Summary
Brotes adventicios pueden ser inducidas en los segmentos internodales de Ipecacuana sin tratamiento de fitohormonas. Para evaluar la dinámica de la fitohormona durante la formación de brotes adventicios, medimos endógeno auxina y citocinina en segmentos internodales por LC-MS/MS.
Abstract
Formación de brotes adventicios es una técnica importante para la propagación de cultivos de importancia económica y para la regeneración de plantas transgénicas. Tratamiento de fitohormonas se requiere para la inducción de brotes adventicios en la mayoría de las especies. Si se pueden inducir brotes adventicios se determina por el balance entre auxinas y citoquininas (CK) niveles. Mucho esfuerzo se va a determinar concentraciones óptimas y combinaciones de fitohormonas en cada tejido utilizado como explantes y en cada especie de planta. En jarabe de Ipecacuana, sin embargo, brotes adventicios se pueden inducir en los segmentos internodales en medio de cultivo sin tratamiento de fitohormonas. Esto permite la plasticidad inherente del jarabe de ipecacuana para la diferenciación de la célula ser evaluados. Para inducir brotes adventicios en el jarabe de Ipecacuana, nos cultiva segmentos internodales a 24 ° C con 15 μmol m−2 s−1 de la luz en un ciclo oscuro de 14 h luz/10-h en medio de B5 sin fitohormonas solidificado con la goma de gellan 0.2% durante 5 semanas. Para investigar la dinámica de la fitohormona durante la formación de brotes adventicios, medimos endógeno ácido indol-3-acético y CKs en los segmentos por líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas LC-MS/MS. Este método permite el análisis de ácido indol-3-acético endógeno y CKs de una manera sencilla. Puede ser aplicado para investigar la dinámica de la auxina endógena y CK durante la organogénesis en otras especies vegetales.
Introduction
Gottlieb Haberlandt (1854-1945) propuso el concepto de "totipotencia", por que las plantas las células pueden dividir, diferenciar y regenerar plantas enteras incluso después de su previa diferenciación en tipos celulares específicos en plantas maduras1. En cultivo de tejidos, si la regeneración de plantas puede ser inducida o no se determina por la combinación y concentración de fitohormonas exógeno aplicados en el medio de crecimiento. Skoog y Miller encontraron que se podían inducir brotes adventicios de callo de tabaco en el medio de cultivo que contiene una alta proporción de CKs a auxinas, mientras que se podían inducir raíces adventicias en medio que contiene una proporción baja de2. Desde aquel hallazgo, cultivo de tejidos ha sido ampliamente utilizado para la propagación de cultivos de importancia económica y para la regeneración de plantas transgénicas3. Pueden inducir brotes adventicios de tejidos que no sean de meristemo apical de brote, como hojas, raíces y entrenudos. Se requiere para la inducción de brotes adventicios en la mayoría de especies de plantas tratamiento de fitohormonas. Sin embargo, las concentraciones óptimas y combinaciones diferencian por especie y tejido utilizado como explantes. Por lo tanto, mucho esfuerzo va a determinar las concentraciones óptimas y combinaciones de fitohormonas para experimentos.
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (Ipecacuana) es una planta medicinal que contiene alcaloides como la emetina y la cefalina, principalmente en las raíces4. Extractos de la raíz se utilizan como expectorante, emético y un amoebicide5. Aunque Ipecacuana crece naturalmente en las selvas tropicales de Brasil, es reacio a establecer las semillas en la cultura, y la tasa de germinación disminuye durante el almacenamiento de la semilla en Japón, con su frío clima6. En cambio, se propaga por cultivo de tejidos, en adventicias que dispara la formación de entrenudos es el método más eficiente7,8. Curiosamente, se pueden inducir brotes adventicios en esta especie sin fitohormonas tratamiento8.
Brotes adventicios se forman en la epidermis de la región apical de los segmentos internodales sin callusing, pero no en la región basal9. Esta diferencia indica polaridad de tejido en los segmentos internodales, que es probablemente bajo Reglamento fitohormonal. El sistema de cultivo de jarabe de Ipecacuana permite una oportunidad única para analizar cambios en los niveles de fitohormonas endógenas durante la formación de brotes adventicios. Aquí presentamos nuestro método para el análisis de los niveles endógenos de una auxina (ácido indol-3-acético (AIA)) y cuatro CKs (isopentenyl adenina (iP), isopentenyl adenina riboside (iPR), trans-zeatina (tZ) y trans-riboside zeatina (tZR)) en los segmentos internodales mediante LC-MS/MS.
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Protocol
Nota: Jarabe de Ipecacuana (C. ipecacuanha) fue utilizado en este estudio porque facilita el análisis de fitohormonas endógenas.
1. crecimiento condiciones para inducir brotes adventicios de Ipecacuana
- Preparar medio de B5 sin phytohormone ajustado a pH 5.710y agregar 0.2% la goma de gellan. Esterilice en autoclave.
- Vierta 25 mL del medio esterilizado en una placa Petri estéril (90 mm × 20 mm).
- Corte 8 mm segmentos internodales de plántulas de ipecac usando un bisturí con hoja nº 22 en una placa de acrílico estéril y colocar en el medio (figura 1).
- Cultura en medio de B5 sin fitohormonas a 24 ° C con 15 μmol m−2 s−1 de la luz en un ciclo oscuro de 14 h luz/10-h por 5 semanas.
- Identificar las regiones que (apical) a IV (basal) en cada segmento (figura 1B). Contar el número de brotes adventicios > 0,3 mm de longitud en cada región bajo un microscopio una vez por semana.
2. extracción y purificación de fitohormonas
- Poner un grano de circonio de 5 mm en cada uno de los cuatro tubos de 2 mL de muestra.
- Cortar los segmentos de las regiones I a IV (cada 2 mm de longitud) con un bisturí en una placa de acrílico estéril.
- Recoger ocho segmentos de cada región en tubos de muestras separadas (10-30 mg de peso fresco).
- Pesan y luego congelar las muestras en nitrógeno líquido.
- Triturar las muestras congeladas utilizando un homogeneizador basado en grano.
- Suspender las muestras machacadas en acetonitrilo 1 mL que contiene 500 pg de cada estándar interno de Auxina y CKs (d5-IAA d5- tZ, d5- tZR, d6- iP, d6- derechos de propiedad intelectual) usando un mezclador de tipo vórtex.
- Mantener a 4 ° C por 1 h, luego centrifugar a 3.500 × g por 5 min a temperatura ambiente.
- Lavar el precipitado en 80% (v/v) de acetonitrilo que contenga ácido acético al 1% (v/v). Centrifugar nuevamente a 3.500 × g por 5 min a temperatura ambiente. Combinar los sobrenadantes (de pasos 2.7 y 2.8) en un tubo de vidrio desechable.
- Añadir 600 μl que contiene ácido acético al 1% (v/v) a cada sobrenadante combinado de agua y evaporar el acetonitrilo utilizando un concentrador de vacío.
- Equilibrar hidrofílico-lipofílico-equilibrado cartuchos de columna (HLB) mediante la aplicación de 1 mL de acetonitrilo, metanol y agua que contiene ácido acético al 1% (v/v).
- Aplique una solución de la muestra por medio cartucho HLB.
- Lavar los cartuchos con 1 mL de agua que contiene ácido acético al 1% (v/v).
- Responsables todas las hormonas con acetonitrilo de 80% (v/v) de 2 mL que contiene ácido acético al 1% (v/v) en un tubo de vidrio.
- Evaporar el acetonitrilo en el efluente para obtener el extracto en agua que contiene ácido acético al 1% (v/v) utilizando un concentrador de vacío.
Nota: No esta seco completamente. - Equilibre los cartuchos de columna de modo mixto, fuerte intercambio catiónico (MCX) mediante la aplicación de 1 mL de metanol, acetonitrilo 1 mL, 0,5 mL 0.1 M de HCl y 1 mL de agua que contiene ácido acético al 1% (v/v).
- Aplique una solución de la muestra por medio cartucho MCX.
- Lavar los cartuchos con 1 mL de agua que contiene ácido acético al 1% (v/v).
- Eluir IAA con acetonitrilo del de 30% (v/v) de 2 mL que contiene ácido acético al 1% (v/v) en un tubo de vidrio.
- Lavar los cartuchos con acetonitrilo de 80% (v/v) de 2 mL que contiene ácido acético al 1% (v/v).
- Lavar los cartuchos con 2 mL de agua y 1 mL de agua con amoniaco acuosa 5%.
- Eluir el CKs con acetonitrilo del de 60% (v/v) de 2 mL que contiene 5% de amoníaco acuoso en un tubo de vidrio.
- Evaporar el solvente de cada fracción de la hormona mediante un concentrador de vacío y almacenar a −30 ° C hasta el análisis de LC-MS/MS.
3. LC-MS/MS análisis de IAA y CKs
- Disolver el extracto de cada hormona en un tubo con 600 μl de metanol y transferir la solución a un frasco de recuperación total del cuello de tornillo. Evaporar el disolvente utilizando un concentrador de vacío.
- Disolver la fracción de IAA en 20 μL 30% (v/v) acetonitrilo y las fracciones CK en 20 μl de agua que contiene ácido acético al 1% (v/v) en viales de tornillo cuello recuperación total.
- Analizar las muestras en el modo de iones positivos en un sistema de MS triple cuadrupolo equipado con un sistema HPLC.
Nota: Hemos creado las condiciones HPLC como se indica en la tabla 1.- Para la elución de la IAA, utilizar un gradiente binario de 5% - 50% de disolvente B sobre 7 minutos, luego aumentar por 98% solvente B durante 1 min y luego equilibre durante 2 min a 5% disolvente B por inyección de nido.
- Para la elución de CK, utilizar un gradiente binario de 2% - 40% disolvente B sobre 5 minutos, 40% - 70% de disolvente B en 7 minutos, luego aumentar al 95% solvente B durante 1 min y luego equilibre durante 2 min a 2% solvente B por inyección de nido.
- Establecer la ionización por electrospray (ESI)-MS los parámetros de la fuente de iones que se enumeran en la tabla 2.
- Utilizar la reacción múltiple control de transición (MRM) para la cuantificación de cada analito que se enumeran en la tabla 3.
- Cuantificar los niveles endógenos de IAA y CK contra una curva estándar de la proporción de a los estándares marcados con deuterio.
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Representative Results
En la 1 semana dest , no habían formado brotes adventicios. En la semana 2nd , aparecieron pequeños brotes. En el 3rd y 4 semanas demayo , el número de brotes mayor sobre todo en las regiones apicales (I y II) (figura 2A). Enla semana 5, el número de brotes fue aproximadamente 7 en región I y 5 en la región II (figura 2B). En cambio, sólo unos pocos brotes se formaron en las regiones III y IV.
Antes de la cultura, el nivel de IAA fue ligeramente superior en la región I (4.1 pg/mg, peso fresco (PF)) que en las regiones II a IV (~ 2,5 pg/mg FW; Figura 3). En la 1 semana dest , el nivel de IAA aumentado grandemente en la IV región (11,4 FW pg/mg) y disminuyó levemente en las regiones I a III (1.5-2.2 pg/mg FW). En la semana 2nd , la IAA en la IV región descendió a ~ 4,4 pg/mg FW, lo que indica que la acumulación de IAA en la región basal fue transitoria. Por 5 semanas de la cultura, un gradiente de la concentración de IAA emergió, con niveles de aumento de región a región IV.
Antes de la cultura, había solamente niveles traza de mayoría CKs (figura 3). En la 1 semana dest , el nivel de tZR aumentado 13.8 pg/mg FW en región II y 18,1 pg/mg FW en la región III. Entonces, los niveles disminuyeron gradualmente durante 5 semanas de la cultura. Por otro lado, los niveles de tZ, propiedad intelectual y derechos de propiedad intelectual cambiaron poco en cultura.
Figura 1 : Preparación de jarabe de ipecacuana para la formación de brotes adventicios. (A) un segmento internodal (8 mm de largo) se corta de ipecac regenerada en una mesa de trabajo limpia. (B) el primer entrenudo fue utilizado para la formación de brotes adventicios. Segmentos (C) se cultivan en medio de B5 sin fitohormonas de 25 mL en cajas Petri para inducir brotes adventicios. Barra de escala = 1 cm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Distribución de adventicio brotes formado en un segmento internodal. (A) brotes adventicios formados después de 0 a 5 semanas de la cultura. Barra de escala = 5 mm. (B) los segmentos fueron repartidos en cuatro regiones (I-IV), y se contó el número de brotes adventicios en cada región en la semana 5. Los datos son medios ± SEM (n = 3). En cada experimento se utilizaron diez segmentos. N.F. = no encontrado. Esta figura ha sido modificada desde Koike et al. 9 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis de evolución temporal de los niveles de fitohormonas en segmentos internodales. Los segmentos fueron separados en cuatro regiones (I-IV). Por LC-MS/MS se cuantificaron endógena IAA y CKs (tZ, tZR, propiedad intelectual y derechos de propiedad intelectual) en cada región. Porque eran muy bajos niveles de propiedad intelectual y derechos de propiedad intelectual, fue insertado un gráfico ampliado dentro de la misma gráfica. Los datos son medios ± SEM (n = 3). En cada experimento se utilizaron ocho segmentos. Esta figura ha sido modificada desde Koike et al. 9 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Columna | IAA: ACQUITY BEH C18 φ2.1 × 100 1.7 μm |
| CKs: Poroshell CE-C18 φ2.1 × 50 2,7 μm | |
| Temperatura | 40 º C |
| Fase móvil | Solvente A: agua destilada agua + ácido acético 0.05% |
| Solvente B: acetonitrilo + 0.05% de ácido acético | |
| Tasa de flujo | 0,35 ml/min |
| Volumen de inyección | 18 μL |
Tabla 1: Condiciones HPLC en análisis de IAA y CK.
| Gas de la cortina (a.u.)* | 10 / 40 ** |
| Gas de colisión (a.u.)* | 5 / 3 ** |
| Voltaje de spray ion (V) | 5500 |
| Temperatura (º c) | 600 |
| Gas de la fuente de iones 1 (a.u.)* | 30 |
| Gas fuente de ion 2 (a.u.)* | 40 / 80 ** |
| Resolución | Unidad |
Tabla 2: parámetros de fuente de ion. * unidades arbitrarias. ** Análisis de análisis/CK IAA. Esta tabla ha sido modificada de Koike et al. 9
| Q1 (m/z) | P3 (m/z) | Desclusterización potencial (V) | Entrada potencial (V) | Energía de la colisión (V) | |
| IAA | 176 | 130 | 26 | 6.5 | 21 |
| d5-IAA | 181 | 134 | 36 | 4.0 | 23 |
| tZ | 220 | 136 | 36 | 5.0 | 23 |
| d5- tZ | 225 | 137 | 31 | 5.0 | 21 |
| tZR | 352 | 220 | 41 | 5.5 | 23 |
| d5- tZR | 357 | 225 | 51 | 5.0 | 21 |
| iP | 204 | 136 | 31 | 9.0 | 19 |
| d6- iP | 210 | 137 | 31 | 5.5 | 21 |
| derechos de propiedad intelectual | 336 | 204 | 31 | 5.0 | 21 |
| d6- derechos de propiedad intelectual | 342 | 210 | 36 | 5.5 | 21 |
Tabla 3: transiciones de MRM de IAA y CKs en LC-MS/MS análisis. Esta tabla ha sido modificada de Koike et al. 9
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Discussion
Para identificar la distribución de fitohormonas en la organogénesis, es importante utilizar materiales de la planta en la que puede observarse en medio libre de fitohormonas, organogénesis porque cuando fitohormonas exógeno se aplican a los explantes para la inducción de brotes o raíces, afectan el explante entero, lo que hace difícil evaluar la plasticidad inherente de las plantas en la diferenciación celular y organogénesis. Brotes adventicios pueden ser inducidos en medios de cultivo libres de fitohormonas en otras especies vegetales como Dianthus caryophyllus L.11, Corrêa Aegle marmelos (L.)12, Pennell de Bacopa monnieri (L.)13, Celastrus Piaropus Willd. 14y Kalanchoë blossfeldiana Poelln. 15. es posible aplicar el protocolo en estas especies.
Se extrajeron IAA, tZ, tZR, propiedad intelectual y derechos de propiedad intelectual en acetonitrilo y había purificado por extracción en fase sólida. El método original utiliza tres tipos de columnas de cartucho (HLB, MCX y el intercambio de aniones débilmente (cera)) porque todos fitohormonas son purificados (incluyendo giberelinas, ácido abscísico, ácido jasmónico y ácido salicílico)16. La columna HLB utiliza una fase inversa polimérica absorbente, la columna MCX utiliza el mismo con los grupos de intercambio catiónico y la columna de cera utiliza el mismo con los grupos de intercambio aniónico débil. El método original elutes CKs (básicos) con 60% de acetonitrilo que contenga amoníaco acuoso en una columna MCX en el segundo paso y luego IAA (ácido) con 80% de acetonitrilo que contenga ácido acético al 1% en una columna de cera en el último paso. Como nuestro enfoque es auxina y CKs, que interactúan antagónicamente a regular crecimiento de planta17, el protocolo simplificado utiliza sólo las columnas HLB y MCX; IAA es eluted con 30% de acetonitrilo que contenga ácido acético al 1% en la columna HLB en el primer paso. Toma dos días de preparación de muestras para el análisis por LC-MS/MS.
El disolvente acetonitrilo no deben secarse durante la purificación de la fitohormona en las columnas de cartucho. Si es así, vuelva a suspender la muestra en acetonitrilo para evitar que las fitohormonas pegado al tubo de vidrio y perdido de la muestra. En el presente Protocolo, el límite de detección con el sistema de MS trampa de iones es ~ 10 pg de IAA y CKs de tejidos frescos 10-30 mg. Para analizar cantidades más pequeñas, sería necesario muestra mucho más de recoger o utilizar MS con mayor sensibilidad.
Análisis de fitohormonas es una técnica importante para la evaluación del desarrollo y crecimiento de las plantas. Usando este método, seamos capaces de determinar el tiempo de Auxina y tratamiento de CK para la formación de brotes adventicios en especies de plantas donde se desconoce la condición óptima de la cultura. Como cuantificación de la fitohormona se convierte cada vez más importante, el protocolo de LC-MS/MS descrito aquí permitirá el análisis de muestras pequeñas con alta sensibilidad y resolución. La simplificación de un método anterior facilitará la purificación y análisis y traer la reproducibilidad y alta versatilidad. En el futuro, este método puede ser aplicado para investigar la dinámica de la auxina endógena y de CK durante la organogénesis en otras especies vegetales.
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Disclosures
Los autores declaran que tienen no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos al Sr. Akira Murakami del Departamento de Biociencias Aplicadas, la Universidad de Toyo y el Sr. Koudai Taniguchi del centro de tecnología agrícola de Gunma su asistencia técnica. Agradecemos también al profesor Shosaku Kashiwada y Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Universidad de Toyo por sus sugerencias. Este estudio fue apoyado en parte por el centro de investigación para la vida y ciencias ambientales, Universidad de Toyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13x100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
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