Summary
Direkte neuronal omprogrammering genererer neuroner, der opretholder en alder af det udgangspunktet i somatiske celler. Her, beskriver vi en enkelt vektor-baseret metode til at generere induceret neuroner fra dermal fibroblaster fremstillet af voksne menneskelige donorer.
Abstract
Induceret neuroner (iNs), et produkt af somatiske celler direkte konverteret til neuroner, er en måde at få patienten-afledte neuroner fra væv, der er let tilgængelige. Gennem denne rute, kan modne neuroner opnås i løbet af et par uger. Her beskriver vi en enkel og hurtig et-trins protokol til at opnå iNs fra dermal fibroblaster opnået gennem biopsi prøverne fra voksne menneskelige donorer. Vi forklare hvert trin af processen, herunder opretholdelse af de dermal fibroblaster, indefrysning proceduren for at opbygge et lager af cellelinie, såning af celler for omprogrammering, samt dyrkningsbetingelserne under konverteringsprocessen. Derudover beskriver vi udarbejdelsen af glas coverslips for elektrofysiologiske optagelser, langsigtede belægning betingelser og fluorescens aktiveret celle sortering (FACS). Vi viser også eksempler på resultaterne, der forventes. Protokollen beskrevet her er let at udføre og kan blive anvendt til human fibroblaster stammer fra menneskelige hud biopsier fra patienter med forskellige forskellige diagnoser og aldre. Denne protokol genererer en tilstrækkelig mængde af iNs, som kan bruges til en bred vifte af biomedicinske programmer, herunder sygdom modellering, stof screening og target validering.
Introduction
Udvikling af effektive behandlinger for neurologiske lidelser har været hæmmet af den begrænsede adgang til levende menneskelige hjerneceller til at udføre Mekanistiske undersøgelser og funktionelle assays. Om et årti siden, denne situation radikalt ændret med udviklingen af induceret pluripotente stamceller (iPSCs) teknologi1,2. Dette, kombineret med en bedre forståelse af de neurale differentiering mekanismer opstår under normal menneskelig udvikling, har gjort det muligt for generation af definerede og forskelligartede neuronal undertyper fra patienten og sygdom specifikke materiale. Med sådant materiale er det nu muligt at studere intracellulære mekanismer neurologiske sygdomme og forskellige forbindelser potentiale til at afhjælpe de patologiske funktioner3.
Mens iPSCs har været revolutionerende inden for neuroscience, er en stor ulempe ved disse celler at deres aldrende signatur er slettet under omprogrammering processen på en sådan måde, at forynget neuron ikke bevarer den sårbarhed, der er forbundet med Aging4,5,6. Denne særlige funktion af de neuroner, der er produceret kan ende med at blive afgørende for recapitulating mange aspekter af den intracellulære patogene kaskade, især i tilfælde af sygdomme, alderdom er en vigtig risikofaktor.
Direkte neurale omprogrammering er en teknologi, hvor en somatisk celle omdannes direkte til en i uden at gå gennem en pluripotente mellemliggende fase. Dette giver mulighed for hurtige generation af menneskelige neuroner in vitro- der kan være både patienten og sygdom specifikke. En bemærkelsesværdig egenskab ved direkte omprogrammering er at cellen donor start år opretholdes, og med at, dens sårbarhed over for aldrende processer såsom øget produktion af oxidativt stress4,7. Som et resultat, iNs fra patienter med neurologiske sygdomme forbundet med aldring, såsom Alzheimers og Parkinsons sygdom, er velegnet til en bred vifte af biomedicinske programmer herunder sygdom modellering, stof screening-assays og toksikologiske undersøgelser .
Det vigtigste forbehold, der har forhindret iNs fra patienter med neurodegenerative sygdomme er udbredt er at de ikke er let at omprogrammere, og det bliver endnu sværere med udvidelse af fibroblaster. Generation af i celler i mængder, der kræves for disse typer af applikationer opnået som et resultat, ikke indtil for nylig8. Vi har nu udviklet en enkel metode til at omprogrammere fibroblaster fra donorer i alle aldre på en meget effektiv måde. Denne metode kombinerer den tvungne udtryk af neuronal transskriptionsfaktorer Ascl1 og Brn2 med et knockdown af repressor protein RE1-silencing transskription faktor (resten) ved hjælp af en enkelt vektor. Her, beskriver vi de forskellige trin, der fører til generation af iNs konverteret fra huden fibroblaster biopsi fra ældre donorer.
Protocol
Voksen dermal fibroblaster blev udvundet fra Parkinsons sygdom forskning og Huntington's chorea klinikker på John van Geest centrum for hjernen reparation (Cambridge, England) og anvendt under lokale etiske godkendelse (REC 09/H0311/88). For detaljer om huden biopsi udtagning, se reference8.
1. forberedelse af huden fibroblaster for omprogrammering
- Ved hjælp af en automatiseret celle optøning system eller et 37 ° C vandbad, tø de voksne human dermal fibroblaster (aHDFs) og plade 200.000 pr. T75 kolbe (tæller med en automatiseret celle counter) i 10 mL af fibroblast medium (Se tabel 1) ved 37 ° C i 5% CO2.
- Udføre en komplet medium forandring med fibroblast medium den næste dag.
- Ændre fibroblast medium hver 3-4 dage, indtil cellerne nå 95% confluency.
Bemærk: En sammenflydende kolben vil indeholde cirka 1.000.000 celler. AHDFs kan fryses for at opbygge et lager af cellelinje (afsnit 2) eller direkte re forgyldt klar til omprogrammering (afsnit 3).
2. indefrysningen af huden fibroblaster
- Placer en kontrollerede-rate indefrysning beholder i en kasse med is eller i køleskab ved 4 ° C.
- Adskille celler med 0,05% trypsin (1,5 mL pr. T75 kolbe) ved 37 ° C i 3-5 min.
- Tilføje fibroblast medium (indeholdende føtal bovint serum (FBS)) for at neutralisere trypsin (3 mL pr flush pr. T75 kolbe) og indsamle de fritliggende celler i en 15 mL tube ved udskylning celler i kolben to gange.
- Tælle celler ved hjælp af automatiserede celle counter; (anbefalede) fryse cirka 500.000 aHDFs pr. hætteglas.
- Spin ned celler ved 400 x g i 5 min.
- Celle resuspenderes i 1 mL af indefrysning medium (Se tabel 1) og overførsel til kryogene røret. Sted rør direkte i kontrollerede-rate indefrysning containeren.
- Gemme den kontrolleret hastighed frysning apparater ved-80 ° C natten over. Den følgende dag, overføre rør til en-140 ° C fryser og gemme indtil det skal bruges.
3. plating for omprogrammering (dag 1)
Bemærk: Det anbefales at bruge en gelatine belægning for kort sigt eksperimenter (op til 30 dage); Alternativt, for langsigtet eksperimenter er det anbefales at starte på en poly-L-ornithin, fibronektin og laminin (PFL) belægning.
- 60 min. før plating aHDFs for omprogrammering, pels en 24-godt plade med 0,1% gelatine (250 µL/brønd) og inkuberes ved 37 ° C.
- Opsug fibroblast mediet på aHDFs. Vask en gang med DPBS. Adskille celler med 0,05% trypsin (1,5 mL pr. T75 kolbe) ved 37 ° C i 3-5 min.
- Tilføje fibroblast medium for at neutralisere trypsin (3 mL pr flush pr. T75 kolbe) og indsamle de fritliggende celler i en 15 mL tube ved udskylning celler i kolben to gange.
- Spin ned celler ved 400 x g i 5 min. Fjern supernatanten, og celle resuspenderes i 1 mL af fibroblast medium.
- Tælle celler ved hjælp af en automatiseret celle tæller (for at sikre en god kvalitet konvertering kontrollere, at cellernes levedygtighed over 90% med trypan blå farvning).
- For en komplet 24-godt plade, der forberedes en suspension af 1,320,000 celler i 13,2 mL af fibroblast medium til at opnå en suspension af 100.000 celler/mL medium (eller 55.000 celler/brønd i 550 µL af fibroblast medium ganget med antallet af brønde behov).
- Opsug gelatine fra pladen og vaskes to gange med DPBS. Tilsæt 500 µL af cellesuspension til hver brønd og Inkuber natten over ved 37 ° C i 5% CO2.
4. viral transduktion (dag 0)
Bemærk: Arbejde med lentiviral partikler kræver kategori 2 udstyr og brug af en agent til at neutralisere virus. Iført dobbelt par handsker er også stærkt anbefales.
- Varm op 13,2 mL fibroblast medium til 37 ° C.
- Optø lentiviral vektor indeholdende transkriptionsfaktorer Ascl1 og Brn2 med to korte hårnål RNA'er (shRNA) rettet mod resten ved stuetemperatur.
Bemærk: Se du henviser til8; konstruktionen er tilgængelig i en plasmid repository. For detaljer om proceduren til at producere lentiviruses henvises til reference9. - Tilføje den nødvendige mængde af lentivirus at inficere aHDFs på mangfoldighed af infektion (MOI) 20 til medium uden nogen transduktion smagsforstærkere.
- Erstatte medium i 24-godt plade med fibroblast medium indeholdende den lentiviral vektor (500 µL/brønd) og der inkuberes natten over ved 37 ° C i 5% CO2.
- Den næste dag, erstatte medium i brøndene med friske fibroblast medium uden den lentiviral vektor.
Bemærk: Medium betragtes infektiøs i 7 dage og som sådan tilstrækkelig beskyttelse og håndteringsprocedurerne skal bruges under den første uge efter viral transduktion.
5. vedligeholdelse af konvertere celler
Bemærk: Når konvertering begynder celler er modtagelige for løft; sørge for at aflæsse pladen og bruge 1.000 µL pipette når at fjerne medier at undgå celler afmontering.
- På dag 3, fjerne fibroblast medium og tilsættes 500 µL af tidlige neuronal konvertering medium (Se tabel 1).
- To til tre gange om ugen, tage ud af 225 µL af gamle medium fra brønden og tilføje i 250 µL af frisk tidlige neuronal konvertering medium.
- På dag 18, fjerne alle medium fra hver brønd og erstatte med 500 µL af sene neuronal konvertering medium (Se tabel 1).
- Fortsætte med at ændre halvdelen af medium som ovenfor med sene neuronal konvertering medium hver 2-3 dage indtil dag 25 eller eksperiment slutpunkt (figur 1A).
Bemærk: Hvis celler ikke er belagt i hver brønd for eksperimentet, fyld tomme brønde med PBS eller vand for at forhindre overt fordampning af medium og minimere variationen mellem brønde.
| Stock koncentration | Arbejder koncentration | |
| Fibroblast medium | ||
| Basal medium | NIELSEN | NIELSEN |
| Penicillin/Streptomycin | 10.000 U/mL | 100 mg/mL |
| FBS | NIELSEN | 10% |
| Frysning medium | ||
| Fibroblast medium | NIELSEN | 45% |
| FBS | NIELSEN | 45% |
| DMSO | NIELSEN | 10% |
| Tidlig neuronal konvertering medium (ENM) | ||
| Neurale differentiering medium | NIELSEN | NIELSEN |
| Penicillin/Streptomycin | 10.000 U/mL | 100 mg/mL |
| CHIR99021 | 10 mM | 2 ΜM |
| SB-431542 | 20 mM | 10 ΜM |
| Noggin | 100 µg/mL | 0,5 µg/mL |
| LDN-1931189 | 10 mM | 0,5 ΜM |
| VPA | 1 M | 1 mM |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 ΜM |
| GDNF | 20 µg/mL | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 µg/mL | 10 ng/µL |
| DB-cAMP | 50 mM | 0,5 mM |
| Sen neuronal konvertering medium (LNM) | ||
| Neurale differentiering medium | NIELSEN | NIELSEN |
| Penicillin/Streptomycin | 10.000 U/mL | 100 mg/mL |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 ΜM |
| GDNF | 20 µg/mL | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 µg/mL | 10 ng/µL |
| DB-cAMP | 50 mM | 0,5 mM |
| FACS Buffer | ||
| HBSS 1 x [- calcium, -magnesium, - phenol red] | NIELSEN | NIELSEN |
| BSA | NIELSEN | 1% |
| DNAase | NIELSEN | 0,05% |
Tabel 1: sammensætningen af de forskellige medier bruges. Fuld beskrivelse af sammensætningen for alle medier i denne protokol, herunder fibroblast medium, frysning medium, tidlig neuronal konvertering medium, sent neuronal konvertering medium og FACS buffer.
6. glas Coverslips for elektrofysiologiske optagelser
Bemærk: Det anbefales at bære en laboratoriekittel, beskyttelsesbriller, dobbelt handsker og udfylde alle arbejde i et stinkskab. Denne protokol er tilpasset fra 10.
- Placer glas coverslips i bunden af et glasfad uden overlapning.
- Tilføje generelle lab rengøring vaskemiddel for at oversvømme alle coverslips uden at risikere overløb under omrystning (ca. 30 mL). Sted på en orbitalryster med langsom hastighed for 2 h.
- Vask seks gange (30 min) med autoklaveres deioniseret vand.
- Tilføje 95% ethanol i 2 timer.
- Fjerne ethanolen og vente, indtil coverslips er tør.
- Når tør, overføre coverslips i et glas bægerglas og tilføje 70% salpetersyre, indtil coverslips er neddykket.
- Bægerglasset glas i en sonikator bad til 60 min.
- Fjerne salpetersyre og vaskes tre gange med autoklaveres deioniseret vand.
Forsigtig: Altid tilføje syre til vand, aldrig anden vej rundt, da dette kan føre til en voldsom reaktion. - Fjern så meget vand fra bægerglas som muligt og tilsæt koncentreret saltsyre (HCI), indtil coverslips er neddykket; Swirl bægerglas og dækkes med paraffin film.
- Rens med ultralyd i 60 min (50 – 60 Hz, 30 W).
- Fjern så meget HCI fra coverslips som muligt og sted i en passende affald placering. Skyl med autoklaveres deioniseret vand to gange.
- Tag coverslips ud af hætten og skyl 20 gange (eller mere) med autoklaveres deioniseret vand, indtil alle HCI er fjernet.
- Når tør, placere coverslips i sterilt 24-godt plader.
- Læg pladerne under ultraviolet (UV) lys natten over. Den næste dag coverslips er klar til brug.
Bemærk: Hvis glas coverslips, der bruges, er det anbefales at bruge PFL belægning. Simpelthen placere én coverslip i hver brønd med en 24-godt plade (ved hjælp af steril pincet) og følge protokollen som nedenfor.
7. PFL belægning for langsigtet kultur
- Pels 24-godt plade med poly-L-ornithin (500 µL/brønd) og efterlade natten over ved 37 ° C i 5% CO2.
- Opsug poly-L-ornithin og vente, indtil det er tørt nok til form dråber på toppen.
- Gøre en dråbe (ca. 60 µL) laminin i midten af hver godt og spredt til at omfatte hele overfladen af coverslip. Lad for 2 h 45 min ved 37 ° C i 5% CO2.
- Vaskes tre gange med DPBS.
- Tilføje fibronektin (500 µL/brønd) og efterlade natten over ved 37 ° C i 5% CO2.
- Vask en gang med DPBS før du tilføjer celler.
Bemærk: PFL belægning kan bruges til lang sigt kulturer af iNs (over 100 dage), selv om progressiv celledød er kan forventes fra dag 30.
8. FACS
Bemærk: Re plade cellerne efter FACS sortering udarbejder en PFL-belagt plade 48 timer i forvejen. Celler kan sorteres ved hjælp af en neurale celle vedhæftning molekyle (NCAM) antistof fra dag 20 og fremefter efter transduktion.
- Fjerne medier med en 1.000 µL pipette (ikke vaskes for at undgå celler afmontering).
- Tilføje celle miljøomkostningerne agent (250 µL/brønd), forlader i 10 – 20 min indtil celler lift og float som enkelt celler.
- I løbet af denne tid forberede FACS buffer.
- Hakkede forsigtigt med en 1.000 µL pipette. Hvis nogle klumper tilbage, inkuberes en lille smule længere.
- Når en enkelt cellesuspension er opnået, fjerne den fra brønden og placere i en 1,5 mL tube.
- Flugter godt to gange ud med sene neuronal konvertering medium og sted ind i samme 1,5 mL rør.
- Spin ned på 400 x g i 5 min og supernatanten.
- Resuspenderes celle i 200 µL af FACS buffer.
- Spin ned celler ved 400 x g i 5 min og supernatanten.
- Gentag trin 8.8 og 8.9 to gange.
- Resuspenderes celle i 50 µL af FACS buffer der indeholder humant CD56 (NCAM) antistof i en koncentration på 1:50 for 15 min på is. Beskytte mod lys.
- Spin ned celler ved 400 x g i 5 min.
- Resuspend i 200 µL FACS buffer til at vaske og spin-ned celler ved 400 x g i 5 min.
- Gentag trin 8.13.
- Resuspend i 200 µL af FACS buffer indeholdende propidium Iodid (PI; 10 µg/mL). Sortere NCAM positive (iNs) og PI negative (live) celler ved hjælp af FACS af gating baseret på fluorescens intensitetsniveau af kontrolprøver, der ikke var farves med NCAM antistof eller PI.
- Indsamle NCAM positive celler i et rør, der indeholder sent neuronal konvertering medium.
- Tælle celler ved hjælp af en automatiseret celle counter og re plade cellerne med en høj tæthed (50.000 celler/cm2) i slutningen neuronal konvertering medium i en PFL belagte fad.
- Fortsætte med at ændre halvdelen af medium 2 – 3 gange om ugen med sene neuronal konvertering medium indtil eksperiment slutpunkt (figur 1A).
Representative Results
En tydelig ændring i celle morfologi skal være synlige fra dag 5 og fremefter (figur 1B). Nogle celledød kan forventes efter viral transduktion, selv om ikke åbenlyst. Fra hver brønd i en 24-godt plade bør en cellen total udbytte af 20.000-40.000 celler forventes af dag 25, hvoraf skal cirka halvdelen er blevet neuroner. Det er vigtigt at bemærke, at udbytte og renhed kan variere på tværs af cellelinie, samt med sygdom stat og virus partier.
Celler vil udtrykke de fleste standard neuronal markører herunder MAP2 og TAU (figur 1 c) på dag 25 ud over udstiller en moden neuronal morfologi. Det er muligt at få en ren i befolkningen ved at gøre FACS baseret på markør NCAM (Se referencer8,11). Cellerne kan derefter være enten re belagt på PFL tredobbelt belægning (Se reference10) eller direkte frosset til Biomolekylær analyser.
Hvis cellerne ikke er sorteret, bør immunofluorescens mærkning med enten MAP2 eller TAU udføres for at identificere de korrekt konverterede celler og co mærket med protein af interesse.
Figur 1: udviklingen i omlægningen over tid. (A) tidslinje eksperiment og kort over den konstruktion, pakket i en lentivirus, bruges til at omprogrammere de voksne human dermal fibroblaster. Hver sort pil repræsenterer en medium forandring. (B) repræsentative fase kontrast billeder skildrer ændringer i morfologi af celler under konverteringen mellem dag 0 til dag 22 (som anført i øverste højre hjørne af hvert panel). Billeder blev taget på en fase-kontrast mikroskop ved hjælp af de 10 X mål. (C) immunofluorescens billede af en TAU og MAP2 dobbelt farvning i dag 35 efter transduktion. Celler var fast i 4% PARAFORMALDEHYD og permeabilized med 0,1% Triton i DPBS for 10 min. cellerne blev blokeret i 30 min. i en 5% serum løsning i DPBS. Antistofferne blev fortyndet i blokerende løsning og anvendes natten over ved 4 ° C. Fluorophore-konjugeret sekundære antistoffer blev fortyndet i blokerende løsning og anvendes for 2 h. celler blev counterstained med DAPI i 15 min. efterfulgt af 3 vasker med DPBS. Billeder blev taget på en inverteret fluorescens mikroskop ved hjælp af de 20 X mål. Skalere barer = 100 µm (B, C). Forkortelser: ENM: tidlig neuronal medium; LNM: slutningen neuronal medium. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne one-step/one vektor omprogrammering metode giver en effektiv måde at opnå iNs fra menneskelige voksen fibroblaster. Menneskelige voksen fibroblaster er normalt meget vanskeligere at skjult end føtal fibroblaster, med begrænsede undersøgelser tidligere rapportering effektivitetsgevinster på ca 5-10%12,13. Med denne nye protokol er det imidlertid muligt at opnå en neuronal udbytte (målt som MAP2 + celler) af cirka 50%8. Derudover kan vores protokol bruges på dermal fibroblaster, der har været passaged flere gange uden at miste effektivitet af konvertering. Hidtil har vi brugt celler passaged op til 14 gange uden at afsløre nogen nedgang i virkningsgraden. Også, der er ingen forskel i omprogrammering effektivitet i vores hænder med fibroblaster fra donorer i alderen mellem 52 og 87. Se reference8for flere detaljer om alder og sygdom for andre cellelinjer, der er testet med denne konstruktion. Andre undersøgelser har også rapporteret nogen forskel i virkningsgraden ved hjælp af en lentiviral-baseret og lille molekyle-forbedret protokol med donorer mellem 0 og 89 år4. Desuden er konsekvent anvendelighed med miRNA-baserede neuronal omprogrammering blevet rapporteret i fibroblaster i alle aldre, med donorer mellem 0 og 86 år7. Gennem denne rute, kan modne neuroner fås i ca 12-15 uger i in vitro eller cirka 8 uger efter transplantation i vivo8. Dette er en fordel fordi det giver adgang til både sygdom og patienten specifikke menneskelige iNs fra væv, der er let tilgængelige. Selv om denne protokol er effektive, vil det ikke producere en 100% neuronal udbytte, og som sådan en rensning skridt bruger FACS for eksempel er påkrævet.
Det mest afgørende skridt i denne protokol er viral transduktion (protokollen afsnit 4). Det er afgørende, at virus titer er præcise, ud over at have belagt en nøjagtige antal aHDFs for konvertering. Den anbefalede titer til brug med denne protokol er mellem 4 x 108 og 4 x 109. Ved hjælp af en titer på noget under 1 x 108 ville ikke anbefales som tilføjelse af store mængder af virus bliver giftigt for celler. Desuden, som fibroblaster begynder at covert in-de vil blive mere skrøbelige og modtagelige for løft. Det er vigtigt at være blid, når du ændrer medier som ikke vil forstyrre cellerne for meget. Dette kan gøres ved at fjerne væsken langsomt med en 1.000 µL pipette. Endelig, når plating for omprogrammering (protokollen afsnit 3) det er vigtigt at sikre en sund fibroblast befolkning før du begynder et eksperiment; dette angives af en celle levedygtighed over 90% med trypan blå farvning. AHDFs skal altid være passaged før at nå 95% confluency.
Hvis der er mærkbar celledød før viral transduktion, Begynd ikke konvertering: dobbelttjekke at cellernes levedygtighed er over 90%, og at der var ingen problemer med belægning af pladen. Det forventes at have en lille mængde af celledød efter viral transduktion, dette bør imidlertid ikke være betydelig. I dette tilfælde bekræfte præcise såning af 50.000 aHDFs/godt og kontrollere virus titer. Hvis der er mærkbar uoverensstemmelse mellem brønde under konverteringen, først tjekke at hver brønd indeholder en lige stor del af medierne og åbenlys fordampning sker ikke på kanterne (hvis nødvendigt ekstra medier kan føjes til kant wells). Alternativt, kontrollere trin 4.4, og sikre passende blanding til en homogen suspension når transducing. Det er afgørende at føje lentivirus til medium først, før du tilføjer det i brøndene. Direkte tilføjelse lentivirus i brøndene vil øge godt at nå variabilitet og sandsynligvis også være giftigt for celler. Endelig, altid kontrollere, at mediet er opvarmet til 37 ° C før du tilføjer til cellerne.
Denne protokol indeholder valgfrie sektioner for belægning betingelser for lange sigt kultur af iNs og FACS sortering for at øge neuronal renhed. For eksperimenter der ønsker at undersøge funktionelle karakterisering af iNs, er en protokol for forberedelse af glas coverslips for Elektrofysiologi også medtaget. Konvertering protokollen her er konfigureret til brug med en 24-godt plade; Hvis det ønskes dette kan ændres til en 6-, 12-, 48-, 96-brønd plade eller kolber. I dette tilfælde kan du justere alle diskenheder til arealet af den plade eller kolbe udnyttet.
Denne protokol bruger tvungen udtryk for Ascl1 og Brn2 i kombination med en resten knockdown alle pakket i et enkelt vektor8 til at generere iNs af en pan-neuronal fænotype. Generation af enhver glial undertyper med denne metode, men er ikke blevet vurderet. Denne metode vil således skulle blive modificeret til brug med andre omprogrammering faktorer at opnå subtype specifikke neuroner. Direkte omprogrammering har tidligere vist mulighed for at generere motoriske neuroner, sensoriske neuroner, fotoreceptorer, striatal mellemstore spiny neuroner og dopaminerge neuroner10,14. Dette vil være gavnligt, når undersøger neurologiske sygdomme i hvilke specifikke neuronal subtype er fortrinsvis berørt, for eksempel Parkinsons sygdom og dopaminerge neuroner.
Indtil for ganske nylig direkte neurale omprogrammering teknologi gav ikke mulighed for produktion af iNs på en standardiseret og effektiv måde — til et niveau, der kræves for toksikologi og stof screening assays på en stor skala. Denne nye metode er meget effektiv og kan bruges på fibroblaster, der har været passaged mange gange, så det nu fjerner disse begrænsninger og åbner for en bred vifte af undersøgelser, ikke kun i et menneskeligt neurale system, men også i et system, der kan være tålmodig specifikke. Enkelhed af denne tilgang gør det i teknologi tilgængelig for grupper, der ønsker at udføre lignende undersøgelser in-house og kan nemt bruges ikke kun til storstilet biomedicinske programmer, såsom narkotika screening og toksikologi assays, men også at støtte data stammer fra dyremodeller og menneskelige slagtningen vævsprøver.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Marie Persson Vejgården for teknisk bistand. Forskning fører til disse resultater har modtaget støtte fra New York stamcelle instituttet, det Europæiske Forskningsråd under EUs syvende rammeprogram: FP/2007-2013 Neuro stamcelle reparation (nr. 602278) og ERC tilskudsaftalen ingen. 30971, det svenske Forskningsråd (tilskudsaftale 521-2012-5624, 2016-00873 og 70862601 / Bagadilico), svensk Parkinsons Foundation (Parkinsonfonden), og den strategisk forskningsområde på Lunds Universitet Multipark (tværfaglig forskning i Parkinsons sygdom). Janelle Drouin-Ouellet understøttes af en canadisk institutter for sundhed Research (CIHR) fellowship (#358492), og Roger Barker er understøttet af en NIHR Biomedical Research Centre tilskud til Universitet i Cambridge/Addenbrooke's Hospital. Malin Parmar er en New York stamcelle Foundation Robertson Investigator. Shelby Shrigley er finansieret af EU Horizon 2020 program (H2020-MSCA-ITN-2015) under Marie Skłodowska-Curie Innovative uddannelsesnetværk og Grant aftale nr. 676408.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| Adult human dermal fibroblasts | [C2 passage #7] Donor was a 67 year old female. Cells obtained from the Parkinson’s Disease Research and Huntington’s disease clinics at the John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, UK). | ||
| Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2] | Gibco | 14190094 | |
| Trypsin-EDTA [0.5%] | Gibco | 15400-054 | Dilute to 0.05% in DPBS. |
| Virkon (agent used to neutralize virus) | Viroderm | 7511 | Dilute to 1% solution with warm water. |
| Milli-Q Water | Millipore | ||
| Basal medium - Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax | Gibco | 61965059 | |
| Penicillin/Streptomycin [10,000 U/mL] | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| CryoMACS® dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 | Miltenyi | 170-076-303 | |
| Neural differentiation medium - NDiff 227 | Takara-Clontech | Y40002 | |
| LM-22A4 | Tocris | 4607 | Dilute 10 mg in 1450 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) [recombinant human] | R&D systems | 212-GD-010 | Dilute 10 ug in 500 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 20 µg/mL. |
| NT3 [recombinant human] | R&D systems | 267-N3-025 | Dilute 25 µg in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 10 µg/mL. |
| db-cAMP | Sigma Aldrich | D0627 | Dilute 1 g in 40,7 mL Milli-Q water. Filter and make 500 µL aliquots or stock tubes of 10 mL. Stock concentration: 50 mM. |
| CHIR99021 | Axon | 1386 | Dilute 2 µg in 429,8 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| SB-431542 | Axon | 1661 | Dilute 5 mg in 595 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Noggin [recombinant human] | Miltenyi | 130-103-456 | Dilute 100 µg in 100 µL of Milli-Q water + 900 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 100 µg/mL. |
| LDN-193189 | Axon | 1509 | Dilute 2 mg in 360 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| Valproic acid sodium salt (VPA) | Merck Millipore | 676380 | Dilute 5 g in Milli-Q water to acheive a stock concentration of 1 M. CAUTION: Avoid ingestion, contact with skin, and breathing dust formation. |
| Reagents for Coatings | |||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G2500 | Dilute to 0.1% in Milli-Q water. |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | Dissolve in Milli-Q water. Use at 15µg/mL. |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33010-018 | 2 mL of Milli-Q water + 70 µL 0,25 M NaOH. Use at 5 µg/mL. |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | Store at -80°C. Thaw on ice, keep cool and aliquot 30 µL. Use at 5 µg/mL. |
| Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting | |||
| Cell dissociation agent - Accutase (Stem Pro) | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-calcium, -magnesium, - phenol red] | ThermoFisher Scientific | 14175-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | Use at 1% concentration for Anti-Human CD56 (NCAM). |
| DNAase | Sigma Aldrich | DN-25 | Use at 0.05% concentration. |
| Anti-Human CD56 (NCAM) Antibody [Mouse] | BD Pharmingen | 555518 | Use at 1 : 50. |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | Dilute to 1mg/mL in PBS and keep sterile. Use at 1:1000 to achieve a concentration of 10µg/mL. |
| Reagents for Glass Coverslips | |||
| Autoclaved deionized water | |||
| Alconox detergent | Sigma Aldrich | Z273228 | |
| Ethanol 95% | |||
| Nitric Acid | Sigma Aldrich | 438073-M | CAUTION: Concentrated nitric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. |
| Concentrated hydrochloric acid (HCI) | CAUTION: Concentrated hydrochloric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. | ||
| Reagents for Immunocytochemistry | |||
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 | Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 | Use at a concentration of 0.1%. |
| Serum [Donkey] | Merck Millipore | S30-100ML | |
| Anti-MAP2 Antibody [Chicken] | Abcam | ab5392 | Use at a concentration of 1 : 5,000. |
| Tau HT7 Monoclonal Antibody [Mouse] | ThermoFisher Scientific | MN1000 | Use at a concentration of 1 : 500. |
| Cy3 Anti-Chicken Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 703-165-155 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| Alexa Fluor488 Anti-Mouse Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 | Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500. |
| Equipment | |||
| T75 flask [Nunclon Delta Surface] | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| 24-well plate [Nunc] | ThermoFisher Scientific | 142485 | |
| 1.5 mL polypropylene tube | Sigma Aldrich | Z336769 | |
| 15 mL falcon tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL falcon tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| CryoPure tube 1.6 mL | Sarstedt | 72.380 | |
| Pippette controller | For pipetting volumes 1-25 mL. | ||
| Sterile serological pipettes: 5, 10 and 25 mL | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Adjustable volume pipettors: 5, 20, 200, and 1,000 µL | |||
| Sterile pipette tips | For pipetting volumes of 0.5 - 1,000 µL. | ||
| Glass coverslips | NeuVitro | GG-12-1.5-oz | #1.5 thickness, 12mm diameter, 0.5oz, CE certified, fit 24 well plates. |
| Glass dish | Approximately 150mm diameter. | ||
| Glass beaker | Make sure to have an appropriate size beaker for the sonicator bath available. Water from the sonicator bath should not overflow into the glass beaker. | ||
| Parafilm M | VWR | ||
| ThawSTAR Automated Cell Thawing System | BioCision | BCS-601 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chambers [50 slides] and trypan blue [0.4%] | ThermoFisher Scientific | C10228 | For use with Countess II Automated Cell Counter. |
| CoolCell Cell LX Controlled-rate Freezing Container | Biocision | BCS-405 | |
| Laminar flow hood | |||
| Humidified 5% CO2 37 °C incubator | |||
| Centrifuge | Suitable for 1,5, 15 and 50 mL tubes. | ||
| Orbital shaker | |||
| Sonicator - Bransonic Model B200 cleaner | Sigma Aldrich | Z305359 | Frequency = 50-60Hz, Amplitude = 30 Watts |
| FACS Aria III cell sorter | BD Pharmingen | ||
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, 170-182 (2016).
- Mertens, J., et al. Directly Reprogrammed Human Neurons Retain Aging-Associated Transcriptomic Signatures and Reveal Age-Related Nucleocytoplasmic Defects. Cell Stem Cell. 17, 705-718 (2015).
- Hashizume, O., et al. Epigenetic regulation of the nuclear-coded GCAT and SHMT2 genes confers human age-associated mitochondrial respiration defects. Sci Rep. 5, 10434 (2015).
- Lapasset, L., et al. Rejuvenating senescent and centenarian human cells by reprogramming through the pluripotent state. Genes Dev. 25, 2248-2253 (2011).
- Huh, C. J., et al. Maintenance of age in human neurons generated by microRNA-based neuronal conversion of fibroblasts. Elife. 5, (2016).
- Drouin-Ouellet, J., et al. REST suppression mediates neural conversion of adult human fibroblasts via microRNA-dependent and -independent pathways. EMBO Mol Med. , (2017).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Richner, M., Victor, M. B., Liu, Y., Abernathy, D., Yoo, A. S. MicroRNA-based conversion of human fibroblasts into striatal medium spiny neurons. Nat Protoc. 10, 1543-1555 (2015).
- Lau, S., Rylander Ottosson, D., Jakobsson, J., Parmar, M. Direct neural conversion from human fibroblasts using self-regulating and nonintegrating viral vectors. Cell Rep. 9, 1673-1680 (2014).
- Pfisterer, U., Wood, J., Nihlberg, K., Hallgren, O., Bjermer, L., Westergren -Thorsson, G., Lindvall, O., Parmar, M. Efficient induction of functional neurons from adult human fibroblasts. Cell Cycle. 10, 3311-3316 (2011).
- Caiazzo, M., Dell'Anno, M. T., Dvoretskova, E., Lazarevic, D., Taverna, S., Leo, D., Sotnikova, T. D., Menegon, A., Roncaglia, P., Colciago, G., Russo, G., Carninci, P., Pezzoli, G., Gainetdinov, R. R., Gustincich, S., Dityatev, A., Broccoli, V. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Masserdotti, G., Gascón, S., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: learning from and for development. Development. 143, 2494-2510 (2016).
- Pereira, M., Pfisterer, U., Rylander, D., Torper, O., Lau, S., Lundblad, M., Grealish, S., Parmar, M. Highly efficient generation of induced neurons from human fibroblasts that transplantation into the adult rat brain. Sci Rep. 4, 6330 (2014).
