Summary
无激素治疗的催吐剂茎段可诱发不定芽。为了评价不定芽形成过程中的激素动态, 我们用 LC-ms/ms 测定了茎段内源性生长素和细胞分裂素。
Abstract
不定芽形成是重要的技术, 对重要作物的繁殖和转基因植物的再生。在大多数物种中诱导不定芽需要激素治疗。不定芽能否诱发是由生长素与细胞分裂素 (CK) 水平的平衡决定的。大量的努力, 以确定最佳的浓度和组合激素在每个组织作为外植体和在每个植物物种。在催吐剂中, 无激素处理可诱导培养基中茎段的不定芽。这使得催吐剂的内在可塑性可以被评估。为了诱导催吐剂中的不定芽, 我们在15µmol m−2 s−1的茎段中培养了24摄氏度, 在14小时 light/10-h 黑循环中, 在无激素 B5 培养基上固化0.2% 结冷胶胶5周。通过液相色谱-串联质谱 (LC ms) 测定了不定芽形成过程中的激素动态, 并对 indole-3-acetic 中的内源性酸和中正进行了检测。这种方法可以简单地分析内源性 indole-3-acetic 酸和中正水平。可用于研究其他植物器官中内源生长素和 CK 的动态变化。
Introduction
Haberlandt (1854-1945) 提出了 "全能" 的概念, 在成熟植物中, 植物细胞可以分化、分化和再生整个植物, 甚至在它们的前向特定细胞类型的差异1。在组织培养中, 能否诱导植物再生是由外部在生长培养基中应用激素的组合和浓度决定的。Skoog 和米勒发现, 在含有高中正比植物生长素的培养基上, 烟草愈伤组织可诱导不定芽, 而不定根可在含有低比值2 的培养基上诱导。自此发现以来, 组织培养已广泛用于经济重要作物的繁殖和转基因植物的再生3。不定芽可诱导从其他组织以外的茎尖分生, 如叶, 根, 和节间。在大多数植物中诱导不定芽需要激素治疗。然而, 最佳的浓度和组合不同的物种和组织之间作为外植体。因此, 大量的努力去确定激素的最佳浓度和组合的实验。
Carapichea ipecacuanha(Brot)l. 安德森 (催吐剂) 是一种药用植物, 含有吐根碱和 cephaeline 等生物碱, 主要在根4 中。根提取物用作祛痰、催吐剂和 amoebicide5。虽然催吐剂自然生长在巴西的热带雨林中, 但它不愿意在文化中设置种子, 在日本的种子储藏过程中, 发芽率下降, 气候较冷的6。相反, 它传播的组织培养, 在节间不定的拍摄形成是最有效的方法7,8。有趣的是, 不定芽可以诱导在这个物种没有激素治疗8。
不定芽形成于茎节顶端区域的表皮上, 不愈伤组织, 但不在基底区域9。这种差异表明茎段的组织极性, 这可能是在 phytohormonal 调节。催吐剂培养系统允许一个独特的机会来分析在不定芽形成期间内源激素水平的变化。在这里, 我们介绍了分析一个生长素 (indole-3-acetic 酸 (IAA)) 和四中正 (isopentenyl 腺嘌呤 (iP), isopentenyl 腺嘌呤核苷 (iPR),反式-玉米 () 和反式-玉米核苷 (tZR) 的内生水平的方法。在茎段中通过使用 LC/ms。
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Protocol
注: 本研究使用催吐剂 (ipecacuanha), 因为它有助于分析内源性激素。
1. 诱导催吐剂不定芽的生长条件
- 制备无激素的 B5 培养基, 调整为 pH 值为 5.710, 并添加0.2% 结冷胶胶。热处理消毒。
- 将25毫升的蒸压介质倒入无菌培养皿 (90 毫米 x 20 毫米)。
- 在不育的丙烯酸板上, 用一把22刀片的外科手术刀切开8毫米茎的催吐剂苗, 并放置在培养基上 (图 1)。
- 无激素 B5 培养基的培养在24摄氏度以下15µmol m−2 s−1的光在14小时 light/10-h 黑暗周期5周。
- 在每个段中标识区域 I (顶端) 到 IV (基底) (图 1B)。每周一次显微镜下计算每个区域中不定芽的数量 > 0.3 毫米长度。
2. 激素的提取和纯化
- 在四2毫升的样品管中放入5毫米氧化锆珠。
- 在不育的丙烯酸板上使用外科手术刀将片段切成区域 I 至 IV (每长度2毫米)。
- 收集八段的每个区域在不同的取样管 (10-30 毫克新鲜重量)。
- 称重, 然后冻结液氮中的样品。
- 用珠基均质机粉碎冷冻样品。
- 在1毫升乙腈中悬浮被粉碎的样品, 其中含有生长素和中正的每个内部标准的 500 pg (d5-IAA, d5-, d5-tZR, d6-iP, d6-知识产权) 使用涡旋混合器。
- 保持在4°c 为1小时, 然后离心机在 3500 x g在室温下5分钟。
- 在含有 1% (v/v) 乙酸的 80% (v/v) 乙腈中清洗颗粒。离心机再次在 3500 x g室温下5分钟。将上清液 (从步骤2.7 和 2.8) 组合在一次性玻璃管中。
- 添加600µL 含 1% (v/v) 乙酸的水, 每联合上清, 并蒸发的乙腈使用真空选矿厂。
- 平衡亲水性-亲脂平衡 (HLB) 柱筒, 适用于每乙腈, 甲醇和含 1% (钒/钒) 乙酸的水的1毫升。
- 每平衡 HLB 墨盒应用一个样本解决方案。
- 用含有 1% (v/v) 醋酸的1毫升水清洗墨盒。
- 洗脱所有激素与2毫升 80% (v/v) 乙腈含有 1% (v/v) 乙酸在玻璃管。
- 将洗脱液中的乙腈蒸发, 用真空浓缩器在含有 1% (v/v) 乙酸的水中获得萃取物。
注: 不要完全干燥。 - 平衡混合模式, 强阳离子交换 (MCX) 柱盒通过应用1毫升乙腈, 1 毫升甲醇, 0.5 毫升0.1 米 HCl, 和1毫升水含 1% (v/v) 乙酸。
- 每个平衡 MCX 墨盒应用一个示例解决方案。
- 用含有 1% (v/v) 醋酸的1毫升水清洗墨盒。
- 洗脱 IAA 与2毫升 30% (v/v) 乙腈含有 1% (v/v) 乙酸在玻璃管。
- 用2毫升 80% (v/v) 乙腈清洗墨盒, 含 1% (v/v) 乙酸。
- 用2毫升水和1毫升水清洗墨盒, 含5% 水氨。
- 洗脱中正与2毫升 60% (v/v) 乙腈含有5% 水氨的玻璃管。
- 使用真空浓缩器和存储在−30°c, 直到 LC-ms/毫秒分析, 蒸发每个荷尔蒙分数的溶剂。
3. IAA 和中正的 LC-ms/毫秒分析
- 将每个激素提取物溶解在600µL 甲醇的管中, 将溶液转移到螺钉颈部总回收瓶中。使用真空浓缩器蒸发溶剂。
- 将20µL 30% (v/v) 乙腈中的 IAA 分数和20µL 含 1% (v/v) 乙酸的 CK 分数溶解在螺钉颈总回收瓶中。
- 以高效液相色谱系统为例, 分析了三元四极 MS 系统正离子模式下的样品。
注意: 我们设置了表 1中列出的高效液相色谱条件。- 对于 IAA 洗脱, 使用 5%-50% 溶剂 b 的二进制梯度超过7分钟, 然后增加98% 溶剂 b 和保持1分钟, 然后平衡2分钟在5% 溶剂 b 通过巢注射。
- 对于 CK 洗脱, 使用 2%-40% 溶剂 b 的二进制梯度超过5分钟, 40%-70% 溶剂 b 在7分钟, 然后增加95% 溶剂 b 和举行1分钟, 然后平衡2分钟在2% 溶剂 b 通过巢注射。
- 设置离子源的电喷雾电离 (ESI)-MS 参数, 如表 2所示。
- 使用多重反应监测 (MRM) 转换来量化表 3中列出的每个分析物。
- 将内源 IAA 和 CK 水平与未标记比率与氘标记标准的标准曲线进行量化。
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Representative Results
在 1st周, 没有形成不定芽。在 2nd周, 出现了小芽。在 3rd和 4th周, 芽数增加主要在顶端区域 (I 和 II) (图 2A)。在 5th周, 芽的数量在区域 i 和 5 (图 2B) 中大约为7。相比之下, 第三和 iv. 区只形成了几枝芽。
在培养之前, IAA 水平略高在区域 I (4.1 pg/毫克, 新鲜的重量 (FW)) 比在区域 II IV (~ 2.5 pg/毫克固件;图 3)。在 1st周, IAA 水平在区域 IV (11.4 pg/mg fw) 中大大增加, 在区域 I III (1.5-2.2 pg/毫克固件) 中略有下降。在 2nd周, 区域 IV 中的 iaa 水平下降至4.4 页/毫克 FW, 表明在基底区域的 iaa 积累是瞬态的。经过5周的培养, IAA 浓度梯度出现, 从区域 I 到区域 iv 的水平增加。
在区域性之前, 只有大多数中正的跟踪级别 (图 3)。在 1st周, tZR 级别增加到第二个区域中的 13.8 pg/mg 固件, 以及第三区域的 18.1 pg/mg 固件。在5周的文化中, 水平逐渐下降。另一方面, 在文化背景下, "区域"、"知识产权" 和 "知识产权" 的水平只略有变化。
图 1: 不定射形成催吐剂的制备.(A) 茎段 (8 毫米长) 从干净的工作台上的再生催吐剂中切割。(B) 第一个节间用于不定射形成。(C) 在培养皿中培养25毫升无激素的 B5 培养基以诱导不定芽。刻度条 = 1 厘米.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 在茎段上形成的不定芽的分布.(A) 在0到5周的文化之后形成的不定芽。刻度条 = 5 毫米 (B) 段被分成四个区域 (I IV), 每个区域的不定芽数量在5周计数。数据是指电子扫描电镜 (n = 3)。在每个实验中使用了十段。N.F. = 未找到。此数字已从小池et . 中进行了修改。9请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 茎段中激素水平的时间过程分析.段分为四个区域 (IV.)。各区域内源 IAA 和中正 (tZR、iP 和知识产权) 均以 LC-ms/毫秒为量化。由于 iP 和知识产权级别非常低, 因此在同一图形中插入了一个放大的图形。数据是指电子扫描电镜 (n = 3)。在每个实验中使用了八段。此数字已从小池et . 中进行了修改。9请单击此处查看此图的较大版本.
| 列 | IAA: ACQUITY BEH C18 φ2.1×100 1.7 µm |
| 中正: Poroshell EC-C18 φ2.1×50 2.7 µm | |
| 温度 | 40ºc |
| 移动阶段 | 溶剂 A: 蒸馏水 + 0.05% 乙酸 |
| 溶剂乙: 乙腈 + 0.05% 乙酸 | |
| 流量 | 0.35 毫升/分 |
| 注塑量 | 18µl |
表 1: IAA 和 CK 分析中的 HPLC 条件。
| 窗帘气 (天文单位) * | 10/40 ** |
| 碰撞气体 (天文单位) * | 5/3 ** |
| 离子喷涂电压 (V) | 5500 |
| 温度 (ºC) | 600 |
| 离子源气体 1 (天文单位) * | 30 |
| 离子源气体 2 (天文单位) * | 40/80 ** |
| 决议 | 单位 |
表 2: 离子源的参数.* 任意单位。** IAA 分析/CK 分析。此表已从小池et . 中进行了修改。9
| Q1 (m/z) | Q3 (m/z) | 分割电位 (V) | 入口潜力 (V) | 碰撞能量 (V) | |
| iaa | 176 | 130 | 26 | 6。5 | 21 |
| d5-IAA | 181 | 134 | 36 | 4。0 | 23 |
| tz | 220 | 136 | 36 | 5。0 | 23 |
| d5- | 225 | 137 | 31 | 5。0 | 21 |
| tZR | 352 | 220 | 41 | 5。5 | 23 |
| d5-tZR | 357 | 225 | 51 | 5。0 | 21 |
| ip | 204 | 136 | 31 | 9。0 | 19 |
| d6-iP | 210 | 137 | 31 | 5。5 | 21 |
| 知识产权 | 336 | 204 | 31 | 5。0 | 21 |
| d6-知识产权 | 342 | 210 | 36 | 5。5 | 21 |
表 3: IAA 和中正在 LC/ms 分析中的 MRM 过渡.此表已从小池et . 中进行了修改。9
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Discussion
为了确定参与器官激素的分布, 重要的是使用植物材料在无激素培养基上观察器官, 因为当激素被外部应用于外植体诱导芽或根, 它们影响整个外植体, 使得很难评价植物的内在可塑性的细胞分化和器官。不定芽可诱导其他植物的无激素培养基 (如石竹石竹L.11、 Aegle marmelos (l.) Corrêa12、 Bacopa 床子(l.) Pennell13, 藤苋菜。14和Kalanchoë长寿Poelln。15. 有可能在这些植物物种中应用该议定书。
我们提取乙腈中的 IAA、tZR、iP 和知识产权, 并通过固相萃取纯化。原方法使用三种类型的墨盒柱 (HLB, MCX 和弱阴离子交换 (蜡)), 因为所有激素被纯化 (包括赤霉素, 脱落酸, 茉莉酸和水杨酸)16。HLB 柱使用聚合物反相吸附剂, MCX 柱使用相同的阳离子交换组, 蜡柱使用相同的弱阴离子交换组。原方法 elutes 中正 (基本) 与60% 乙腈含水氨在 MCX 柱第二步, 然后 IAA (酸性) 与80% 乙腈含1% 醋酸在蜡柱上的最后一步。由于我们的重点是生长素和中正, 它相互作用 antagonistically 调节植物生长17, 简化协议只使用 HLB 和 MCX 列;IAA 是洗脱与30% 乙腈含有1% 乙酸在 HLB 塔的第一步。从样品准备到 LC/ms 分析需要两天时间。
乙腈溶剂不应被允许在植物激素纯化的弹药筒柱上干燥。如果有, 并用重悬样品在乙腈, 以防止激素成为粘在玻璃管和丢失的样品。在该协议中, 离子阱 MS 系统的检测限为 IAA 和中正10-30 毫克新鲜组织的 10 pg。为了分析较小的数量, 需要收集更多的样本或使用更高灵敏度的 MS。
激素分析是评价植物生长发育的重要技术。利用这种方法, 我们可以确定植物生长素和 CK 治疗的时机, 在最适宜的培养条件尚不清楚的植株中, 不定芽的形成。随着激素量化变得越来越重要, 本文介绍的 LC ms/毫秒协议将使对小样本的分析具有高灵敏度和分辨率。我们以前的方法的简化将有助于净化和分析, 并带来了高通用性和重现性。在今后的研究中, 该方法可应用于其他植物种间生长素和 CK 的动态变化。
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Disclosures
作者声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢东洋大学应用生物科学系的 Koudai 先生和群马县农业技术中心谷口先生的技术援助。我们还感谢 Shosaku Kashiwada 教授和东洋大学 Maheswari Rajagopalan 博士的建议。这项研究由东洋大学生命与环境科学研究中心部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13x100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
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