Summary
Her presenterer vi en protokoll for å få tre farger smFRET data og analyse med en 3D ensemble Hidden Markov Model. Med denne tilnærmingen, kan forskere trekke kinetic informasjon fra komplekse protein-systemer, inkludert cooperativity eller korrelert interaksjoner.
Abstract
Single-molekylet han selvmord resonans energi-overføring (smFRET) har blitt en utbredt Biofysiske teknikk for å studere dynamikken i biomolecules. For mange molekylær maskiner i en celle proteiner må handle sammen med interaksjon partnere i en funksjonell syklus å oppfylle sin oppgave. Utvidelsen av to-farge til flere smFRET gjør det mulig å samtidig undersøke flere interaksjon eller conformational endres. Dette er ikke bare legger en ny dimensjon til smFRET eksperimenter, men det tilbyr en enestående mulighet til å studere direkte hendelsesforløpet og oppdage korrelert interaksjoner ved en immobilisert prøve og en total intern refleksjon fluorescens mikroskopet (TIRFM). Derfor er multi-farge smFRET et allsidig verktøy for å studere biomolecular komplekser i en kvantitativ måte og i en tidligere uoppnåelig detalj.
Her viser vi hvordan å overvinne de spesielle utfordringene multi-farge smFRET eksperimenter på proteiner. Vi presenterer detaljert protokoller for å skaffe data og trekke ut kinetic. Dette inkluderer spor utvalgskriterier, staten separasjon og utvinning av staten baner fra støyende dataene med en 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Sammenlignet med andre metoder, kinetisk informasjonen ikke er gjenopprettet fra bor tid histogrammer men direkte fra HMM. Maksimal sannsynlighet rammeverket tillater oss å kritisk vurdere kinetic modellen og gi meningsfull usikkerhet for priser.
Ved å bruke vår metode varme sjokk protein 90 (Hsp90), kan vi greie nukleotid bindingen og globale conformational endringer av protein. Dette tillater oss å direkte observere cooperativity mellom to nukleotid bindende lommene på Hsp90-dimer.
Introduction
Mange proteiner oppfylle sin funksjon dynamisk komplekser med andre molekyler, formidlet av conformational endringer og forbigående foreninger med et bredt spekter av tidsskalaer1,2,3. Koblet til en ekstern energikilde (f.eks ATP) disse dynamiske interaksjoner kan føre til retningen i en funksjonell syklus og til slutt opprettholde ikke-likevekt stabil i en celle, en forutsetning for livet.
For å forstå disse molekylær maskiner, er en statisk beskrivelse av strukturelle studier ikke tilstrekkelig. I tillegg er det viktig å ha kjennskap til den underliggende kinetic modellen og å finne kinetic rate konstanter. Mange eksisterende metoder tillate forskere å studere dynamikken i binær interaksjoner mellom to molekyler av interesse, f.eks overflaten plasmon resonans, avslapning metoder med en spektroskopiske avlesning (f.eks hoppe eller stoppet flyt teknikker), og kjernefysiske magnetisk resonans. Men er deres anvendbarhet oftest begrenset til enkle to-stats systemer (f.eks en bundet og en ubundet tilstand) på grunn av den snitt iboende til bulk eksperimenter. I tilfeller der flere stater eller mellomprodukter er involvert, gir de bare en kompleks blanding av hastighet konstanter. Single-molekylet metoder som optisk eller magnetiske pinsett eller to farger smFRET, dvs. en giver og ett acceptor fluorophore, med en overflate-immobilisert prøve kan gjenopprette rate konstanter for alle observerte conformational endringer. Men når det kommer til interaksjoner påvirker flere binding området, disse metodene er fortsatt begrenset og informasjon om mulig sammenheng av to (eller flere) interaksjoner bare være tilgjengelige via indirekte konklusjoner fra et sett av eksperimenter.
Multi-farge smFRET4,5,6,7,8,9 tilbyr muligheten til å studere samspillet mellom disse komponentene direkte på sanntid og under nær-fysiologiske forhold10. Dette tillater en å undersøke for eksempel konformasjon-avhengige binding av en ligand eller en annen protein8,9,11. Den generelle tilnærmingen presenteres her er å merke protein(s) rundt på bestemte stillinger, knytte en protein på overflaten av måling kammeret og spore fluorescens intensiteten over tid på et prisme-type TIRFM (for detaljer se 9 , 12). romlige nærhet til ulike fargestoffer kan deretter bestemmes fra energi-overføring mellom dem. Merking strategier kan variere fra protein protein (omtalt i 13) og retningslinjer for å unngå gjenstander i smFRET målinger finnes14.
Siden en donor fargestoff kan overføre energi til forskjellige acceptor fargestoffer i et multi-farge smFRET eksperiment, er den relative plasseringen av alle fargestoffer ikke tilgjengelig fra magnetisering av ett fargestoff alene15,16. Men i kombinasjon med vekslende laser eksitasjon (ALEX17og vurdert i 18) denne metoden gir alle spatio-temporale informasjon på sub-sekunders og sub nanometer oppløsning.
Rektor, høy oppløsning strukturinformasjon kan oppnås ved hjelp av Inter fargestoff avstander beregnet ut fra kombinasjonen av alle fluorescens bakgrunnsintensitetene i en multi-farge smFRET eksperimentere med ALEX. Men fokusere her vi på staten identifikasjon og separasjon samt utvinning av kinetic modeller, der multi-farge smFRET er uunnværlig. Når "bare" proteinstrukturer ved triangulering er ønsket, kan et sett med enklere to farger smFRET eksperimenter med høy signal-til-støy-forhold være utført12,19.
Vi bruker den delvis fluorescensen (
) som en proxy for energi-overføring mellom to fluorophores7. PF beregnes fra fluorescens intensiteten tilsvarende bånd effektiviteten av en tofarget eksperiment:
Der 
er intensiteten i utslipp kanal em etter eksitasjon med farge ex, og c er acceptor med den lengste bølgelengden. Oppdagelsen kanalene representerer samme posisjon i prøven kammer, men posten forskjellige spectral områder fluorescens lyset. Den samme IDen for eksitasjon og utslipp brukes i denne protokollen (dvs. "blue" "grønn" og "rød").
På grunn av eksperimentelle mangler av målt fluorescens intensiteten ikke bare på energi-overføring, men også på fluorophore og oppsett. For å få den sanne energieffektiviteten for overføring mellom to fluorophores, må de målte intensiteter korrigeres. Følgende er basert på referanse9. Korreksjonsfaktorer for tilsynelatende lekkasje (Luk, dvs., gjenkjenning av fotoner fra en fluorophore i en kanal dedikert til et annet fargestoff) og tilsynelatende gamma (ag, dvs. fluorescens quantum avkastningen av fargestoff og effektiviteten deteksjon av kanalen) hentes fra single-molekylet spor som viser en godkjenner bleking hendelsen.
Lekkasje av donor fargestoff i hver mulig acceptor kanalen beregnes fra alle datapunktene i innspilte fluorescens spor hvor acceptor fargestoff bleket men giveren er fortsatt fluorescerende (
):
Medianen for lekkasje histogrammet brukes som tilsynelatende lekkasje faktoren. Etter korrigering for lekkasje bestemmes tilsynelatende gamma faktoren fra samme sett med spor. Det beregnes ved endring av fluorescens i acceptor kanalen ved endring av fluorescens i donor kanalen ved bleking acceptor fargestoff:
Hvor c igjen er oppdagelsen kanalen for acceptor med den lengste bølgelengden. Medianen til den endelige fordelingen brukes som tilsynelatende korrigeringsfaktoren.
Korrigert intensiteten i hver enkelt kanal oppnås ved:
PF beregnes slik:
Ulike befolkningsgrupper kan skilles i multi-dimensjonale rommet spredt av PF-s. Posisjonen og bredden av hver stat bestemmes ved å tilpasse dataene med multi-dimensjonale Gaussian funksjoner. Etterfølgende optimalisering av en global HMM basert på alle PF spor gir en kvantitativ beskrivelse av den observerte kinetics. Selv små endringer av prisene er synlig.
HMMs er en måte inferring staten modell fra en samling med støyende tid spor. Systemet anses å være i ett av et sett med diskret, skjulte stater til enhver tid og faktiske observasjon (dvs. utslipp) er en sannsynlig funksjon av dette skjult tilstand20. Ved TIRFM smFRET data, kan de utslipp sannsynligheter bjeg per stat jeg modelleres ved kontinuerlig Gaussian sannsynlig tetthet funksjoner. På jevnlig spredte diskret tidspunkt, kan overganger fra én til en annen stat oppstå etter overgangen sannsynlighet som hensyn til tid og bare avhengig av gjeldende status. Overgangen matrix A inneholder disse overgang sannsynligheter enij mellom alle skjulte. Starttilstand distribusjon 
gir state-spesifikke sannsynlighetene 
for første gang punktet av en tid sporing. Med en maksimal sannsynlighet tilnærming, kan disse parametrene optimaliseres best beskriver dataene med forover-bakover og Baum-Welch algoritmer20,21. Dette gir maksimal sannsynlighet grunnlaget har (MLE). Endelig kan tilstand sekvensen som mest sannsynlig produsert banen observasjoner konkluderes med Viterbi algoritmen. I motsetning til andre HMM analyser av smFRET data24,25,26 bruker vi ikke HMM som en ren "utjevning" av dataene men utdrag kinetic staten modellen fra datasettet uten behov for å feste holdetiden histogrammer27. HMM analyse er gjort med interne skript ved hjelp av Igor Pro. Implementeringen av koden er basert på referanse21. Vi tilbyr en programvare kit og eksemplarisk data på vår for å kunne følge deler 5 og 6 i denne protokollen (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Full programvare er tilgjengelig på forespørsel.
Tid poeng i dataene med PF < -1 eller PF > 2 i noen oppdagelsen kanalen tilordnes minimale utslipp sannsynligheten for alle stater (10-200). Dette hindrer kunstig overganger på datapunktene.
Parameterne for utslipp sannsynlighetene er Hentet fra passformen til 3D PF histogrammet Gaussian funksjoner som beskrevet i trinn 5.7. Disse parametrene holdes fast i optimalisering av HMM.
I presentert tilnærming brukes starttilstand distribusjon vektoren og overgangen matrisen globalt å beskrive hele ensemblet i spor. De oppdateres basert på alle N molekyler fra datasettet ifølge referanse27.
Startparametere for starttilstand distribusjon bestemmes fra 2D projeksjoner av PF histogrammet (trinn 5.3) og overgang sannsynlighetene er satt til 0,05 med unntak av sannsynlighetene opphold i denne stat, som er valgt slik at sannsynligheten for å forlate en viss tilstand er normalisert Unity.
Sannsynligheten profilering metode brukes til å gi tillit intervaller (CIs) for alle overgang priser21,22, som fungerer som meningsfull estimater for deres usikkerhet. Vil beregne grensene for CI for en bestemt hastighet, er overgang sannsynligheten av interesse festet til en annen verdi enn MLE. Dette gir test modell λ'. En sannsynlighet forholdet (LR) test sannsynlighet 
gitt datasettet 0 er utført i henhold til:
95% tillit bundet for parameteren er nådd når LR overskrider 3.841, 95% quantile av en x2-distribusjon med en grad av frihet22,23.
Kraften i metoden er demonstrert ved hjelp av Hsp90. Dette rikelig protein i bakterier og eukaryoter og er del av mobilnettet stress respons28. Det er en lovende stoffet mål i kreft behandling29. Hsp90 er en homodimer med en nukleotid binding lomme i N-terminal domene hver delenhet30. Det kan gjennomgå overganger mellom minst to globalt distinkte konformasjonen, en lukket og en N-terminal åpen, V-formet konformasjon19,31,32. Dimeric natur reiser direkte spørsmål om samspillet mellom de to nukleotid bindende områdene i Hsp90.
Nedenfor gir vi en trinnvis protokoll for datainnsamling og analyse av et tre farger smFRET forsøk på gjær Hsp90 og nukleotid. Konformasjon-avhengige binding av fluorescently merket AMP-PNP (AMP-PNP *, en ikke-hydrolyzable analog ATP) er analysert. Programmet beskrevet prosedyren tillater studie av nukleotid bindingen og samtidig conformational forandringene av Hsp90 og avslører dermed cooperativity mellom to nukleotid bindende lommene på Hsp90.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. installasjon og forutsetninger
- Utføre multi-farge smFRET målinger på et prisme-type TIRFM. En beskrivelse av en tofarget oppsett som JoVE publikasjoner er gitt i referere til12.
- Konstruere en multi-farge TIRFM. En generell layout er beskrevet i 9.
- Bruk valgbar, diode pumpet solid state kontinuerlige bølgen lasere, som gjør bruk av mekaniske skodder i eksitasjon baner unødvendig.
- Ansette en asymmetrisk, langstrakt prisme som forhindrer tilbake refleksjon av eksitasjon bjelken på baksiden inn målet.
- Bruke 2-tommers akromatisk asfærisk smeltet silica linser i gjenkjenning baner som samler mye lys som mulig og forhindre auto-fluorescens og avvik, f.eks skjevheter i midtstilt områder av bildet.
- Fokusere banene gjenkjenning på brikken av EMCCD med en egen linse. Dette gir optimal fokus for hver oppdagelsen kanalen.
Forsiktig: Klasse 3B lasere brukes i TIRFM. Dette betyr at de er farlige hvis øyet er eksponert direkte, men diffus refleksjoner er ikke skadelig. Sikre samsvar med laser sikkerhetstiltak i henhold til lokale reguleringer før systemet er operert.
- Fastslå hvilke korreksjonsfaktorer for oppsett og fluorophore på forhånd med dsDNA prøver.
- Bruk en høy-bånd dsDNA utvalg for hver farge i kombinasjon med acceptor har den lengste eksitasjon bølgelengden (for presentert oppsett: Atto488-Atto647N, Atto550-Atto647N, Atto594-Atto647N). Kontroller at DNA endres i tillegg med en biotin.
- Fortynne prøven til 5 nM med TNM buffer (5 mM Tris pH 7.5, 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2) og 2 mM Trolox (Bruk denne bufferen også for måling).
- Nakkens dsDNA som Hsp90 i trinn 2.5 og 2.7.
- Beregne korreksjonsfaktorer for tilsynelatende lekkasje (Luk) og tilsynelatende gamma (ag) fra single-molekylet spor som viser acceptor bleking hendelse.
- Konstruere en flyt kammer som er en sandwich av en PEG/biotin-pinne paddivert kvarts lysbilde, en tynn film som lim på begge sider, og en cover slip. For detaljer protokoller for rengjøring av kvarts se lysbilder og passivation referanse9.
- Bruk tykk (3 mm) kvarts glir til geometrisk forhindre innsamling av laserlys spredt på kvarts-glyserol-kvarts grensesnittet mellom prisme og functionalized kvarts lysbildet.
- Bruk en tynn (40 µm) tetting film som sprayet med lim på siden ikke selvklebende. Tynnfilm reduserer avstanden mellom overflaten tilknyttet molekyler og mål. Varme til 80 ° C, og trykk på.
- Plass en cover slip på toppen. Varme til 80 ° C, og trykk på. Bruk en dråpe glyserol når du plasserer flow chamber over prisme.
Merk: Materialer prisme og kvarts lysbilder samt glyserol er indeks-matchet.
- Ekspress Hsp90 fra Saccharomyces cerevisiae i form av to enkelt cystein punkt mutanter posisjoner D61 eller Q385. Legg til en C-terminalen kveilet-coil motiv for å hindre dimer dissosiasjon i picomolar konsentrasjoner. Merk mutant proteiner separat og utveksle monomerer for å få heterodimerer merket med Atto488 på aminosyre posisjon 61 og Atto550 aminosyre posisjon 3859.
2. måling
- Start kamera programvare og angi parametere for bildebehandling som angitt nedenfor:
- Still inn temperaturen for sensoren kjøling så lavt som mulig (-95 ° C med eksterne vannkjøling) for å redusere mørke gjeldende støy.
- Bruke kamerainnstillinger som er optimalisert for single-molekylet opptaket: 3,3 µs vertikal forflytn hastighet, normale vertikale klokke spenning, 17 MHz 16-biters vannrett lese ut, før forsterkning gevinst 3, få av elektron multiplikator 1000.
- Angi følge av oppkjøpet til "Eksterne" og eksponeringstid 70 ms. post filmer med en lengde på 750 oppkjøpet sykluser.
Merk: Slå av lysforholdene når kameraet er å skaffe for å hindre metning av EMCCD sensoren.
- Opprett en mappe på den lokale SSD for målingen. I programmet innstillingene gå til < Autolagring > rytteren, aktivere < Autolagring > og velge filformat "Tiff" for filmen oppkjøpet. Velg mappen på SSD som Autolagring plassering.
- Start programvaren som styrer acousto-optiske tunable filter (AOTF), programvaren som styrer driften av lasere og utløse programvare som synkroniserer lasere, AOTF, vindusskodder i gjenkjenning banen og kameraer. Juster laser makt med AOTF (ca. 3 mW før prisme) og laste riktig utløsende mønsteret.
- Montere eksempel holderen med prisme og flow chamber, legge rør, plassere innløp slangen i microcentrifuge kopp og koble slangen uttaket til en sprøytepumpe. Tømme kammeret med ca 150 µL buffer, justere magnetisering strålen, og fokus. Bleke noen fluorescerende forurensninger på overflaten ved sakte beveger seg langs området fullstendig gjenkjenning av lysbildet med en laser ca 10 mW for alle lasere. Dette tar ca 1 time.
Merk: Hvis ikke angitt, brukes bufferen inneholder 40 mM HEPES pH 7.5 150 mM KCl, og 10 mM MgCl2. - Rødme ca 300 µL av en NeutrAvidin løsning (0,25 mg/mL buffer) inn i kammeret og ruge for 1 min. skylle ut ubundet NeutrAvidin med buffer og flush ca 300 µL av en BSA løsning (0,5 mg/mL buffer) gjennom kammeret.
Merk: Denne blokken gjenværende overflate functionalization mangler av uspesifikke adsorpsjon av BSA til overflaten. - Nakkens prøven ved å legge til flyt kammeret ca 150 µL av biotinylated og merket Hsp90 på økende konsentrasjoner (utvannet i buffer + 0,5 mg/mL BSA) til en overflate tettheten er nådd, som er vanligvis tilfelle i en konsentrasjon av 5-10 pM. Bleke ubundet protein med ca 300 µL buffer + 0,5 mg/mL BSA.
- Skylles i 150 µL 25 nM AMP-PNP * i buffer + 0,5 mg/mL BSA. La det ruge i 5 minutter og gjenta fremgangsmåten en gang for å sikre riktig nukleotid konsentrasjon.
Merk: For eksperimenter i nærvær av ekstra, umerkede AMP-PNP, også legge til 250 µM AMP-PNP. - Begynne med datainnsamling. Erverve ca 20 filmer som tar ca 1,5 t for en passende mengde data.
- Flytte prøven kammeret vinkelrett eksitasjon strålen med en piezo stepper endre synsfeltet.
- Justere fokus med z-piezo som styrer høyden på målet om nødvendig. Dette bør ikke være nødvendig for ofte når måling kammeret er montert uten helling.
- Forberede innspillingen av kameraer ved å trykke < ta Signal > kameraprogramvaren og starte eksitasjon/Kjøp sykluser ved hjelp av < Start > utløser programvaren. Dette starter oppkjøpet av fluorescens intensiteten.
- Første spille inn en film med fluorescerende perler som viser fluorescens utslipp i spektral rekkevidden av alle oppdagelsen kanalene for å utføre en kanal-registrering. Deretter oppdage perle posisjoner i kalibrering filmen ved å søke etter den smarteste flekker og bestemme den sentrale posisjonen fra en Gaussian passer intensiteten profilen. Lagre koordinatene til perler som finnes i alle kanaler og passer både kartlegging forskyvningen i x - og y-retning med en 2D polynom grad tre9.
3. utvalg av Single-molekylet spor
- Dataanalyse er gjort med interne skript ved hjelp av Igor Pro. Last alle nødvendige skript ved å åpne "iniTIRF.ipf" og velg riktig av eksperimentet.
Merk: I følgende < knapp > angir klikkbare elementer på menyen eller brukergrensesnittet. Funksjonskall angis i anførselstegn, f.eks "Print"Hello World"". Disse kommandoene kan limes til kommandolinjen Igor Pro (uten avsluttende anførselstegn). - Kontroller at parameterne for oppdagelsen kanalen registreringen er lagt.
- Starte GUI ved å klikke < smFRET nye | Analyse GUI >.
- Legg filmene (dvs. en rekke rammer med 512 x 512 bildepunkter lagret som 16 bit TIFF stabler) som holder intensiteten i respektive kanaler. Gjør dette ved å trykke knappen < Last Film > og velge filene fra det såkalte "master" og "slave" kamera en etter en.
- Identifisere plasseringen av potensielle enkelt molekyler av forskende for lyse flekker i summen av de fem første rammene i en bestemt oppdagelsen kanalen. Beregne de tilsvarende stillingene i alle andre oppdagelsen kanaler fra kanal-tilordningen. For å få fluorescens intensitet spor, summere intensiteten av en pixel firkant rundt den sentrale posisjonen for hvert bilde. Gjør dette ved å trykke på knappen < finne spor > i GUI.
Merk: Siden lengden på torget (i piksler) er gitt av: 2 * < Sum Pxs > + 1. - Hvert molekyl, beregne felles rå intensiteten spor som summen av alle spor av dette stedet med samme excitation farge. Evaluere intensitet profilen molekylet i alle kanalene etter følgende kriterier:
- Et omtrent flate platå i felles rå intensiteten og en enkelt bleking skritt for alle eksitasjon farger, anticorrelated atferd i de aktuelle oppdagelse kanalene, oppdagelsen av røde fluorescens (som angir bånd til en bundet AMP-PNP *) minst en gang i den spor, og ingen flere trinn i den røde fluorescensen, som indikerer tilstedeværelse av to AMP-PNP * bundet til en Hsp90 dimer.
- Lagre fluorescens spor av stedet for videre analyse hvis disse kriteriene er oppfylt. Gjør dette ved å velge spor med markøren og deretter trykke < lagre >-knappen i "tidslinjer" diagrammet. Undersøke intensitet spor i alle tre oppdagelsen kanaler manuelt etter blå eksitasjon for ca 200 molekyler per film.
4. beregning av delvis fluorescens spor
- Vise alle fluorescens intensitet spor for en av lagret molekyler. Bruk pekere i diagrammet til å velge tidsperioder.
- Velg et tidsintervall der alle fluorophores er bleket allerede. Mener bakgrunnen intensiteten beregnes fra dette området og trekkes fra intensitet spor i hver kanal. Gjør dette ved å trykke knappen < bakgrunn >.
- Velg bånd effektivitet, der minst både fargestoffer knyttet til Hsp90 (Atto488 og Atto550). Sørg for å utelate spor som inneholder en blinkende hendelse (se figur 3B). Disse hendelsene er preget av en drop-in fluorescens intensitet i én kanal uten medfølgende annen måte.
- Beregne PF spor. Gjør dette ved å trykke knappen < PF beregning >. Forhåndsdefinerte korreksjonsfaktorer for tilsynelatende lekkasje (Luk) og tilsynelatende gamma (ag) brukes på den rå intensiteten for å korrigere for foto-fysisk og konfigurere egenskaper.
5. befolkningen utvalg og 3D histogrammet montering
- Fjerne molekyler som viser en lav signal-til-støy-forhold i PF spor. Molekyler som overskrider intervallet [-1; 2] i PF spor for mer enn 10% av rammene fjernes fra datasettet. Gjør dette ved å kjøre "RemoveTracesLowSNR()" fra vinduet.
- Beregne binned 2D anslag av PF dataene. Plot
over 
og 
over i området [-0.5; 1.5] med en oppløsning på 100 x 100 hyller. For å gjøre så, Kjør:- "HistFret2D ("r_b","r_g", binHist = 100)"
- "HistFret2D ("r_b","g_b", binHist = 100); MoveWindow 553,5, 42,5, 1055.25, 508.25"
- Bestem den relative befolkningen i hver skjelnes stat i 2D anslagene.
- Bringe aktuelle grafen til fronten og kjøre "panelHist2DCount()".
- Trykk knappen < Init > og tegne en ledig hånd polygon rundt toppen.
- Klikk < antall >. Antall datapunkt i polygonet og antall datapunkt i projeksjon skrives i kommandovinduet.
- Forberede en 3D histogrammet PF data ved å utføre "HistFret3D ("g_b","r_b","r_g")".
- Normalisere 3D histogrammet til en integrert 1. Kjør følgende:
- "NewDataFolder/S fit0"
- «Kopi/O:: bånd: Hist3D, Hist3D»
- "Variable /G div = sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0)) ^ 3"
- "Hist3D / = div; Print div"
- Gi første parametere for 3D Gaussian passer og forberede nødvendig datastrukturer.
- Kjør "Gauss3D_initParam(); Rediger W_coef_old."
- Legge til staten befolkningen i slutten av parameteren vektoren.
- Kjør "Gauss3D_prepareFit()."
Merk: W_coef_old er en vektor som inneholder innledende parameterne for passer. Per stat dette betyr
og staten befolkningen, som er slått sammen på slutten av vektoren. Kontroller at covariance matrise er symmetrisk.
- Passe summen S 3D Gaussian funksjoner 3D PF histogrammet, S blir antall skjelnes stater.
- Kjør "do3D()." Dette kan ta en time eller mer på en normal kontor PC, avhengig av de opprinnelige parameterne.
- Kjør "postprocessFitMultiGauss3D(); evalFitMultiGauss3D(); Rediger W_coef."
- Tilpass resultatet vises. For hver av de to 2D anslagene, bruker du følgende kommandoer:
- "contourPF3D_new(0); contourPF3D_new(1); contourPF3D_new(2); contourPF3D_new(3); contourPF3D_new(4)"
- "contourPF3D_colorize()"
over 
og 
over 
og staten befolkningen, som er slått sammen på slutten av vektoren. Kontroller at covariance matrise er symmetrisk.6. kinetisk analyse med 3D Ensemble HMM
- Forberede et ensemble HMM kjøre for å trekke kinetic informasjonen. En HMM er optimalisert fra alle molekyler i datasettet. Bruk informasjonen i forrige trinn til å definere posisjonen og bredden av hver stat i 3D PF plass.
- Initialisere HMM brukergrensesnittet (< HMM | Init HMM >) og velger riktig antall stater (ved Hsp90 dataene betyr < NumStates > = 5), antall dimensjoner av inngangssignalet (< NumDims > = 3), og typen inndata (< Input Type > = "Bånd 3D bgr").
- Optimalisere parametrene av HMM ved å la programvaren konvergere sannsynligheten for HMM (utføre "prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1),-14)") til endringen i overgangen matrix sammenlignet med den forrige gjentakelsen faller under grensen (10-14 for summen av absolutt endringen for hver overgang sannsynlighet). Dette gir MLE for overgangen sannsynlighetene i omtrent en time på en normal kontor PC.
- Gjenta befolkningen utvalget, Gaussian montering og HMM optimalisering for delsett med data (f.eks 75% av det fullstendige datasettet). Hvis det fullstendige datasettet ble slått sammen fra ulike eksperimenter, gjenta optimalisering også for hvert enkelt eksperiment. Analyse av delsett tillater for å anslå usikkerhet manuell befolkningen utvalg og variasjon innen datasettet.
- Beregne CI for overgangen sannsynlighetene, som rapporterer datasett heterogenitet og presisjonen for HMM.
- Få et grovt overslag over CI grensene av "cd $(roten: path3Dimport +"HMM"); loop_getCI_estimate_limits()."
- Beregne de nøyaktige grensene for CI ved å kjøre:
- "loop_getCI_HMM_converge(1)"
- "CIresults_conv_new()"
- "cd:: HMM_CIresult; reportCI_conv()"
- "cd:: cmp_CI_conv; CI_plot2 ("HMM", doAppend = 0) "
- Kondensere tilgjengelig kinetic informasjon for å forenkle tolkningen.
- Samle informasjon om tiden en merket nukleotid forblir bundet til Hsp90. Gjør dette ved å skjule statene som er bundet til AMP-PNP * (dvs. S1, S2 og S3, se også figur 2) og kompilere bor tid histogrammet. Kjør "cd $(roten: path3Dimport +"HMM"); collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0}) ", som kombinerer bor i statene S0 og S4 samt S1, S2og S3.
- Ekstra bor ganger fra Viterbi banen for hver stat av interesse og sammenligne resulterende bor tid histogrammet for ulike eksperimentelle forhold. Kjør "plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1)."
- For et mer detaljert bilde, skjule stater som har forskjellige PF men er funksjonsmessig identisk å lette videre dataanalyse, f.eksved en tre farger eksperimentere med merket Hsp90 og nukleotid, USA S2 og S 3 kan skjules. Kjør "collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4})."
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multi-farge smFRET målinger kan direkte deteksjon av sammenheng mellom to eller flere forskjellige samhandling områder. Dette gjør teknikken unike undersøke multi-komponent systemer, for eksempel protein komplekser. Vi fokuserer på presentasjonen av et tre farger smFRET eksperiment her, som fungerer som et illustrerende eksempel.
Den generelle arbeidsflyten av metoden er vist i figur 1. Den første delen består av innspillingen av multi-farge smFRET data på et prisme-type TIRF mikroskop. Overflaten vedlegg strategien og skjematisk av oppsettet er avbildet i figur 2A. En mer detaljert beskrivelse av installasjonen, se referanse til9. Den andre delen av presentert metoden fokuserer på dataanalyse. Eksemplarisk fluorescens intensitet spor vises i figur 2B. Passende tidspunktet spor Vis: (i) en klar bleking skritt for begge fluorophores knyttet til Hsp90, (ii) flate intensitet platåer, (iii) anti-korrelert atferd i korresponderende kanaler og (iv) minst en bindende tilfelle AMP-PNP * (Figur 3). Mer enn 400 molekyler som oppfyller utvalgskriteriene ble valgt å gi pålitelig statistikk. I studerte systemet, kan fem stater være preget av fluorescens intensiteten, med fire stater blir funksjonelt forskjellige (figur 2C).
Fra fluorescens intensiteten beregnet spor delvis fluorescens (PF, utvidelsen av bånd effektiviteten for multi-farge smFRET eksperimenter) kan være (figur 4A). PF er knyttet til nærhet til fargestoffer. I et tre farger smFRET eksperiment, dataene spenner over et 3D-rom (figur 5B). 2D projeksjoner av 3D histogrammet har vist seg for å være nyttig for staten separasjon (figur 4B, C). I en vellykket eksperiment er alle stater som forventes teoretisk under anvendt eksperimentelle forhold lett gjenkjennelig med sine PF i 2D anslagene.
Relativ befolkningen i USA bestemmes fra 2D anslagene av tegning gratis hånd tegninger som omslutter toppen (figur 5C). Denne tilnærmingen ble funnet for å være nøyaktig og pålitelig9. Utslipp sannsynlighetene for HMM er fremstilt ved passende 3D PF histogrammet med summen av 3D Gaussian funksjoner, der S er antall skjelnes stater (fem i presentert tilfelle; Figur 5 d). Denne passer til sammen riktig, har bare den relative befolkningen pjeg av hver stat jeg skal holdes konstant mens posisjonen og bredden av bruk er gratis.
En ensemble HMM er optimalisert over det fullstendige datasettet med utslipp sannsynlighetene fast parameterne fra Gaussian passer (figur 6). For å få et mål for usikkerhet i utdraget overgang sannsynlighetene, 95% CI for hver overgang er fastslått (figur 7).
I tillegg gjennomsnittlig tid at merket reporter nukleotid AMP-PNP * forblir bundet til Hsp90 kan trekkes ut under ulike eksperimentelle forhold (figur 8A). Dette bidrar til å redusere kompleksiteten i resultatene. Å gjøre det, som representerer AMP-PNP * bundne og ubundne konformasjonen skjules i staten baner, henholdsvis. Fra dette den gjennomsnittlige bor tid for AMP-PNP * dissosiasjon kan være beregnet (figur 8B).
Ved å sammenligne kinetics observert i fravær og tilstedeværelsen av ekstra, kan umerkede AMP-PNP, unik informasjon om sammenhengen mellom conformational forandringene av Hsp90 og nukleotid staten oppnås. Dette gjør det mulig å studere direkte cooperativity mellom to nukleotid bindende lommene på Hsp90. Dessuten, det omgår behovet for titrering eksperimenter som måler binding området okkupasjonen som en funksjon av underlaget konsentrasjonen (f.eks Hill tomter). For svært dynamiske protein systemer som Hsp90 er denne tilnærmingen følsomme for små endringer i priser11.
Figur 1 : Generelle arbeidsflyten av datainnsamling og analyse. Dataene ble anskaffet et multi-farge smFRET totale interne refleksjon fluorescens mikroskop (TIRFM). Når Spor markering og beregning av den delvise fluorescensen (PF), er 2D anslag av og 3D PF histogrammet kompilert. Bruker 2D anslagene, kan befolkningen i alle skjelnes stater bestemmes. Dette brukes som en begrensning for en 3D Gaussian passer til PF histogrammet. Funksjonene Gaussian sannsynlig tetthet tjene som utslipp sannsynligheter for påfølgende 3D ensemblet skjulte Markov modellering (HMM). Dette gir kinetic beskrivelsen av systemet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Av datainnsamling. (A) piktogram av studerte systemet består av en Hsp90 dimer (gul ovaler representerer domenestrukturen) festet til overflaten med etikettene Atto488 (blå) og Atto550 (grønn) og reporter nukleotid AMP-PNP * i løsningen merket med Atto647N (rød). Dataene registreres på et prisme-type TIRF mikroskop med vekslende laser eksitasjon (ALEX). (B) eksemplarisk fluorescens intensitet (Fl. Int.) spor etter blå og grønne eksitasjon. (C) piktogrammer av skjelnes conformational tilstandene til Hsp90 (S0, S1, S2, S3, S4) og deres respektive identifikator for funksjonell staten (O, C, O *, C *) brukes i dette arbeidet. Fluorophore posisjoner vises i blått, grønt og rødt. To bestander representerer samme funksjonelle tilstand, nemlig åpen Hsp90 med AMP-PNP * bundet (S2 og S3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Utvalgskriterier. (A) A molekyl valgt for videre analyse. (B, C) Molekyler ikke valgt for videre analyse. (B) ingen flat vidder og Atto550 er i en mørk tilstand rundt 30 s etter grønne eksitasjon (angitt med piler). (C) flere bleking trinn etter grønne eksitasjon (angitt med piler). Fl. Int.: fluorescens intensitet, blå: Atto488, grønn: Atto550, røde Atto647N, ex: eksitasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Beregning av PF spor og representant histogrammer. (A) representant fluorescens intensitet (Fl. Int.) spor og tilsvarende delvis fluorescens (PF) spor. (B) to 2D anslag i 3D PF histogrammet for måling i fravær av ekstra, umerkede nukleotid. (C) samme anslagene for eksperimentet i nærvær av ekstra 250 µM AMP-PNP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Befolkningen utvelgelsesprosessen. (A) plasseringen av fem skjelnes befolkningene i to 2D anslagene. (B) kopi av piktogrammer i figur 2C. (C) representant 3D spredningsdiagram PF data. Farge datapunktene er bare for visualisering. Samme fargekode som B brukes. (D) fastsettelse av relativ befolkningen gjøres ved tegning fri hånd polygoner rundt toppene i 2D histogrammet. Bruke en kombinasjon av to anslagene avbildet i Figur 3, kan alle fem befolkninger skilles. (E) resultatene av det 3D Gaussian passer til histogrammet av PF dataene A. Depicted er isosurfaces på FWHM, som representerer de fem ulike befolkningsgrupper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Flytdiagram for ensemble 3D HMM optimalisering. En modell er optimalisert for alle molekyler fra datasettet. Start verdiene er gitt av input modellen (med et forhåndsdefinert antall stater). Sannsynligheten for modellen gitt dataene (3D PF spor) er rangert med forover-bakover (FB) algoritme. Baum-Welch (BW) algoritmen gir et lokale Maksimal sannsynlighet anslag (MLE) av parametere. Globale MLE deretter finner iterativt. Viterbi algoritmen beregner mest sannsynlig staten banen gitt en modell. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Meningsfulle usikkerhet estimering med CI. (A) fastsettelse av CI for en eksemplarisk rate konstant. Sannsynligheten forholdet (LR) test modell sammenlignet med maksimal sannsynlighet estimator (MLE) modellen beregnes i området rundt MLE for rate konstant. 95% tillit bundet nås når LR overskrider 3.841 (vannrette mørk grå linjen). (B) utdraget hastigheten konstanter uten ekstra nukleotid (rød) og AMP-PNP (blå) og deres 95% CI. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Gjennomsnittlig bor tid reporter nukleotid AMP-PNP * bundet til Hsp90 er forlenget i nærvær av flere nukleotid. (A) piktogram av observerte dissosiasjon av merket AMP-PNP * fra Hsp90 dimer, gjennomsnitt over alle konformasjonen av Hsp90. Domenestrukturen i Hsp90 er merket med gult ovaler og conformational fleksibilitet er indisert ved å legge en åpen og lukket dimer. (B) gjennomsnittlig bor tid AMP-PNP * bundet til Hsp90 i fravær av ekstra nukleotid (rød) og tilstedeværelsen av 250 µM umerkede AMP-PNP (blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer den eksperimentelle prosedyren for å få tre farger smFRET data for en kompleks protein og en detaljert beskrivelse av analysen av disse målingene. Denne tilnærmingen gir en enestående mulighet til å vurdere sammenhengen mellom flere samhandling nettsteder eller conformational endringer direkte.
For å få egnet multi-farge single-molekylet data på proteiner er det viktig å utføre reproduserbar målinger på lavt støynivå. Dette kan oppnås ved hjelp av en effektiv og pålitelig overflate passivation protokoll for flow chamber9. En tettheten av molekyler immobilisert til overflaten bør brukes til å øke produksjonen av molekylene per innspilt film. Dette betyr at fluorescens lys fra enkelt molekyler bør falle på ca 5-10% av bildepunktene i de innspilte bildene. Samtidig bør overbelastning unngås, fordi det vil resultere i en overlapping i nabolandet molekyler. Når merket Art er ledig løsning (AMP-PNP * i presentert studien), kontroller at konsentrasjonen er lav nok til å ikke forstyrre målingen av direkte eksitasjon fra lasere med kortere bølgelengde (dvs. vanligvis godt under en micromolar konsentrasjon). Kontroller også at konsentrasjonen av disse forbindelsene ikke er lavere enn beregnet på grunn av uspesifikke binding til grensesnitt. I tillegg representerer optimal eksitasjon kraft en avveining mellom signal-til-støy-forhold og photobleaching av fluorophores.
Uten oksygen scavenging systemet er ansatt i presentert protokollen. De brukte Atto-Tec fargestoffer viser ikke betydelig blinker på tidsskalaen for eksperimentet (70 ms belysning per eksitasjon syklus) og ingen reduksjon av foto blekemiddel rate ble observert av åtseldyr som består av gluko og catalase Trolox33 ,34. Fravær av oksygen åtseldyr unngår også gjenstander på grunn av uspesifikke protein interaksjoner, som oksygen-scavenging systemer inneholder vanligvis protein komponenter til micromolar konsentrasjon35.
Et annet viktig skritt er spor utvalget. Størrelsen på området for summering intensiteten i en enkelt fluorophore er valgt så liten som mulig, men fortsatt større enn punkt spredning funksjon av oppsettet. Vær oppmerksom på at et flatt platå i felles intensiteten spor bare kan forventes hvis oppdagelsen kanalene har lignende tilsynelatende gamma faktorene, siden spor ikke rettes opp på dette stadiet av analysen. Bare molekyler som oppfyller veldefinerte vilkår for fluorescens intensitet spor er inkludert i analysen (del 3). Molekyler med dårlig signal-til-støy forholdet i PF spor er ekskludert fra videre analyse og påvirker ikke dataene evaluering som klart valg kriteriene brukes.
Avhengig av datakvaliteten gir alternative tilnærminger optimalt tildeling. En gratis multi-dimensjonale ensemble HMM basert på fluorescens intensitet spor27 eller PF spor kan brukes til å tildele de underliggende statene ved å optimalisere tilsvarende utslipp sannsynlighetene (f.eks Gaussian PDF) samtidig optimalisere kinetic modellen. Begge metodene har sine fordeler og ulemper. PF spor kan inneholde ugunstige toppene mens fluorescens intensitetsnivåer varierer fra molekyl til molekylet. Presentert protokollen løser dette problemet ved å hindre kunstig overganger når toppene oppstår og estimering av sannsynlighetene utslipp fra en 3D Gaussian passer til PF histogrammet og bare optimalisere overgang sannsynlighetene i den påfølgende ensemble HMM kjøre.
Presentert tilnærming er begrenset av behovet for en merket samhandling partner som binder med sammenlignbare høy affinitet for å være kompatibel med de lave konsentrasjonene nødvendig for konvensjonelle single-molekylet målinger. Dette kan overvinnes ved strategier for å øke lokal konsentrasjon (tethering av samhandling partnere36, innkapsling i blemmer37,38) eller metoder for å redusere spent volumet (f.eks null-modus bølgeledere39). I tillegg merking posisjoner må velges med omhu og kontroll eksperimenter er nødvendig for å utelukke alvorlige bivirkninger av fluorophores. Ved Hsp90 kontrolleres dette vanligvis av en ATPase analysen, som viser den enzymatiske aktiviteten40. Hvis tilgjengelig, anses strukturinformasjon fra crystal eller NMR struktur. Foretrukne posisjoner i overflaten-eksponerte looper, fra samhandling grensesnitt og begravet ikke i en protein overflaten lomme. Dette sikrer et stort tilgjengelig volum for fargestoff.
Rammen er egnet for en multi-farge smFRET eksperimentere med et vilkårlig antall farger. Vi fokuserer på tre farger målinger her, som disse allerede gir funksjonen som gjengir dem skiller seg fra andre single-molekylet eksperimenter, nemlig muligheten til å direkte observere sammenheng mellom to prosesser (f.eks binding av en samhandling partner og conformational endringer). Denne informasjonen er tilgjengelig i en standard to farger smFRET eksperiment, men av grunnleggende interesse for å forstå funksjonen av en molekylær maskin.
Presentert eksperiment og analyse er i stand til å karakterisere protein systemer, som kan vise dynamics på en rekke tidsskalaer mellom stater som har svært fleksibel3. Dette kontrast publisert tidligere multi-farge smFRET eksperimenter, som fokuserte på DNA eller RNA modellsystemer, for eksempel Holliday veikryss4, viser overganger mellom (hovedsakelig to) godt definert. I protein systemer, signal-til-støy forholdet er lavere og trekke ut et komplett sett overgangen er vanskelig på grunn av den begrensede timelige båndbredden smFRET eksperimenter på grunn av photobleaching. Her viser vi at - hvis nøye og med rimelige begrensninger - hindringer måle protein systemer kan overvinnes med multi-farge smFRET med multi-dimensjonale staten tildeling og ensemble skjulte Markov analyse9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet er finansiert av European forskningsråd gjennom ERC Grant avtalen n. 681891 og tyske Research Foundation (INST 39/969-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setup | |||
| vibration-damped optical table | Newport, Irvine, CA, USA | RS2000 | |
| OBIS 473nm LX 75mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1185052 | |
| OBIS 532nm LS 50mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1261779 | |
| OBIS 594nm LS 60mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1233470 | |
| OBIS 637nm LX 140mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1196625 | |
| laser control unit | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1234465 | Scientific Remote |
| aspheric telescope lenses | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | d=25.4mm, f=50mm and f=100mm | |
| CF ex1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 473/10 | cleanup filter excitation |
| CF ex2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 532/10 | cleanup filter excitation |
| CF ex3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 594/10 | cleanup filter excitation |
| CF ex4 | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | FL635-10 | cleanup filter excitation |
| DM ex1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZQ594RDC | dichroic mirror excitation |
| DM ex2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 570DCXR | dichroic mirror excitation |
| DM ex3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZQ491RDC | dichroic mirror excitation |
| AOTFnC-Vis | AA Opto-Electronic, Orsay, France | ||
| λ/4 plate | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | AQWP05M-600 | |
| CFI Apo TIRF 100x | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | high-NA objective | |
| piezo focus positioner MIPOS 250 CAP | piezosystem jena GmbH, Jena, Germany | Piezo Controller NV 40/1 CLE | |
| piezo stepper | Newport, Irvine, CA, USA | PZA12 | PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit |
| achromatic aspheric lenses | Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, Germany | G322-304-000 | d=50mm, f=200mm |
| adjustable optical slit | Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany | 27.160.1212 | max. aperture 12 x 12 mm |
| DM det1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | T 600 LPXR | dichroic mirror detection |
| DM det2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | H 560 LPXR superflat | dichroic mirror detection |
| DM det3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | HC BS R635 | dichroic mirror detection |
| BP det1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 525/40 BrightLine HC | bandpass filter detection |
| BP det2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 586/20 BrightLine HC | bandpass filter detection |
| BP det3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 631/36 BrightLine HC | bandpass filter detection |
| BP det4 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 700/75 ET Bandpass | bandpass filter detection |
| optical shutters detection | Vincent Associates, Rochester, NY, USA | Uniblitz VS25S2T0 | |
| EMCCD iXon Ultra 897 | Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland | ||
| digital I/O card, PCIe-6535 | National Instruments, Austin, Texas, USA | ||
| syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | PHD22/2000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow chamber | |||
| quartz slides | G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA | Spectrosil2000, h=3mm | |
| TEGADERM film | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | 1626W | 10 x 12cm |
| spray adhesive | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | Photo Mount 050777 | |
| glycerol | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | Immersol G | |
| immersion oil | OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, Germany | IMMOIL-F30CC | |
| prism | Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany | Suprasil1 | |
| aluminium prism holder | custom built | ||
| hollow setscrews | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | with custom drilling | |
| Tygon S3 E-3603 tubing | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | 2-4450 | ACF00001 |
| PTFE tubing | Bohlender GmbH, Grünsfeld, Germany | S1810-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sample | |||
| yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin | UniProt ID P02829 | ||
| Maleimide derivatives of Atto488, Atto550 | ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany | ||
| AMP-PNP* | Jena Bioscience, Jena, Germany | γ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N | |
| Fluospheres | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | F8764 | amine-modified, 0.2 μm, yellow-green fluorescent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Andor Solis | Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland | version 4.30 | |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, Texas, USA | version 2012, 32bit; misc. hardware control | |
| MDS control software | AA Opto-Electronic, Orsay, France | version 2.03a | |
| Coherent Connection | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | version 3 | |
| Igor Pro | WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA | version 6.37 |
References
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M.
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Henzler-Wildman, K., Kern, D.
- Hohng, S., Joo, C., Ha, T.
- Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy. ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).
- Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S.
- Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. Heat shock protein 90's mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).
- Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery. Nat Commun. 5, 4192 (2014).
- Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously. Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).
- Yengo, C. M., Berger, C. L. Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment. Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).
- Wortmann,P ,, Götz M,, Hugel T , Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1. Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).
- Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J Vis Exp. (120), e54782 (2017).
- Stephanopoulos, N., Francis, M. B. Choosing an effective protein bioconjugation strategy. Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).
- Sánchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Lee, N. K., et al. Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances. Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).
- Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).
- Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
- Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. 14, 174-180 (2017).
- Rabiner, L. R. A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition. Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).
- Fink, G. A. Markov Models for Pattern Recognition. , Springer London. London. (2014).
- Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models. Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).
- Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. Confidence intervals for hidden Markov model parameters. Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).
- McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling. Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).
- Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data. Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).
- Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data. PLoS ONE. 7 (2), e30024 (2012).
- Schmid, S., Götz, M., Hugel, T. Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium. Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).
- Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).
- Wayne, N., Bolon, D. N. Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers. J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).
- Ali, M. M. U., et al. Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex. Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).
- Southworth, D. R., Agard, D. A. Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle. Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).
- Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Ylänne, J., Rief, M. Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).
- Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic. Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
- Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).
