Summary
Brotos adventícios podem ser induzidos em segmentos internodal de ipeca sem tratamento phytohormone. Para avaliar a dinâmica phytohormone durante formação de tiro acidental, medimos endógena auxina e citocinina em segmentos internodal por LC-MS/MS.
Abstract
Formação de tiro acidental é uma técnica importante para a propagação de culturas economicamente importantes e a regeneração de plantas transgênicas. Tratamento de phytohormone é necessário para a indução de brotos adventícios na maioria das espécies. Se os brotos adventícios podem ser induzidos é determinado pelo saldo entre a auxina e citocinina (CK) níveis. Muito esforço vai para determinar concentrações óptimas e combinações de fitohormônios em cada tecido usado como explantes e em cada espécie de planta. Em ipecac, no entanto, brotos adventícios podem ser induzidos em segmentos internodal em meio de cultura sem tratamento phytohormone. Isso permite que a plasticidade inerente de ipeca para diferenciação de célula a ser avaliada. Para induzir os brotos adventícios em ipecac, nós cultivadas internodal segmentos a 24 ° C sob 15 µmol m− 2 s− 1 de luz em um ciclo escuro da luz/10-h 14-h phytohormone livre B5 meio solidificado com 0,2% gelano por 5 semanas. Para investigar a dinâmica phytohormone durante formação de tiro acidental, medimos endógeno ácido indol-3-acético e CKs nos segmentos por líquido espectrometria de massa em tandem-cromatografia de LC-MS/MS. Este método permite a análise de ácido indol-3-acético endógeno e CKs níveis de forma simples. Pode ser aplicado para investigar a dinâmica de auxina endógena e CK durante a organogênese em outras espécies de plantas.
Introduction
Gottlieb Haberlandt (1854-1945) propôs o conceito de "totipotência", pela qual planta células podem dividir, diferenciar e regenerar plantas inteiras mesmo após sua prévia diferenciação em tipos de células específicas em plantas maduras1. Em cultura de tecidos, se planta regeneração pode ser induzida ou não é determinada pela combinação e concentração de fitohormônios exogenamente aplicadas no meio de crescimento. Skoog e Miller encontraram que brotos adventícios poderiam ser induzidos de tabaco calo no meio de cultura contendo uma alta proporção de CKs de auxinas, Considerando que raízes adventícias poderiam ser induzidas em meio contendo uma baixa relação2. Desde essa constatação, cultura de tecidos foi amplamente utilizada para a propagação de culturas economicamente importantes e a regeneração de plantas transgénicas3. Brotos adventícios podem ser induzidos a partir de tecidos que não sejam o meristema apical de tiro, como folhas, raízes e entrenós. Tratamento de phytohormone é necessário para a indução de brotos adventícios na maioria das espécies de plantas. No entanto, o ideais concentrações e combinações diferem por espécie e entre tecidos utilizados como explantes. Assim, muito esforço vai para determinação da concentração ideal e combinações de fitohormônios para experimentos.
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipecacuanha) é uma planta medicinal que contém alcaloides como Emetina e a Cefalina, principalmente no raízes4. Extratos de raiz são usados como um expectorante, um emético e um amoebicide5. Embora ipecac cresce naturalmente nas florestas tropicais do Brasil, é relutante em conjunto de sementes na cultura, e a taxa de germinação diminui durante o armazenamento de sementes no Japão, com seus de clima mais frio6. Em vez disso, ele é propagado por cultura de tecidos, no qual adventícios atirar formação em entrenós é o mais eficiente método de7,8. Curiosamente, os brotos adventícios podem ser induzidos nesta espécie sem phytohormone tratamento8.
Brotos adventícios são formados na epiderme na região apical dos segmentos internodal sem callusing, mas não na região basal9. Esta diferença indica a polaridade do tecido em segmentos internodal, que é, provavelmente, ao abrigo do Regulamento fitohormonal. O sistema de cultura de ipecac permite uma oportunidade única para analisar as alterações nos níveis endógenos phytohormone durante formação de tiro acidental. Aqui apresentamos nosso método para a análise dos níveis endógenos de uma auxina (ácido indol-3-acético (IAA)) e quatro CKs (isopentenilo adenina (iP), Ribosídica de adenina de isopentenilo (iPR), trans-Zeatina (tZ) e trans-Zeatina Ribosídica (tZR)) em segmentos internodal através do uso de LC-MS/MS.
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Protocol
Nota: Poaia (ipecacuanha c.) foi usada neste estudo porque facilita a análise de fitohormônios endógenas.
1. crescimento condições para induzir brotos adventícios de ipeca
- Prepare phytohormone livre B5 médio ajustado ao pH 5.710e adicionar gelano 0,2%. Esterilize em autoclave.
- Despeje uma placa de Petri estéril (90 mm × 20 mm), 25 mL do meio de autoclave.
- Corte-8mm internodal segmentos de plântulas de ipecac, usando um bisturi cirúrgico com uma lâmina n º 22, em uma placa de acrílico estéril e coloque no meio (Figura 1).
- Cultura livre phytohormone B5 meio a 24 ° C sob 15 µmol m− 2 s− 1 de luz em um ciclo escuro da luz/10-h 14-h por 5 semanas.
- Identificar regiões eu (apical) a IV (basal) em cada segmento (Figura 1B). Conte o número de brotos adventícios > 0,3 mm de comprimento em cada região sob um microscópio, uma vez por semana.
2. extração e purificação de fitohormônios
- Coloque uma pérola zircônia 5 mm em cada um dos quatro tubos 2 mL de amostra.
- Corte os segmentos em regiões I a IV (cada 2 mm em comprimento) usando um bisturi cirúrgico em uma placa de acrílico estéril.
- Colete oito segmentos de cada região em tubos de amostra separada (peso fresco de 10 a 30 mg).
- Pesar e em seguida, congelar as amostras em nitrogênio líquido.
- Esmaga as amostras congeladas, usando um homogeneizador de grânulo-baseado.
- Suspender as amostras esmagadas em 1 mL acetonitrila contendo 500 pg de cada padrão interno de auxina e CKs (d5-IAA, d5- tZ, d5- tZR, d6- iP, d6- iPR) usando um misturador do vortex.
- Mantenha a 4 ° C, durante 1 h e, em seguida, centrifugar a 3.500 × g por 5 min à temperatura ambiente.
- Lave o pellet em acetonitrila 80% (v/v) contendo ácido acético a 1% (v/v). Centrifugar novamente 3.500 × g por 5 min à temperatura ambiente. Combine os sobrenadantes (a partir de etapas 2.7 e 2.8) em um tubo de vidro descartáveis.
- Adicione 600 µ l contendo ácido acético de 1% (v/v) para cada sobrenadante combinada de água e evaporar o acetonitrilo usando um concentrador a vácuo.
- Equilibrar o hidrófilo lipofílico-balanceamento de cartuchos de coluna (HLB) aplicando-se 1 mL de água contendo 1% (v/v) de ácido acético, metanol e acetonitrila.
- Aplica uma solução de amostra por cartucho HLB equilibrado.
- Lave os cartuchos com 1 mL de água contendo ácido acético a 1% (v/v).
- Eluir todos hormônios com acetonitrilo de 80% (v/v) de 2 mL contendo ácido acético a 1% (v/v) em um tubo de vidro.
- Evapore o acetonitrilo no eluato para obter o extrato em água contendo 1% (v/v) de ácido acético usando um concentrador a vácuo.
Nota: Não seque isto completamente. - Equilibrar os cartuchos de coluna de modo misto, forte permutadora de catiões (MCX) aplicando-se 1 mL acetonitrilo, 1 mL de metanol, 0,5 mL 0,1 M de HCl e 1 mL de água contendo ácido acético a 1% (v/v).
- Aplica uma solução de amostra por cartucho MCX equilibrado.
- Lave os cartuchos com 1 mL de água contendo ácido acético a 1% (v/v).
- Eluir IAA com acetonitrilo de 30% (v/v) de 2 mL contendo ácido acético a 1% (v/v) em um tubo de vidro.
- Lave os cartuchos com acetonitrilo de 80% (v/v) de 2 mL contendo 1% (v/v) de ácido acético.
- Lave os cartuchos com 2 mL de água e 1 mL de água contendo amônia aquosa de 5%.
- Eluir os CKs com acetonitrilo de 60% (v/v) de 2 mL contendo 5% de amônia aquosa em um tubo de vidro.
- Evaporar o solvente de cada fração do hormônio usando um concentrador a vácuo e armazenar a 30 ° C até a análise de LC-MS/MS.
3. a LC-MS/MS análise de IAA e CKs
- Dissolver cada extracto de hormônio em um tubo com 600 µ l de metanol e transferir a solução para um frasco de recuperação total do pescoço de parafuso. Evapore o solvente usando um concentrador a vácuo.
- Dissolva a fração de IAA em 20 µ l de 30% (v/v) acetonitrila e as frações CK em água de 20 µ l contendo ácido acético a 1% (v/v) em frascos de recuperação total de pescoço de parafuso.
- Analise as amostras no modo de íon positivo em um sistema de MS triplo quadrupolo equipado com um sistema HPLC.
Nota: Podemos definir as condições HPLC conforme listado na tabela 1.- Para a eluição do IAA, use um gradiente binário de 5% - 50% solvente B mais 7 min, em seguida, aumentar por 98% de solvente B Aguarde 1 min e então equilibrar por 2 min em 5% solvente B por injeção de ninho.
- Para a eluição de CK, use um gradiente binário de 2% - 40% de solvente B mais 5 min, 40% - 70% de solvente B em 7 min, em seguida, aumentar em 95% solvente B Aguarde 1 min e então equilibrar por 2 min em 2% solvente B por ninho de injeção.
- Definir a ionização electrospray (ESI)-MS parâmetros da fonte de íons, conforme listado na tabela 2.
- Use a reação múltiplo monitoramento transição (MRM) para quantificação de cada analito listado na tabela 3.
- Quantificar os níveis endógenos de IAA e CK contra uma curva-padrão do rácio de sem rótulo para padrões de deutério-rotulado.
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Representative Results
Em 1 semanast , sem brotos adventícios tinham formado. Na semana de 2nd , pequenos brotos apareceram. O 3rd e 4 semanas deth , o número de tiros aumento principalmente nas regiões apicais (I e II)(Figura 2). Na semana de 5th , o número de brotos foi aproximadamente 7 em região eu e 5 na região II (Figura 2B). Em contraste, apenas alguns tiros foram formados nas regiões III e IV.
Antes de cultura, o nível de IAA foi ligeiramente superior na região I (4.1 pg/mg, peso fresco (FW)) do que em regiões II-IV (~ 2.5 pg/mg FW; A Figura 3). Em 1 semanast , o nível de IAA aumentou bastante na região IV (11,4 pg/mg FW) e diminuiu ligeiramente em regiões I a III (1.5-2.2 pg/mg FW). Na semana de 2nd , o nível de IAA na região IV diminuiu para ~ 4.4 pg/mg FW, indicando que o acúmulo de IAA na região basal foi transitório. Por 5 semanas de cultura, um gradiente de concentração de IAA emergiu, com níveis crescente da região a região IV.
Antes de cultura, havia apenas traços de maioria CKs (Figura 3). Em 1 semanast , o nível de tZR aumentou 13,8 pg/mg FW na região II e 18.1 pg/mg FW na região III. Os níveis então diminuíram gradualmente ao longo de 5 semanas de cultura. Por outro lado, os níveis de tZ, iP e iPR mudaram somente ligeiramente durante a cultura.
Figura 1 : Preparação de ipeca para formação de tiro acidental. (A) um segmento internodal (8 mm de comprimento) é reduzir de ipecac regenerada em uma bancada limpa. (B) o primeiro entrenó foi usada para formação de tiro acidental. (C) segmentos são cultivados no suporte 25 mL livre phytohormone B5 em placas de Petri para induzir brotos adventícios. Barra de escala = 1 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Distribuição de adventícios atira formada em um segmento internodal. (A) brotos adventícios formados depois de 0 a 5 semanas de cultura. Barra de escala = 5 mm. (B) segmentos foram divididos em quatro regiões (I-IV), e o número de brotos adventícios em cada região foi contado na semana 5. Dados são meios ± SEM (n = 3). Dez segmentos foram usados em cada experimento. NF = não encontrado. Esta figura foi modificada de Koike et al 9 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Tempo-curso de análise de níveis phytohormone em segmentos internodal. Segmentos foram separados em quatro regiões (I-IV). Endógena de IAA e CKs (tZ, tZR, iP e direitos de propriedade intelectual) em cada região foram quantificados por LC-MS/MS. Porque o iP e iPR níveis estavam muito baixos, um gráfico ampliado foi inserido dentro o mesmo gráfico. Dados são meios ± SEM (n = 3). Oito segmentos foram usados em cada experimento. Esta figura foi modificada de Koike et al 9 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Coluna | IAA: ACQUITY BEH C18 φ2.1 × 100 1.7 µm |
| CKs: Poroshell CE-C18 φ2.1 × 50 2.7 µm | |
| Temperatura | 40º c |
| Fase móvel | R: solvente água destilada água + 0,05% de ácido acético |
| B solvente: acetonitrila + 0,05% de ácido acético | |
| Taxa de fluxo | 0,35 ml/min |
| Volume de injeção | 18 µ l |
Tabela 1: Condição HPLC em análise IAA e CK.
| Gás de cortina (a.u.)* | 10 / 40 * * |
| Gás de colisão (a.u.)* | 5 / 3 * * |
| Tensão de pulverizador de íon (V) | 5500 |
| Temperatura (º c) | 600 |
| Gás de fonte do íon 1 (a.u.)* | 30 |
| Gás de fonte do íon 2 (a.u.)* | 40 / 80 * * |
| Resolução | Unidade |
Tabela 2: parâmetros da fonte de íon. * unidades arbitrárias. * * Análise de análise/CK IAA. Esta tabela foi modificada de Koike et al 9
| Q1 (m/z) | Q3 (m/z) | Declustering potencial (V) | Potencial de entrada (V) | Energia de colisão (V) | |
| IAA | 176 | 130 | 26 | 6.5 | 21 |
| d5-IAA | 181 | 134 | 36 | 4.0 | 23 |
| tZ | 220 | 136 | 36 | 5.0 | 23 |
| d5- tZ | 225 | 137 | 31 | 5.0 | 21 |
| tZR | 352 | 220 | 41 | 5.5 | 23 |
| d5- tZR | 357 | 225 | 51 | 5.0 | 21 |
| iP | 204 | 136 | 31 | 9.0 | 19 |
| d6- iP | 210 | 137 | 31 | 5.5 | 21 |
| direitos de propriedade intelectual | 336 | 204 | 31 | 5.0 | 21 |
| d6- direitos de propriedade intelectual | 342 | 210 | 36 | 5.5 | 21 |
Tabela 3: transições de MRM de IAA e CKs na análise de LC-MS/MS. Esta tabela foi modificada de Koike et al 9
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Discussion
Para identificar a distribuição dos fitohormônios envolvidos na organogênese, é importante o uso de materiais vegetais em que organogênese pode ser observado na média phytohormone-livre, porque quando os fitohormônios são exogenamente aplicados a explantes para induzir brotos ou raízes, elas afetam o explante todo, tornando-se difícil avaliar a plasticidade inerente de plantas na diferenciação celular e organogênese. Brotos adventícios podem ser induzidos em meios de cultura livre phytohormone em outras espécies de plantas tais como Dianthus caryophyllus L.11, Corrêa Aegle marmelos (L.)12, Bacopa monnieri (L.) Pennell13 Celastrus paniculatus Willd. 14e Kalanchoë blossfeldiana Poelln. 15. é possível aplicar o protocolo nestas espécies de plantas.
Nós extraído IAA, tZ, tZR, iP e direitos de propriedade intelectual em acetonitrila e purificado-los pela extração de fase sólida. O método original usa três tipos de colunas de cartucho (HLB, MCX e troca de ânion fraco (cera)), porque todos os fitohormônios são purificados (incluindo giberelinas, ácido abscísico, ácido jasmonic e ácido salicílico)16. A coluna HLB usa uma reverso-fase polimérica adsorvente, a coluna MCX usa o mesmo com grupos de permuta catiónica e a coluna de cera usa o mesmo com grupos permutadora fraco. O método original elutes CKs (básicos) com 60% de acetonitrilo contendo amônia aquosa em uma coluna MCX na segunda etapa e, em seguida, IAA (ácido) com acetonitrilo 80% contendo 1% de ácido acético em uma coluna de cera na última etapa. Como nosso foco é a auxina e CKs, que interagem antagônico para regular o crescimento de planta17, o protocolo simplificado usa somente as colunas HLB e MCX; IAA é eluída com acetonitrilo 30% contendo 1% de ácido acético na coluna HLB na primeira etapa. Leva dois dias de preparação da amostra para análise de LC-MS/MS.
O solvente acetonitrila não deverá estar a secar durante a purificação phytohormone nas colunas cartucho. Se isso acontecer, resuspenda a amostra em acetonitrilo para impedir que os fitohormônios tornando-se presa ao tubo de vidro e perdeu da amostra. Neste protocolo, o limite de detecção com o sistema de MS íon-armadilha é ~ 10 pg para IAA e CKs de tecidos frescos de 10-30 mg. Para analisar quantidades menores, seria necessário coletar amostra muito mais ou usar MS com maior sensibilidade.
Análise de phytohormone é uma técnica importante para a avaliação do desenvolvimento e crescimento das plantas. Usando esse método, pode ser capaz de determinar o momento da auxina e CK tratamento para formação de tiro acidental em espécies vegetais onde a condição ideal de cultura ainda é desconhecida. Como quantificação phytohormone torna-se cada vez mais importante, o protocolo de LC-MS/MS aqui descrito permitirá que a análise de pequenas amostras com alta sensibilidade e resolução. Nossa simplificação de um método anterior irá facilitar a purificação e análise e trazer reprodutibilidade e alta versatilidade. No futuro, este método pode ser aplicado para investigar a dinâmica da auxina endógena e CK durante a organogênese em outras espécies de plantas.
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Disclosures
Os autores declaram que têm não há conflitos de interesse.
Acknowledgments
Nós estamos gratos ao Sr. Akira Murakami do departamento de Biociências aplicadas, Universidade de Toyo e Sr. Koudai Taniguchi do centro de tecnologia agrícola de Gunma para sua assistência técnica. Nós também estamos gratos ao Professor Shosaku Kashiwada e Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Universidade Toyo para suas sugestões. Este estudo foi suportado em parte pelo centro de pesquisa para a vida e ciências ambientais, Universidade de Toyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13x100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
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