Summary
Случайного побегов может быть наведено на интермодального сегменты ipecac без лечения фитогормона. Для оценки динамики фитогормона во время формирования случайного стрелять, мы измерили эндогенного ауксинов и цитокининов интермодального сегментов, LC-MS/MS.
Abstract
Формирование случайного стрелять является важным методом распространения экономически важных культур и для регенерации трансгенных растений. Фитогормона лечение требуется для индукции случайного побегов в большинстве видов. Ли случайного побеги могут быть наведено определяется баланс между ауксинов и цитокининов (CK) уровнях. Много усилий уходит в определении оптимальной концентрации и комбинации фитогормонов в каждой ткани, используется в качестве эксплантов и каждого вида растений. В ipecac однако, случайного побегов может быть наведено на интермодального сегментов в культурной среде без лечения фитогормона. Это позволяет присущие пластичности ipecac для дифференцировки клеток оцениваться. Чтобы побудить случайного стреляет в ipecac, мы культивировали интермодального сегментов при 24 ° C под 15 мкмоль m−2 s−1 света в цикле Темный свет/10-h 14-h на свободных фитогормона B5 средних затвердевших с 0,2% gellan резинки на 5 недель. Расследовать фитогормона динамика во время формирования случайного стрелять, мы измерили эндогенного индол-3-уксусной кислоты и CKs в сегментах по жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии LC-MS/MS. Этот метод позволяет анализа эндогенных индол-3-уксусной кислоты и уровни CKs в простой форме. Он может применяться для изучения динамики эндогенного ауксинов и CK период органогенеза в других видов растений.
Introduction
Готлиб Иоганн Фридрих Хаберландт (1854-1945) предложил концепцию «тотипотентность», по которой завод клетки можно разделить, дифференцировать и регенерации целых заводов даже после их предварительного дифференциации в типы конкретных клеток в зрелых растений1. В культуре ткани ли регенерации растений может быть наведено или не определяется сочетание и концентрации экзогенно прикладной фитогормонов в среднего роста. Скуг и Миллер обнаружил, что случайного побеги могут быть вызваны из табака каллуса на питательной среды, содержащие высокий коэффициент CKs в ауксины, тогда как придаточных корней может быть наведено на носителе, содержащих низкий коэффициент2. После этого вывода, тканевой культуры широко используется для распространения экономически важных культур и для регенерации трансгенных растений3. Случайного побегов может быть вызван из тканей помимо стрелять апикальной Меристемы, например, листья, корни и междоузлий. Фитогормона лечение требуется для индукции случайного побегов в большинстве видов растений. Однако оптимальной концентрации и комбинации отличаются по видам и среди тканей, используемых в качестве эксплантов. Таким образом много усилий уходит в определении оптимальной концентрации и комбинации фитогормонов для экспериментов.
Ипекакуана (Brot.) L. Андерссон (ipecac) это лекарственное растение, содержит алкалоиды, как эметин и cephaeline, главным образом в корни4. Экстракты корня используются как отхаркивающее, рвотное и amoebicide5. Хотя ipecac Естественно произрастает в тропических лесах Бразилии, он неохотно установить семена в культуре, и всхожесть снижается во время хранения семян в Японии, с ее холоднее климат6. Вместо этого он распространяется на культуре ткани, в которой случайного стрелять формирование на междоузлий является наиболее эффективным методом7,8. Интересно, что в этот вид без фитогормона лечения8может быть наведено случайного побегов.
Случайного побеги образуются на эпидермис в регионе апикальной интермодального сегментов без callusing, но не в базальной области9. Эта разница указывает ткани полярности в интермодального сегментов, который, вероятно, под фитогормональный регулирования. Ipecac культуры система позволяет уникальная возможность анализировать изменения уровня эндогенного фитогормона во время формирования случайного стрелять. Здесь мы представляем наш метод для анализа эндогенными уровнями одного ауксинов (индол-3-уксусной кислоты (IAA)) и четыре CKs (изопентенил аденин (iP), изопентенил riboside аденин (ПИС), транс-Зеатин (tZ) и транс-Зеатин riboside (ТЗР)) в интермодального сегментов с помощью LC-MS/MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Ipecac (C. Ипекакуана) был использован в этом исследовании, потому что он облегчает анализ эндогенного фитогормонов.
1. рост условия чтобы побудить случайного побеги Ipecac
- Подготовка бесплатно фитогормона B5 среднего скорректирована с рН 5,710и добавить 0,2% gellan резинка. Стерилизация автоклавированием.
- Залейте 25 мл среды, газобетона в стерильных Петри (90 мм × 20 мм).
- Вырезать 8-мм интермодального сегментов ipecac Саженцы с помощью хирургического скальпеля с лезвием № 22 на стерильную Акриловые плиты и место на носителе (рис. 1).
- Культура на свободных фитогормона B5 носителе при 24 ° C под 15 мкмоль m−2 s−1 света в цикле Темный свет/10-h 14-h 5 недель.
- Определить регионы я (верхушечно) – IV (базальный) в каждом сегменте (рис. 1Б). Подсчитать количество случайного побеги > 0,3 мм длиной в каждом регионе под микроскопом один раз в неделю.
2. Извлечение и очистка фитогормоны
- Поставьте 5-мм циркония шарик в каждом из четырех 2-мл пробоотборные трубки.
- Вырезать сегменты в регионах I-IV (каждый 2 мм в длину) с помощью хирургического скальпеля на стерильную акриловые пластины.
- Сбор восемь сегментов каждого региона в отдельный образец трубки (10-30 мг свежего веса).
- Взвесить, а затем заморозить образцы в жидком азоте.
- Раздавить замороженных образцов с помощью гомогенизатор, основанные на шарик.
- Приостановить щебень образцы в ацетонитриле 1 мл, содержащих 500 pg каждого внутреннего стандарта ауксинов и CKs (d5-IAA, d5- tZ, d5- ТЗР, d6- iP, d6- ПИС) с помощью вихревой смеситель.
- Держите на 4 ° C для 1 h, а затем центрифуги на 3500 × g 5 мин при комнатной температуре.
- Помыть лепешка в ацетонитриле 80% (v/v), содержащей 1% (v/v) уксусная кислота. Центрифуга снова на 3500 × g 5 мин при комнатной температуре. Объединить supernatants (от шагов, 2.7 и 2.8) в одноразовых стеклянной трубки.
- Добавить 600 мкл воды содержащие уксусной кислоты 1% (v/v) для каждого комбинированных супернатанта и испаряются ацетонитриле, с помощью вакуума концентратор.
- Сбалансировать гидрофильно липофильного сбалансированный картриджи столбца (HLB), применяя 1 мл ацетонитриле, метанола и воды, содержащей 1% (v/v) уксусной кислоты.
- Применить один пример решения в уравновешенной HLB картриджа.
- Вымойте картриджи с 1 мл воды, содержащей 1% (v/v) уксусной кислоты.
- Элюировать все гормоны с Ацетонитрил 80% (v/v) 2 мл, содержащих 1% (v/v) уксусной кислоты в стеклянной трубки.
- Испарится Ацетонитрил в элюата для получения экстракта в воде, содержащей 1% (v/v) уксусной кислоты с помощью вакуумного концентратор.
Примечание: Не это полностью высохнуть. - Сбалансировать смешанного режима, сильный катионообмен (MCX) столбец картриджи, применяя Ацетонитрил 1 мл, 1 мл метанола, 0,5 мл 0,1 М HCl и 1 мл воды, содержащей 1% (v/v) уксусной кислоты.
- Применить один пример решения в уравновешенной MCX картриджа.
- Вымойте картриджи с 1 мл воды, содержащей 1% (v/v) уксусной кислоты.
- Элюировать IAA с 2 мл 30% (v/v) ацетонитриле, содержащей 1% (v/v) уксусной кислоты в стеклянной трубки.
- Вымойте картриджи с Ацетонитрил 80% (v/v) 2 мл, содержащих уксусной кислоты 1% (v/v).
- Вымойте картриджи с 2 мл и 1 мл воды, содержащей 5% водного раствора аммиака.
- Элюировать CKs с Ацетонитрил 60% (v/v) 2 мл, содержащих 5% водного раствора аммиака в стеклянной трубки.
- Испарения растворителя каждой фракции гормон, с помощью вакуума концентратор и хранить при −30 ° C до анализа LC-MS/MS.
3. LC-MS/MS анализ МАА и CKs
- Распустить каждый гормон экстракт в трубку с 600 мкл метанола и передавать решение для полного восстановления флакон винт шеи. Испарения растворителя, с помощью вакуума концентратор.
- Растворите IAA фракция в 20 мкл ацетонитриле 30% (v/v) и CK фракций в 20 мкл воды, содержащей 1% (v/v) уксусной кислоты в винт шеи полного восстановления флаконов.
- Анализ образцов в режиме положительных ионов на тройной квадрупольного MS системы с системой ВЭЖХ.
Примечание: Мы устанавливаем ВЭЖХ условия, перечисленные в таблице 1.- Для элюции IAA использовать двоичный градиент 5% - 50% растворителей B свыше 7 мин, затем увеличить на 98% растворителем B за 1 мин и удерживайте затем сбалансировать 2 мин на 5% растворителем B гнездо инъекции.
- Для элюции CK, использовать двоичный градиента 2% - 40% растворителей B более 5 мин, 40% - 70% растворителем B в 7 мин, а затем увеличить на 95% растворителем B за 1 мин и удерживайте затем сбалансировать 2 мин на 2% растворителем B, гнездятся инъекций.
- Установите электроспрей ионизации (ESI)-MS параметры источника ионов, перечисленные в таблице 2.
- Используйте несколько реакции, мониторинг (MRM) переход для количественной оценки каждого аналита, перечисленных в таблице 3.
- Количественно эндогенного МАА и CK уровнях против стандартной кривой соотношения немеченого дейтерия меченых стандартам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В 1 неделеst сформировали не случайного побегов. На 2-й неделе появились небольшие побегов. 3rd и 4-й недели, количество побегов увеличение главным образом в апикальной регионах (I и II)(Рисунок 2). На 5-й недели число побегов приблизительно 7 в регионе я был и 5 в регионе II (рис. 2B). В противоположность этому в регионов III и IV были сформированы только несколько побегов.
До культуры, уровень МАА был несколько выше в регионе I (4.1 ПГ/мг, свежие вес (FW)) чем в регионах II-IV (~ 2,5 ПГ/мг FW; Рисунок 3). В 1 неделеst , IAA уровень значительно увеличилась в регион IV (11,4 ПГ/мг FW) и несколько снизился в регионах I-III (1,5-2,2 ПГ/мг FW). На 2-й неделе, уровень IAA в регион IV сократилось до ~ 4,4 ПГ/мг FW, указав, что накопление IAA в регионе базальной переходных. 5 недели культуры градиент концентрации IAA появились, с уровнями увеличения от региона я для региона IV.
До культуры были только трассировки уровня большинства CKs (рис. 3). В 1 неделеst уровень ТЗР увеличится до 13,8 ПГ/мг FW в регионе II и 18,1 ПГ/мг FW в регионе III. Постепенно в течение 5 недель культуры затем снижение уровня. С другой стороны, уровни tZ, iP и ПИС, изменилось лишь незначительно в культуре.
Рисунок 1 : Подготовка ipecac для формирования случайного стрелять. (A) интермодального сегмент (8 мм) вырезается из регенерированного ipecac на лавочке чистой. (B) первый internode был использован для формирования случайного стрелять. (C) сегменты культивированный на 25 мл бесплатно фитогормона B5 носителе в чашках Петри побудить случайного побегов. Шкалы бар = 1 cm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Распределение случайного стреляет сформированных на сегмент интермодального. (A) случайного побегов, образовавшихся после 0-5 недель культуры. Шкалы бар = 5 mm. (B) сегментов были разделены на четыре региона (I-IV), и количество случайного побегов в каждом регионе был подсчитан в неделю 5. Данные являются средства ± SEM (n = 3). Десять сегментов были использованы в каждом эксперименте. Н.ф. = не найден. Эта цифра была изменена от Коикэ и др. 9 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Время курс анализа фитогормона уровней в интермодального сегментов. Сегменты были разделены на четыре региона (I-IV). Эндогенные МАА и CKs (tZ, ТЗР, iP и ПИС) в каждом регионе были количественно, LC-MS/MS. Поскольку iP и ПИС были очень низкими, увеличенной граф был вставлен внутри же граф. Данные являются средства ± SEM (n = 3). В каждом эксперименте использовались восемь сегментов. Эта цифра была изменена от Коикэ и др. 9 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Колонка | МАА: ACQUITY BEH C18 φ2.1 × 100 1.7 мкм |
| CKs: Poroshell EC-C18 φ2.1 × 50 2,7 мкм | |
| Температура | 40ºC |
| Подвижная фаза | Растворителя A: дистиллированной воды + 0,05% уксусной кислоты |
| Растворителя B: Ацетонитрил + 0,05% уксусная кислота | |
| Скорость потока | 0,35 мл/мин |
| Объем впрыска | 18 мкл |
Таблица 1: Состояние ВЭЖХ в МАА и CK анализа.
| Занавес газ (a.u.)* | 10 / 40 ** |
| Столкновение газ (a.u.)* | 5 / 3 ** |
| Ион спрей напряжение (V) | 5500 |
| Температура (ºC) | 600 |
| Ионный источник газа 1 (a.u.)* | 30 |
| Ионный источник газа 2 (a.u.)* | 40 / 80 ** |
| Резолюция | Единица |
Таблица 2: параметры источника ионов. * условные единицы. ** Анализ анализ/CK IAA. Эта таблица была изменена от Коикэ и др. 9
| Q1 (m/z) | Q3 (m/z) | Declustering потенциал (V) | Вход потенциальных (V) | Энергия столкновения (V) | |
| IAA | 176 | 130 | 26 | 6.5 | 21 |
| d5-IAA | 181 | 134 | 36 | 4.0 | 23 |
| tZ | 220 | 136 | 36 | 5.0 | 23 |
| d5- tZ | 225 | 137 | 31 | 5.0 | 21 |
| ТЗР | 352 | 220 | 41 | 5.5 | 23 |
| d5- ТЗР | 357 | 225 | 51 | 5.0 | 21 |
| iP | 204 | 136 | 31 | 9.0 | 19 |
| d6- iP | 210 | 137 | 31 | 5.5 | 21 |
| ПИС | 336 | 204 | 31 | 5.0 | 21 |
| d6- ПИС | 342 | 210 | 36 | 5.5 | 21 |
Таблица 3: MRM переходы МАА и CKs в анализе LC-MS/MS. Эта таблица была изменена от Коикэ и др. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Чтобы определить распределение фитогормонов участвующих в органогенез, важно использовать растительные материалы, в которых органогенеза можно наблюдать на фитогормона свободной среде, потому что когда фитогормонов экзогенно применяются к эксплантов для стимулирования побеги и корни, они влияют на весь экспланта, что делает его трудно оценить присущие пластику растений в дифференцировки клеток и органогенеза. Случайного побегов может быть наведено на фитогормона свободной культуры средств массовой информации в других видов растений, таких как Гвоздика садовая л11, Корреа Эгла marmelos (L.)12, Пеннелл monnieri Бакопа (L.)13, Древогубец paniculatus Willd. 14и Каланхоэ Блоссфельда Poelln. 15. можно было бы применять протокол в этих видов растений.
Мы извлекали МАА, tZ, ТЗР, iP и ПИС в ацетонитриле и очищенный их твердофазный экстракцией. Оригинальный метод использует три типа картриджа столбцов (HLB, MCX и слабых анион обмен (воск)), потому что все фитогормонов очищенный (включая гиббереллины, Абсцизовая кислота, Жасмоновая кислота и салициловая кислота)16. Столбце HLB использует полимерных реверс фазе сорбента, столбце MCX использует то же самое с катион обмен группами и столбце воск использует то же самое с слабой Анионообменная группами. Оригинальный метод elutes CKs (базовый) с 60% ацетонитриле, содержащие водного раствора аммиака на MCX столбце на втором шаге, а затем IAA (кислой) с 80% ацетонитриле, содержащей 1% уксусной кислоты на столбце воска на последнем шаге. Как наше внимание ауксинов и CKs, которые взаимодействуют антагонистически, регулирование роста растений17, упрощенный протокол использует только столбцы HLB и MCX; IAA этого eluted с 30% ацетонитриле, содержащей 1% уксусной кислоты на столбце HLB в первом шаге. Она занимает два дня от подготовки проб к анализу LC-MS/MS.
Ацетонитрил растворитель не должно быть позволено высохнуть во время очистки фитогормона в столбцах картриджа. Если это так, Ресуспензируйте образца в ацетонитриле, чтобы предотвратить фитогормонов стать застрял в стеклянной трубки и потерял из образца. В этом протоколе, является предел обнаружения с системой MS Ион ловушка ~ 10 pg для IAA и CKs от 10-30 мг свежего тканей. Для анализа меньшие суммы, следовало бы собирать гораздо больше образца или использовать MS с высокой чувствительностью.
Фитогормона анализ является важным методом для оценки роста и развития растений. С помощью этого метода, мы могли бы определить сроки ауксинов и CK лечения для формирования случайного стрелять в видов растений где условие оптимальной культуры до сих пор неизвестна. Как фитогормона количественной оценки становится все более важным, протокол LC-MS/MS, описанный здесь позволят анализ малых образцов с высокой чувствительностью и резолюции. Наши упрощение предыдущего метода облегчит очистки и анализа и принести высокую гибкость и воспроизводимость. В будущем этот метод может применяться для изучения динамики эндогенного ауксинов и CK период органогенеза в других видов растений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они имеют без конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарны г-н Акира Мураками кафедры прикладной Biosciences, Университета Тойо и г-н Koudai Танигути Гумма центра сельскохозяйственной технологии для их технической помощи. Мы признательны также профессором Shosaku Kashiwada и доктор Uma Елена Раджагопалан, Университетом Тойо за их предложения. Это исследование было поддержано в части научно-исследовательский центр для жизни и экологических наук, Университет Тойо.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13x100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
- Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
- Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
- Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).
- Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
- Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).
- Bajaj, Y. P. S. Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).
- Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
- Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
- Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
- Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
- Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
- Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
- Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
- Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
- Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).
