aspheric telescope lenses | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | d=25.4mm, f=50mm and f=100mm | |
| CF ex1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 473/10 | cleanup filter excitation |
| CF ex2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 532/10 | cleanup filter excitation |
| CF ex3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 594/10 | cleanup filter excitation |
| CF ex4 | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | FL635-10 | cleanup filter excitation |
| DM ex1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZQ594RDC | dichroic mirror excitation |
| DM ex2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 570DCXR | dichroic mirror excitation |
| DM ex3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZQ491RDC | dichroic mirror excitation |
| AOTFnC-Vis | AA Opto-Electronic, Orsay, France | ||
| λ/4 plate | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | AQWP05M-600 | |
| CFI Apo TIRF 100x | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | high-NA objective | |
| piezo focus positioner MIPOS 250 CAP | piezosystem jena GmbH, Jena, Germany | Piezo Controller NV 40/1 CLE | |
| piezo stepper | Newport, Irvine, CA, USA | PZA12 | PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit |
| achromatic aspheric lenses | Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, Germany | G322-304-000 | d=50mm, f=200mm |
| adjustable optical slit | Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany | 27.160.1212 | max. aperture 12 x 12 mm |
| DM det1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | T 600 LPXR | dichroic mirror detection |
| DM det2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | H 560 LPXR superflat | dichroic mirror detection |
| DM det3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | HC BS R635 | dichroic mirror detection |
| BP det1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 525/40 BrightLine HC | bandpass filter detection |
| BP det2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 586/20 BrightLine HC | bandpass filter detection |
| BP det3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 631/36 BrightLine HC | bandpass filter detection |
| BP det4 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 700/75 ET Bandpass | bandpass filter detection |
| optical shutters detection | Vincent Associates, Rochester, NY, USA | Uniblitz VS25S2T0 | |
| EMCCD iXon Ultra 897 | Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland | ||
| digital I/O card, PCIe-6535 | National Instruments, Austin, Texas, USA | ||
| syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | PHD22/2000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow chamber | |||
| quartz slides | G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA | Spectrosil2000, h=3mm | |
| TEGADERM film | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | 1626W | 10 x 12cm |
| spray adhesive | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | Photo Mount 050777 | |
| glycerol | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | Immersol G | |
| immersion oil | OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, Germany | IMMOIL-F30CC | |
| prism | Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany | Suprasil1 | |
| aluminium prism holder | custom built | ||
| hollow setscrews | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | with custom drilling | |
| Tygon S3 E-3603 tubing | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | 2-4450 | ACF00001 |
| PTFE tubing | Bohlender GmbH, Grünsfeld, Germany | S1810-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sample | |||
| yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin | UniProt ID P02829 | ||
| Maleimide derivatives of Atto488, Atto550 | ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany | ||
| AMP-PNP* | Jena Bioscience, Jena, Germany | γ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N | |
| Fluospheres | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | F8764 | amine-modified, 0.2 μm, yellow-green fluorescent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Andor Solis | Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland | version 4.30 | |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, Texas, USA | version 2012, 32bit; misc. hardware control | |
| MDS control software | AA Opto-Electronic, Orsay, France | version 2.03a | |
| Coherent Connection | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | version 3 | |
| Igor Pro | WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA | version 6.37 |
References
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
- Hohng, S., Joo, C., Ha, T. Single-Molecule Three-Color FRET. Biophys J. 87 (2), 1328-1337 (2004).
- Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy. ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).
- Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S. Single-molecule four-color FRET. Angew Chem Int Ed. 49 (51), 9922-9925 (2010).
- Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. Heat shock protein 90's mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).
- Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery. Nat Commun. 5, 4192 (2014).
- Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously. Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).
- Yengo, C. M., Berger, C. L. Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment. Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).
- Wortmann,P ,, Götz M,, Hugel T , Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1. Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).
- Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J Vis Exp. (120), e54782 (2017).
- Stephanopoulos, N., Francis, M. B. Choosing an effective protein bioconjugation strategy. Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).
- Sánchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Lee, N. K., et al. Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances. Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).
- Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).
- Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
- Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. 14, 174-180 (2017).
- Rabiner, L. R. A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition. Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).
- Fink, G. A. Markov Models for Pattern Recognition. , Springer London. London. (2014).
- Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models. Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).
- Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. Confidence intervals for hidden Markov model parameters. Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).
- McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling. Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).
- Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data. Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).
- Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data. PLoS ONE. 7 (2), e30024 (2012).
- Schmid, S., Götz, M., Hugel, T. Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium. Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).
- Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).
- Wayne, N., Bolon, D. N. Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers. J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).
- Ali, M. M. U., et al. Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex. Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).
- Southworth, D. R., Agard, D. A. Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle. Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).
- Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Ylänne, J., Rief, M. Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).
- Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic. Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
- Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).
