Vi beskrive produktion strategien integrase-mangelfuld lentiviral vektorer (IDLVs) som køretøjer til at levere CRISPR/Cas9 til cellerne. Med en evne til at mægle, hurtig og robust gen redigering i celler, IDLVs præsentere et sikrere og lige så effektive vektor platform for gen levering i forhold til integrase-kompetente vektorer.
Lentiviral vektorerne er et ideelt valg til at levere gen-redigering komponenter til celler på grund af deres evne til stabilt transducing en bred vifte af celler og mægle høje niveauer af genekspression. Men deres evne til at integrere i vært celle genom øger risikoen for pattedyrsceller mutagenicitet og dermed giver anledning til sikkerhedsmæssige betænkeligheder og begrænser deres anvendelse i kliniske indstillinger. Yderligere, den vedvarende udtryk for gen-redigering komponenter leveret af disse integration-kompetente lentiviral vektorer (ICLVs) øger sandsynligheden for promiskuøs gen målretning. Som et alternativ, er blevet udviklet en ny generation af integrase-mangelfuld lentiviral vektorer (IDLVs), der omhandler mange af disse bekymringer. Her produktion protokollen af en ny og forbedret IDLV platform for CRISPR-medieret gen redigering og listen trin involveret i rensning og koncentrationen af disse vektorer er beskrevet og deres transduktion og gen-redigering effektivitet ved hjælp af HEK-293T celler blev demonstreret. Denne protokol er let skalerbar og kan bruges til at generere høj titer IDLVs, der er i stand til at transducing celler in vitro og in vivo. Desuden, denne protokol kan nemt tilpasses til produktion af ICLVs.
Præcise gen redigering udgør hjørnestenen i store biomedicinsk forskud, der vedrører udviklingen af nye strategier til at tackle genetiske sygdomme. På forkant med gen-redigering teknologier er den metode, der er afhængige af brugen af clustered regularly –jegnterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / Cas9 system, der var i første omgang identificeret som en komponent af bakteriel immunitet mod invasionen af viral genetiske materiale (gennemgik i referencer1,2). En stor fordel af ordningen med CRISPR/Cas9 over andre gen-redaktion værktøj, såsom zink-finger nukleaser (ZFNs) og transkription aktivere-lignende effektor nukleaser (TALENs) (gennemgik i reference3), er den relative enkelhed af plasmid design og opførelse af CRISPR komponenter — en funktion, der har drevet udvidelse af gen-redigering fra nogle få specialiserede laboratorier til en meget bredere forskning samfund. Derudover har enkelhed af CRISPR/Cas9 programmering og dets evne til at multiplex mål anerkendelse yderligere næret sin popularitet som en omkostningseffektiv og nem at bruge teknologi. Blandt de forskellige metoder til rådighed for forskerne til at levere sådanne gen-redigering komponenter til celler, stadig virale vektorer langt den mest populære og effektive system.
Lentiviral vektorer (LVs) er dukket op som køretøjet af valg til at levere komponenter i CRISPR/Cas9 system i vivo for forskellige applikationer4,5,6,7. Flere nøglen egenskaber gør LVs et populært valg for denne proces, herunder deres evne til at inficere både delende og ikke-dividere celler, lav immunogenicitet og minimal cellulære toksicitet (gennemgik i reference8). Som et resultat, har LV-medieret genterapi været ansat i behandlinger af smitsomme sygdomme, såsom HIV-1, HBV og HSV-1, og korrektion af fejl underliggende menneskelige arvelige sygdomme som cystisk fibrose og neo-kar makuladegeneration 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Desuden, LVs har ændret effektivt for at udføre multiplex gen redigering på særskilte genomisk loci ved hjælp af en enkelt vektor system12.
Men den iboende egenskab af LVs at integrere i host-genom kan være mutagene og ofte handicap for deres nytte som transgen levering køretøjer, især i klinisk indstillinger. Desuden, da stabilt integreret LVs udtrykke deres transgener på bæredygtigt høje niveauer, dette system er dårligt egnet til levering af gen-redigering komponenter som CRISPR/Cas9; overekspression af Cas9-guide RNA (gRNA) og lignende proteiner som ZFNs, er forbundet med forhøjede niveauer af off-target effekter, som omfatter uønskede mutationer13,14,15,16 , 17 og kan potentielt forbedre cytotoksicitet18. For at opnå præcise gen-redigering med minimal off target effekter, er det derfor afgørende, at design-systemer, der giver mulighed for den forbigående udtryk af genet redigering komponenter.
I de seneste år, er blevet udviklet en række forskellige leveringsplatforme forbigående udtrykke CRISPR/Cas9 i celler16,19,20,21 (gennemgik i reference22). Disse omfatter metoder, der er baseret på direkte at indføre renset Cas9 sammen med passende guide RNA’er i celler, som viste sig at være mere effektive på målrettede gen-redigering i forhold til plasmid-medieret Transfektion16. Undersøgelser har vist, at ribonucleoprotein (RNP) komplekser bestående af guide RNA/Cas9 partikler er hurtigt vendt efter mægle DNA kavalergang på deres mål, tyder på, at kortsigtede udtryk for disse komponenter er tilstrækkelige til at opnå robust gen redigering16. Tænkes, ikke integrere viral vektor platforme såsom adeno-associeret virale vektorer (AAVs) kan give et rentabelt alternativ for at levere gen-redigering maskiner til cellerne. Desværre, AAV capsids besidder betydeligt lavere emballage kapacitet end LVs (< 5kb), der alvorligt hæmmer deres evne til at pakke den multi-komponent CRISPR toolkit inden for en enkelt vektor (gennemgik i reference8). Det er værd at bemærke, at tilsætning af stoffer, der hæmmer Histon deacetyltransferase (f.eks., natrium butyrat23) eller hindre cellecyklus (fx, koffein24) har vist sig at øge lentiviral titers. Trods de seneste fremskridt, er forbigående udtryk systemer udviklet hidtil stadig hæmmet af flere mangler, såsom lavere produktionseffektivitet, hvilket fører til nedsat viral titers og lav transduktion effektivitet af vira genereret gennem sådanne tilgange25.
Integrase-mangelfuld lentiviral vektorer (IDLVs) repræsenterer et stort fremskridt i udviklingen af gen-levering køretøjer, som de kombinerer den emballage kapacitet af LVs med den ekstra fordel af AAV-lignende episomal vedligeholdelse i celler. Disse funktioner hjælpe IDLVs i vid udstrækning omgå de store spørgsmål i forbindelse med integration af vektorer, vis-à-vis kontinuerlig overekspression af potentielt genotoksiske elementer og integration-medieret mutagenicitet. Tidligere blev det påvist, at IDLVs kan ændres med held til at forbedre episomal gen expression26,27. Med hensyn til IDLV-medieret CRISPR/Cas9 levering begrænser lav produktion titers og lavere udtryk af episome-bårne genomer i forhold til integrase-dygtige lentiviral systemer deres nytte som Bonafide værktøjer til leverer genom-redigering transgene konstruktioner. Vi har for nylig vist, at både transgen udtryk og viral titers tilknyttet IDLV produktion er betydeligt forbedret ved inddragelse af bindende websteder for transkriptionsfaktor Sp1 inden for viral udtryk kassette28. De modificerede IDLVs understøttes håndfast CRISPR-medieret gen redigering både in vitro- (i HEK-293T celler) og i vivo (i post mitotiske hjernen neuroner), mens inducerende minimal off target mutationer i forhold til de tilsvarende ICLV-medieret systemer28. Samlet set udviklede vi en roman, kompakt, All-in-one CRISPR toolkit transporteres på en IDLV platform og skitseret de forskellige fordele ved at bruge sådanne fremføringsmiddel for forbedret gen redigering.
Her, er produktion protokol af IDLV-CRISPR/Cas9-systemet beskrevet, herunder de forskellige trin involveret i montage, rensning, koncentration og titrering af IDLVs, samt strategier til at validere gen-redigering effekten af disse vektorer. Denne protokol er let skalerbar til at opfylde behovene hos forskellige efterforskere og er designet til at kunne generere LV vektorer med titers i rækken af 1 x 1010 transducing enheder (TU) / mL. Vektorer genereres via denne protokol kan udnyttes til at effektivt inficere flere forskellige celletyper, herunder vanskeligt at transduce embryonale stamceller, hæmatopoietisk celler (T-celler og makrofager) og kulturperler og in vivo– injiceres neuroner. Derudover er protokollen lige så velegnet til produktion af integrase-kompetente lentiviral vektorer i lignende mængder.
Figur 1: IDLV emballage. (a) skematisk af vildtype integrase protein (b) den modificerede plasmid stammer fra psPAX2 (Se metoder, plasmid konstruktion for detaljer). Repræsentant Agarosen gel billede af kloner screenet for muterede integrase kloner. DNA-prøver udarbejdet ved hjælp af en standard plasmid DNA isoleret mini kit blev analyseret af fordøjelse med EcoRV og SphI. Korrekt fordøjet klon (nummer 5, stiplet rød boks) blev yderligere bekræftet ved direkte (Sanger) sekventering substitutionsrelevante D64E i INT. Integrase-mangelfuld emballage kassette blev opkaldt pBK43. (c) skematisk af forbigående Transfektion protokol ansat til at generere IDLV-CRISPR/Cas9 vektorer, viser 293T celler transfekteret med VSV-G, emballage og transgen kassetter (Sp1-CRISPR/Cas9 All-in-one plasmid). Viruspartikler, der bud ud fra cellens membran indeholder den fuld længde RNA af vektoren (udtrykt fra transgene kassette). Den anden generation af IDLV-emballagesystem blev brugt, som omfatter de lovgivningsmæssige proteiner Tat og rev Rev udtryk er yderligere suppleres fra en separat kassette (RSV-REV-plasmid). Kongerige: LTR-lang-terminal gentage, VSV-G, vesikulær stomatitis virus G-protein, pCMV-cytomegalovirus promotor; Rous sarkom virus (RSV) promotor; RRE-(Rev svar Element). Andre regulerende elementer på udtryk kassette omfatter Sp1-bindingssteder, Rev Response element (RRE), Woodchuck Hepatitis Virus posttranskriptionelle regulerende Element (WPRE), en kerne-brudforlængelse faktor 1α promotor (EFS-NC), vektor emballage element ψ (psi), menneskelige Cytomegalovirus (hCMV) promotor og menneskelige U6 promotor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
IDLVs begyndt at dukke op som køretøjet af valg til i vivo gen-redigering, især i forbindelse med genetiske sygdomme, i vid udstrækning på grund af lav risiko for mutagenese forbundet med disse vektorer i forhold til at integrere levering platforme22 , 28. i det aktuelle manuskript, søgte vi at detalje den protokol, der er forbundet med produktionen af den forbedrede All-in-one IDLV-CRISPR/Cas9 system, der var for nylig udviklet i vores laboratoriu…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke afdeling neurobiologi, Duke University School of Medicine og Dekansekretariatet for grundlæggende videnskab, Duke University. Vi takker også medlemmerne af hertug Viral vektor kerne for kommentarer på manuskriptet. Plasmidet pLenti CRISPRv2 var gave fra Feng Zhang (Broad Institute). LV-emballage system herunder plasmider psPAX2, var VSV-G, pMD2.G og pRSV-Rev en slags gave fra Didier Trono (EPFL, Schweiz). Finansiel støtte til dette arbejde blev leveret af universitetet i South Carolina School Of Medicine, give RDF18080-E202 (B.K).
Equipment | |||
Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | |
Allegra 25R tabletop centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | |
xMark Microplate Absorbance plate reader | Bio-Rad | 1681150 | |
BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
Inverted fluorescence microscope | Leica | DM IRB2 | |
0.45-μm filter unit, 500mL | Corning | 430773 | |
Conical bottom ultracentrifugation tubes | Seton Scientific | 5067 | |
Conical tube adapters | Seton Scientific | PN 4230 | |
SW32Ti swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 369650 | |
15 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430791 | |
50mL conical centrifuge tubes | Corning | 430291 | |
High-binding 96-well plates | Corning | 3366 | |
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid | Corning | 353025 | |
100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
0.22 μM filter unit, 1L | Corning | 430513 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
Tissue culture pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
Tissue culture pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
Tissue culture pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
Hemacytometer with cover slips | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture reagents | |||
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells | ATCC | CRL-3216 | |
293FT cells | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
DMEM, high glucose media | Gibco | 11965 | |
Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04 | |
Antibiotic-antimycotic solution, 100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
Non-Essential Amino Acid (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | B9879 – BES | |
Gelatin | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
p24 ELISA reagents | |||
Monoclonal anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
HIV-1 standards | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP451T | |
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Working concentration 1:1500 |
Normal mouse serum, Sterile, 500mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
Goat serum, Sterile, 10mL | Sigma | G9023 | Working concentration 1:1000 |
TMB peroxidase substrate | KPL | 5120-0076 | Working concentration 1:10,000 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Plasmids | |||
psPAX2 | Addgene | 12260 | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
lentiCRISPR v2 | Addgene | 52961 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Restriction enzymes | |||
BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
PacI | New England Biolabs | R0547S | |
SphI | New England Biolabs | R0182S |