Summary
Oavsiktlig skott kan induceras på internodal segment Ipecac utan phytohormone behandling. För att utvärdera phytohormone dynamics under oavsiktlig shoot bildandet, mätte vi endogena auxin och cytokinin i internodal segment av LC-MS/MS.
Abstract
Oavsiktlig shoot bildandet är en viktig teknik för förökning av ekonomiskt viktiga grödor och för regenerering av transgena växter. Phytohormone behandling krävs för induktion av oavsiktlig skott i de flesta arter. Om oavsiktlig skott kan induceras bestäms av balansen mellan auxin och cytokinin (CK) nivåer. Mycket arbete går in i att fastställa optimala koncentrationer och kombinationer av fytohormoner i varje vävnad som används som bladsticklingar och i varje växtarter. I ipecac, dock kan oavsiktlig skott framkallas på internodal segment i odlingsmedium utan phytohormone behandling. Detta tillåter inneboende plasticitet Ipecac för celldifferentiering utvärderas. För att inducera oavsiktlig skott i ipecac, odlade vi internodal segment vid 24 ° C under 15 µmol m−2 s−1 av ljus i en 14-h ljus/10-h mörka cykel på phytohormone-fri B5 medium solidifierats med 0,2% gellan tuggummi i 5 veckor. För att undersöka phytohormone dynamics under oavsiktlig shoot bildandet, mätte vi endogena indol-3-ättiksyra och CKs inom segmenten av flytande kromatografi-tandem mass spectrometry LC-MS/MS. Denna metod tillåter analys av endogena indol-3-ättiksyra och CKs nivåer på ett enkelt sätt. Det kan användas för att undersöka dynamiken av endogena auxin och CK under organogenes hos andra växtarter.
Introduction
Gottlieb Haberlandt (1854-1945) föreslås begreppet ”totipotency”, av vilken växt celler kan dela, differentiera och regenerera hela växter även efter deras tidigare differentiering till specifika celltyper i mogen växter1. I vävnadskultur bestäms huruvida växten regenerering kan induceras eller inte av kombinationen och koncentrationen av exogent tillämpad fytohormoner i odlingsmedium. Skoog och Miller hittade att oavsiktlig skott kan induceras från tobak förhårdnader på odlingsmedium som innehåller en hög andel av CKs till auxins, medan oavsiktlig rötter kunde förmås på medium innehållande en låg baserat2. Sedan detta konstaterande, har vävnadsodling använts för förökning av ekonomiskt viktiga grödor och för regenerering av transgena växter3. Oavsiktlig skott kan induceras från vävnader än skjuta apical meristem, såsom blad, rötter och internoder. Phytohormone behandling krävs för induktion av oavsiktlig skott i de flesta växtarter. De optimala koncentrationer och kombinationer skiljer sig dock av arter och vävnader används som bladsticklingar. Mycket möda går således till att fastställa optimala koncentrationer och kombinationer av fytohormoner för experiment.
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipecac) är ett läkemedel som innehåller alkaloider såsom Emetin och Cefaelin, främst i rötter4. Root extrakt används som ett slemlösande, ett kräkmedel och en amoebicide5. Även om ipecac växer naturligt i tropiska regnskogar i Brasilien, det är ovilliga att ställa in frön i kultur och grobarheten minskar under utsäde lagring i Japan, med dess kallare klimat6. Istället är det förökas genom vävnadsodling, i vilket oavsiktlig skjuta bildandet på internoder är den mest effektiva metod7,8. Intressant, kan oavsiktlig skott induceras hos denna art utan phytohormone behandling8.
Oavsiktlig skott bildas på epidermis i apikala regionen av internodal segment utan callusing, men inte i den basala region9. Denna skillnad indikerar vävnad polaritet i internodal segment, vilket förmodligen är enligt phytohormonal förordning. Ipecac kultur systemet tillåter en unik möjlighet att analysera förändringar i endogena phytohormone nivåer under oavsiktlig shoot bildandet. Här presenterar vi vår metod för analys av de endogena nivåerna av en auxin (indol-3-ättiksyra (IAA)) och fyra CKs (isopentenyl adenin (iP), isopentenyl adenin riboside (iPR), trans-zeatin (tZ) och trans-zeatin riboside (tZR)) i internodal segment med hjälp av LC-MS/MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Ipecac (C. ipecacuanha) användes i denna studie eftersom det underlättar analysen av endogena fytohormoner.
1. tillväxt villkorar att inducera oavsiktlig skott Ipecac
- Förbered phytohormone-fri B5 medium justerat till pH 5,710, och tillsätt 0,2% gellan tuggummi. Sterilisera i autoklav.
- Häll 25 mL av Ånghärdad medium i en steril petriskål (90 mm × 20 mm).
- Skär 8-mm internodal segment av ipecac plantlets med en kirurgisk skalpell med ett blad nr 22 på en steril akryl tallrik och placera på medellång (figur 1).
- Kultur på phytohormone-fri B5 medium vid 24 ° C under 15 µmol m−2 s−1 av ljus i en 14-h ljus/10-h mörka cykel i 5 veckor.
- Identifiera regioner jag (apical) IV (basal) i varje segment (figur 1B). Räkna antalet oavsiktliga skott > 0,3 mm längd i varje region under ett Mikroskop en gång i veckan.
2. extraktion och rening av fytohormoner
- Sätta en 5-mm zirconia bead i varje av de fyra 2-mL provrör.
- Skär segmenten i regioner I till IV (varje 2 mm i längd) med en kirurgisk skalpell på en steril akryl tallrik.
- Samla åtta segment för varje region i separata provrör (10-30 mg färsk vikt).
- Väger, och sedan frysa proverna i flytande kväve.
- Krossa de frysta prover med hjälp av en pärla-baserade Homogenisatorer.
- Avbryta de krossade proverna i 1 mL acetonitril som innehåller 500 pg av varje intern standard av auxin och CKs (d5-IAA, d5- tZ, d5- tZR, d6- iP, d6- iPR) använder en vortex mixer.
- Håll vid 4 ° C för 1 h sedan Centrifugera vid 3.500 × g i 5 min i rumstemperatur.
- Tvätta pelleten i 80% (v/v) acetonitril som innehåller 1% (v/v) ättiksyra. Centrifugera igen på 3.500 × g i 5 min i rumstemperatur. Kombinera supernatanterna (från steg 2.7 och 2.8) i en disponibel glasrör.
- Lägga till 600 µL vatten innehållande 1% (v/v) ättiksyra till varje kombinerade supernatanten och avdunstar den acetonitril som använder en vakuum koncentrator.
- Temperera hydrofil-lipofila-balanserad (HLB) kolumn patroner genom att tillämpa 1 mL vardera av acetonitril, metanol och vatten som innehåller 1% (v/v) ättiksyra.
- Applicera en provlösning skakad HLB patron.
- Tvätta patronerna med 1 mL vatten som innehåller 1% (v/v) ättiksyra.
- Eluera alla hormoner med 2 mL 80% (v/v) acetonitril som innehåller 1% (v/v) ättiksyra i ett glasrör.
- Indunsta acetonitril i eluatet att erhålla extraktet i vatten som innehåller 1% (v/v) ättiksyra med hjälp av ett vakuum koncentrator.
Obs: Torka inte detta helt. - Temperera blandat läge, stark katjon-exchange (MCX) kolumn patroner genom att tillämpa 1 mL acetonitril, 1 mL metanol, 0,5 mL 0,1 M HCl och 1 mL vatten som innehåller 1% (v/v) ättiksyra.
- Applicera en provlösning skakad MCX patron.
- Tvätta patronerna med 1 mL vatten som innehåller 1% (v/v) ättiksyra.
- Eluera IAA med 2 mL 30% (v/v) acetonitril som innehåller 1% (v/v) ättiksyra i ett glasrör.
- Tvätta patronerna med 2 mL 80% (v/v) acetonitril som innehåller 1% (v/v) ättiksyra.
- Tvätta cylinderampuller med 2 mL vatten och 1 mL vatten som innehåller 5% vattenlösning ammoniak.
- Eluera CKs med 2 mL 60% (v/v) acetonitril som innehåller 5% vattenlösning ammoniak i ett glasrör.
- Avdunsta lösningsmedlet i varje hormon bråk med en vakuum koncentrator och lagra på −30 ° C tills den LC-MS/MS-analysen.
3. LC-MS/MS-analys av IAA och CKs
- Lös upp varje hormon utdrag i ett rör med 600 µL av metanol och överför lösningen till en skruv hals totala återhämtningen injektionsflaska. Avdunsta lösningsmedlet med en vakuum koncentrator.
- Upplösa den IAA fraktionen i 20 µL 30% (v/v) acetonitril och CK fraktioner i 20 µL vatten innehållande 1% (v/v) ättiksyra i skruv hals totala återhämtningen injektionsflaskor.
- Analysera proverna i positiv Jon läge på en triple-quadrupole MS system utrustade med HPLC-system.
Obs: Vi satt HPLC villkoren som anges i tabell 1.- För den IAA elueringen, använda en binär gradient av 5-50% lösningsmedel B över 7 min, sedan öka med 98% lösningsmedel B och håll under 1 min, och sedan låt jämvikta i 2 min på 5% lösningsmedel B genom boet injektion.
- För den CK elueringen, använda en binär gradient 2-40% lösningsmedel b över 5 min, 40-70% lösningsmedel B i 7 min, och sedan öka med 95% lösningsmedel B håll för 1 min och sedan låt jämvikta i 2 min vid 2% lösningsmedel B av kapsla injektion.
- Ange elektrospray joniseringen (ESI)-MS parametrar av ion källa som förtecknas i tabell 2.
- Använda flera reaktionen övervakning (MRM) övergången för kvantifiering av varje analyt som anges i tabell 3.
- Kvantifiera endogena IAA och CK nivåer mot en standardkurva av förhållandet mellan omärkt deuterium-märkt standarder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1st vecka, hade ingen oavsiktlig skott bildat. 2nd veckan verkade små skott. På 3rd och 4th veckor, skjuter antalet ökade mest i de apikala regionerna (I och II) (figur 2A). 5: e vecka, antalet skott var cirka 7 i regionen jag och 5 i region II (bild 2B). Däremot bildades bara några skott regioner III och IV.
Innan kultur, IAA var något högre i regionen I (4,1 pg/mg, färsk vikt (FW)) än i regioner II-IV (~ 2,5 pg/mg FW; (Se figur 3). 1st vecka, IAA ökat kraftigt i regionen IV (11,4 pg/mg FW) och minskade något i regioner I-III (1,5-2,2 pg/mg FW). 2nd vecka, IAA i regionen IV sjönk till ~ 4,4 pg/mg FW, vilket indikerar att IAA ackumulering i basala regionen var övergående. Av 5 veckor av kultur uppstod en IAA koncentrationsgradient, med nivåer ökar från region till region IV.
Innan kultur fanns det endast spårämnesnivåer av de flesta CKs (figur 3). 1st vecka, tZR ökat till 13,8 pg/mg FW i region II och 18,1 pg/mg FW i regionen III. De minskade sedan gradvis under 5 veckor av kultur. Däremot, nivåerna av tZ, iP och iPR ändras endast marginellt under kultur.
Figur 1 : Beredning av ipecac för oavsiktlig shoot bildandet. (A) ett internodal segment (8 mm lång) skärs från regenererad ipecac på en ren bänk. (B) först internoden användes för oavsiktlig shoot bildandet. (C) segment är odlade på 25 mL phytohormone-fri B5 medium i petriskålar inducera oavsiktlig skott. Skalstapeln = 1 cm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Distribution av oavsiktlig skjuter bildade på ett internodal segment. (A) oavsiktlig skott bildas efter 0 5 veckor av kultur. Skalstapeln = 5 mm. (B) segment delades in i fyra regioner (I-IV), och antalet oavsiktliga skott i varje region räknades vid vecka 5. Data är medel ± SEM (n = 3). Tio segment användes i varje experiment. N.F. = ej hittad. Denna siffra har ändrats från Koike o.a. 9 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Tid-kursen analys av phytohormone nivåer i internodal segment. Segment var separerade i fyra regioner (I-IV). Endogena IAA och CKs (tZ, tZR, iP och iPR) i varje region kvantifierades genom LC-MS/MS. Eftersom iP och iPR nivåer var mycket låga, infogades en zoomade diagrammet inuti samma graf. Data är medel ± SEM (n = 3). Åtta segment användes i varje experiment. Denna siffra har ändrats från Koike o.a. 9 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Kolumn | IAA: ACQUITY BEH C18 φ2.1 × 100 1,7 µm |
| CKs: Poroshell EG-C18 φ2.1 × 50 2,7 µm | |
| Temperatur | 40ºC |
| Mobil fas | Lösningsmedel A: destillerat vatten + 0,05% ättiksyra |
| Lösningsmedel B: acetonitril + 0,05% ättiksyra | |
| Flödeshastighet | 0,35 ml/min |
| Injektionsvolym | 18 µl |
Tabell 1: HPLC skick i IAA och CK analys.
| Gardin gas (a.u.)* | 10 / 40 ** |
| Kollision gas (a.u.)* | 5 / 3 ** |
| Ion spray spänning (V) | 5500 |
| Temperatur (ºC) | 600 |
| Ion källan gas 1 (a.u.)* | 30 |
| Ion källan gas 2 (a.u.)* | 40 / 80 ** |
| Upplösning | Enhet |
Tabell 2: parametrar för ion källkodspaketet. * godtyckliga enheter. ** IAA analys/CK analys. Den här tabellen har ändrats från Koike o.a. 9
| Q1 (m/z) | Q3 (m/z) | Declustering potential (V) | Ingången potentiella (V) | Kollision energi (V) | |
| IAA | 176 | 130 | 26 | 6.5 | 21 |
| d5-IAA | 181 | 134 | 36 | 4.0 | 23 |
| tZ | 220 | 136 | 36 | 5.0 | 23 |
| d5- tZ | 225 | 137 | 31 | 5.0 | 21 |
| tZR | 352 | 220 | 41 | 5.5 | 23 |
| d5- tZR | 357 | 225 | 51 | 5.0 | 21 |
| iP | 204 | 136 | 31 | 9.0 | 19 |
| d6- iP | 210 | 137 | 31 | 5.5 | 21 |
| immateriella rättigheter | 336 | 204 | 31 | 5.0 | 21 |
| d6- iPR | 342 | 210 | 36 | 5.5 | 21 |
Tabell 3: MRM övergångar av IAA och CKs i LC-MS/MS analys. Den här tabellen har ändrats från Koike o.a. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att identifiera fördelningen av fytohormoner inblandade i organogenesen, det är viktigt att använda växtmaterial som organogenesen kan observeras på phytohormone-fri medium, eftersom när fytohormoner exogent tillämpas på bladsticklingar för att inducera skott eller rötter, de påverkar den hela explant, vilket gör det svårt att utvärdera inneboende plasticitet av växter i celldifferentiering och organogenes. Oavsiktlig skott kan induceras på phytohormone-fri kultur media i andra växtarter såsom Dianthus caryophyllus L.11, Aegle marmelos (L.) Corrêa12, Bacopa monnieri (L.) Pennell13, Celastrus paniculatus Willd. 14och Kalanchoë blossfeldiana Poelln. 15. det skulle vara möjligt att tillämpa protokollet i dessa växtarter.
Vi extraherade IAA, tZ, tZR, iP och iPR i acetonitril och renade dem genom fasta fasen extraktion. Den ursprungliga metoden använder tre typer av patron kolumner (HLB, MCX och svag anjon exchange (vax)) eftersom alla fytohormoner är renat (inklusive gibberellins, abscisic acid, jasmonic acid och salicylsyra)16. Kolumnen HLB använder en polymera omvänd-fas sorbent, kolumnen MCX använder samma med katjon-exchange grupper och kolumnen vax använder samma med svag anjon-exchange grupper. Den ursprungliga metoden eluerar CKs (basic) med 60 procent acetonitril som innehåller aqueous ammoniak på en MCX kolumnen i det andra steget, och sedan IAA (surt) med 80% acetonitril som innehåller 1% ättiksyra på en vax kolumn i det sista steget. Vårt fokus är auxin och CKs, som interagerar antagonistically för att reglera växt tillväxt17, använder förenklade protokollet endast HLB MCX kolumnerna och; IAA elueras med 30% acetonitril som innehåller 1% ättiksyra på HLB kolumn i det första steget. Det tar två dagar från provberedning LC-MS/MS-analys.
Acetonitril lösningsmedel bör inte tillåtas att torka ut under phytohormone reningen i kolumnerna patron. Om den gör Återsuspendera provet i acetonitril att förhindra att fytohormoner blir fastnat på glasröret och förlorade från provet. I detta protokoll, detektionsgränsen med ion-fällan MS system är ~ 10 pg för IAA och CKs från 10-30 mg färsk vävnader. För att analysera mindre belopp, skulle det vara nödvändigt att samla mycket mer prov eller använda MS med högre känslighet.
Phytohormone analys är en viktig teknik för utvärdering av växternas tillväxt och utveckling. Med den här metoden, skulle vi kunna bestämma tidpunkten för auxin och CK behandlingen för oavsiktlig shoot i växtarter där villkoret optimal kultur är fortfarande okänd. Som phytohormone kvantifiering blir allt viktigare, kommer det LC-MS/MS-protokollet som beskrivs här aktivera analysen av små prover med hög känslighet och upplösning. Vår förenkling av en tidigare metod kommer att underlätta rening och analys, och ta hög mångsidighet och reproducerbarhet. I framtiden kan denna metod tillämpas för att undersöka dynamiken i den endogena auxin och CK under organogenes hos andra växtarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi är tacksamma att Mr Akira Murakami av Institutionen för tillämpade biovetenskaper, Toyo universitet och Mr Koudai Taniguchi på Gunma jordbruks Technology Center för deras tekniskt bistånd. Vi är också tacksamma att Professor Shosaku Kashiwada och Dr Uma Maheswari Rajagopalan, Toyo universitet för deras förslag. Denna studie var stöds delvis av Research Center for Life och miljövetenskap, Toyo universitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13x100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
- Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
- Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
- Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).
- Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
- Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).
- Bajaj, Y. P. S. Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).
- Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
- Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
- Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
- Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
- Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
- Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
- Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
- Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
- Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).
