A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Sriram Vijayraghavan; Boris Kantor

doi:10.3791/56915

JoVE Journal > Genetics

Genetics

En protokol til produktion af Integrase-mangelfuld Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-medieret gen Knockout i dividere celler

Published: December 12, 2017

doi:

10.3791/56915

Sriram Vijayraghavan, Boris Kantor

¹Duke Viral Vector Core, Department of Neurobiology,Duke University School of Medicine

Summary

Vi beskrive produktion strategien integrase-mangelfuld lentiviral vektorer (IDLVs) som køretøjer til at levere CRISPR/Cas9 til cellerne. Med en evne til at mægle, hurtig og robust gen redigering i celler, IDLVs præsentere et sikrere og lige så effektive vektor platform for gen levering i forhold til integrase-kompetente vektorer.

Abstract

Lentiviral vektorerne er et ideelt valg til at levere gen-redigering komponenter til celler på grund af deres evne til stabilt transducing en bred vifte af celler og mægle høje niveauer af genekspression. Men deres evne til at integrere i vært celle genom øger risikoen for pattedyrsceller mutagenicitet og dermed giver anledning til sikkerhedsmæssige betænkeligheder og begrænser deres anvendelse i kliniske indstillinger. Yderligere, den vedvarende udtryk for gen-redigering komponenter leveret af disse integration-kompetente lentiviral vektorer (ICLVs) øger sandsynligheden for promiskuøs gen målretning. Som et alternativ, er blevet udviklet en ny generation af integrase-mangelfuld lentiviral vektorer (IDLVs), der omhandler mange af disse bekymringer. Her produktion protokollen af en ny og forbedret IDLV platform for CRISPR-medieret gen redigering og listen trin involveret i rensning og koncentrationen af disse vektorer er beskrevet og deres transduktion og gen-redigering effektivitet ved hjælp af HEK-293T celler blev demonstreret. Denne protokol er let skalerbar og kan bruges til at generere høj titer IDLVs, der er i stand til at transducing celler in vitro og in vivo. Desuden, denne protokol kan nemt tilpasses til produktion af ICLVs.

Introduction

Præcise gen redigering udgør hjørnestenen i store biomedicinsk forskud, der vedrører udviklingen af nye strategier til at tackle genetiske sygdomme. På forkant med gen-redigering teknologier er den metode, der er afhængige af brugen af clustered regularly –jegnterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / Cas9 system, der var i første omgang identificeret som en komponent af bakteriel immunitet mod invasionen af viral genetiske materiale (gennemgik i referencer¹^,²). En stor fordel af ordningen med CRISPR/Cas9 over andre gen-redaktion værktøj, såsom zink-finger nukleaser (ZFNs) og transkription aktivere-lignende effektor nukleaser (TALENs) (gennemgik i reference³), er den relative enkelhed af plasmid design og opførelse af CRISPR komponenter — en funktion, der har drevet udvidelse af gen-redigering fra nogle få specialiserede laboratorier til en meget bredere forskning samfund. Derudover har enkelhed af CRISPR/Cas9 programmering og dets evne til at multiplex mål anerkendelse yderligere næret sin popularitet som en omkostningseffektiv og nem at bruge teknologi. Blandt de forskellige metoder til rådighed for forskerne til at levere sådanne gen-redigering komponenter til celler, stadig virale vektorer langt den mest populære og effektive system.

Lentiviral vektorer (LVs) er dukket op som køretøjet af valg til at levere komponenter i CRISPR/Cas9 system i vivo for forskellige applikationer⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Flere nøglen egenskaber gør LVs et populært valg for denne proces, herunder deres evne til at inficere både delende og ikke-dividere celler, lav immunogenicitet og minimal cellulære toksicitet (gennemgik i reference⁸). Som et resultat, har LV-medieret genterapi været ansat i behandlinger af smitsomme sygdomme, såsom HIV-1, HBV og HSV-1, og korrektion af fejl underliggende menneskelige arvelige sygdomme som cystisk fibrose og neo-kar makuladegeneration ⁴ ^, ⁵ ^, ⁷ ^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹. Desuden, LVs har ændret effektivt for at udføre multiplex gen redigering på særskilte genomisk loci ved hjælp af en enkelt vektor system¹².

Men den iboende egenskab af LVs at integrere i host-genom kan være mutagene og ofte handicap for deres nytte som transgen levering køretøjer, især i klinisk indstillinger. Desuden, da stabilt integreret LVs udtrykke deres transgener på bæredygtigt høje niveauer, dette system er dårligt egnet til levering af gen-redigering komponenter som CRISPR/Cas9; overekspression af Cas9-guide RNA (gRNA) og lignende proteiner som ZFNs, er forbundet med forhøjede niveauer af off-target effekter, som omfatter uønskede mutationer¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶ ^, ¹⁷ og kan potentielt forbedre cytotoksicitet¹⁸. For at opnå præcise gen-redigering med minimal off target effekter, er det derfor afgørende, at design-systemer, der giver mulighed for den forbigående udtryk af genet redigering komponenter.

I de seneste år, er blevet udviklet en række forskellige leveringsplatforme forbigående udtrykke CRISPR/Cas9 i celler¹⁶^,¹⁹^,²⁰^,²¹ (gennemgik i reference²²). Disse omfatter metoder, der er baseret på direkte at indføre renset Cas9 sammen med passende guide RNA’er i celler, som viste sig at være mere effektive på målrettede gen-redigering i forhold til plasmid-medieret Transfektion¹⁶. Undersøgelser har vist, at ribonucleoprotein (RNP) komplekser bestående af guide RNA/Cas9 partikler er hurtigt vendt efter mægle DNA kavalergang på deres mål, tyder på, at kortsigtede udtryk for disse komponenter er tilstrækkelige til at opnå robust gen redigering¹⁶. Tænkes, ikke integrere viral vektor platforme såsom adeno-associeret virale vektorer (AAVs) kan give et rentabelt alternativ for at levere gen-redigering maskiner til cellerne. Desværre, AAV capsids besidder betydeligt lavere emballage kapacitet end LVs (< 5kb), der alvorligt hæmmer deres evne til at pakke den multi-komponent CRISPR toolkit inden for en enkelt vektor (gennemgik i reference⁸). Det er værd at bemærke, at tilsætning af stoffer, der hæmmer Histon deacetyltransferase (f.eks., natrium butyrat²³) eller hindre cellecyklus (fx, koffein²⁴) har vist sig at øge lentiviral titers. Trods de seneste fremskridt, er forbigående udtryk systemer udviklet hidtil stadig hæmmet af flere mangler, såsom lavere produktionseffektivitet, hvilket fører til nedsat viral titers og lav transduktion effektivitet af vira genereret gennem sådanne tilgange²⁵.

Integrase-mangelfuld lentiviral vektorer (IDLVs) repræsenterer et stort fremskridt i udviklingen af gen-levering køretøjer, som de kombinerer den emballage kapacitet af LVs med den ekstra fordel af AAV-lignende episomal vedligeholdelse i celler. Disse funktioner hjælpe IDLVs i vid udstrækning omgå de store spørgsmål i forbindelse med integration af vektorer, vis-à-vis kontinuerlig overekspression af potentielt genotoksiske elementer og integration-medieret mutagenicitet. Tidligere blev det påvist, at IDLVs kan ændres med held til at forbedre episomal gen expression²⁶^,²⁷. Med hensyn til IDLV-medieret CRISPR/Cas9 levering begrænser lav produktion titers og lavere udtryk af episome-bårne genomer i forhold til integrase-dygtige lentiviral systemer deres nytte som Bonafide værktøjer til leverer genom-redigering transgene konstruktioner. Vi har for nylig vist, at både transgen udtryk og viral titers tilknyttet IDLV produktion er betydeligt forbedret ved inddragelse af bindende websteder for transkriptionsfaktor Sp1 inden for viral udtryk kassette²⁸. De modificerede IDLVs understøttes håndfast CRISPR-medieret gen redigering både in vitro- (i HEK-293T celler) og i vivo (i post mitotiske hjernen neuroner), mens inducerende minimal off target mutationer i forhold til de tilsvarende ICLV-medieret systemer²⁸. Samlet set udviklede vi en roman, kompakt, All-in-one CRISPR toolkit transporteres på en IDLV platform og skitseret de forskellige fordele ved at bruge sådanne fremføringsmiddel for forbedret gen redigering.

Her, er produktion protokol af IDLV-CRISPR/Cas9-systemet beskrevet, herunder de forskellige trin involveret i montage, rensning, koncentration og titrering af IDLVs, samt strategier til at validere gen-redigering effekten af disse vektorer. Denne protokol er let skalerbar til at opfylde behovene hos forskellige efterforskere og er designet til at kunne generere LV vektorer med titers i rækken af 1 x 10¹⁰ transducing enheder (TU) / mL. Vektorer genereres via denne protokol kan udnyttes til at effektivt inficere flere forskellige celletyper, herunder vanskeligt at transduce embryonale stamceller, hæmatopoietisk celler (T-celler og makrofager) og kulturperler og in vivo– injiceres neuroner. Derudover er protokollen lige så velegnet til produktion af integrase-kompetente lentiviral vektorer i lignende mængder.

Figur 1: IDLV emballage. (a) skematisk af vildtype integrase protein (b) den modificerede plasmid stammer fra psPAX2 (Se metoder, plasmid konstruktion for detaljer). Repræsentant Agarosen gel billede af kloner screenet for muterede integrase kloner. DNA-prøver udarbejdet ved hjælp af en standard plasmid DNA isoleret mini kit blev analyseret af fordøjelse med EcoRV og SphI. Korrekt fordøjet klon (nummer 5, stiplet rød boks) blev yderligere bekræftet ved direkte (Sanger) sekventering substitutionsrelevante D64E i INT. Integrase-mangelfuld emballage kassette blev opkaldt pBK43. (c) skematisk af forbigående Transfektion protokol ansat til at generere IDLV-CRISPR/Cas9 vektorer, viser 293T celler transfekteret med VSV-G, emballage og transgen kassetter (Sp1-CRISPR/Cas9 All-in-one plasmid). Viruspartikler, der bud ud fra cellens membran indeholder den fuld længde RNA af vektoren (udtrykt fra transgene kassette). Den anden generation af IDLV-emballagesystem blev brugt, som omfatter de lovgivningsmæssige proteiner Tat og rev Rev udtryk er yderligere suppleres fra en separat kassette (RSV-REV-plasmid). Kongerige: LTR-lang-terminal gentage, VSV-G, vesikulær stomatitis virus G-protein, pCMV-cytomegalovirus promotor; Rous sarkom virus (RSV) promotor; RRE-(Rev svar Element). Andre regulerende elementer på udtryk kassette omfatter Sp1-bindingssteder, Rev Response element (RRE), Woodchuck Hepatitis Virus posttranskriptionelle regulerende Element (WPRE), en kerne-brudforlængelse faktor 1α promotor (EFS-NC), vektor emballage element ψ (psi), menneskelige Cytomegalovirus (hCMV) promotor og menneskelige U6 promotor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. dyrkning HEK-293T celler og såning celler for Transfektion Bemærk: Menneskelige embryonale nyre 293T (HEK-293T) celler dyrkes i DMEM, høje glukose media suppleret med 10% kvæg kalveserum suppleret med jern og vækst initiativtagere og 1 x antibiotikum-antimykotikum løsning (100 x opløsning indeholder 10.000 enheder penicillin 10 mg streptomycin og 25 µg amphotericin B pr. mL). Medierne er også suppleret med 1 x natrium pyruvat, 1 x ikke-essentiel aminosyre mix og 2 mM L-glutamin (stoc…

Representative Results

Validering af IDLV-CRISPR/Cas9 vektorer knockout-effektivitetVi brugte normal god landbrugspraksis-udtrykker 293T celler som en model til at validere effektiviteten af CRISPR/Cas9-medieret gen knockout. Normal god landbrugspraksis + celler blev genereret af transduktion af HEK-293T celler med pLenti-NGL (vBK201a) på et MOI af 0,5 (figur 3b, “no-virus” panel). SgRNA-til-normal god landbrugspraksis/Cas9 All-in-one vektor kassette var pakke…

Discussion

IDLVs begyndt at dukke op som køretøjet af valg til i vivo gen-redigering, især i forbindelse med genetiske sygdomme, i vid udstrækning på grund af lav risiko for mutagenese forbundet med disse vektorer i forhold til at integrere levering platforme²² ^, ²⁸. i det aktuelle manuskript, søgte vi at detalje den protokol, der er forbundet med produktionen af den forbedrede All-in-one IDLV-CRISPR/Cas9 system, der var for nylig udviklet i vores laboratoriu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke afdeling neurobiologi, Duke University School of Medicine og Dekansekretariatet for grundlæggende videnskab, Duke University. Vi takker også medlemmerne af hertug Viral vektor kerne for kommentarer på manuskriptet. Plasmidet pLenti CRISPRv2 var gave fra Feng Zhang (Broad Institute). LV-emballage system herunder plasmider psPAX2, var VSV-G, pMD2.G og pRSV-Rev en slags gave fra Didier Trono (EPFL, Schweiz). Finansiel støtte til dette arbejde blev leveret af universitetet i South Carolina School Of Medicine, give RDF18080-E202 (B.K).

Materials

Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge	Beckman Coulter	369434
xMark Microplate Absorbance plate reader	Bio-Rad	1681150
BD FACS	Becton Dickinson	338960
Inverted fluorescence microscope	Leica	DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL	Corning	430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes	Seton Scientific	5067
Conical tube adapters	Seton Scientific	PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor	Beckman Coulter	369650
15 mL conical centrifuge tubes	Corning	430791
50mL conical centrifuge tubes	Corning	430291
High-binding 96-well plates	Corning	3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid	Corning	353025
100mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
0.22 μM filter unit, 1L	Corning	430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50)	Qiagen	27104
Tissue culture pipettes, 5 mL	Corning	4487
Tissue culture pipettes, 10 mL	Corning	4488
Tissue culture pipettes, 25 mL	Corning	4489
Hemacytometer with cover slips	Cole-Parmer	UX-79001-00
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells	ATCC	CRL-3216
293FT cells	Thermo Fisher Scientific	R70007
DMEM, high glucose media	Gibco	11965
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X	Sigma Aldrich	A5955-100ML
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA)	Hyclone	SH30087.04
RPMI 1640 media	Thermo Fisher Scientific	11875-085
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
Trypsin-EDTA 0.05%	Gibco	25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid)	Sigma Aldrich	B9879 – BES
Gelatin	Sigma Aldrich	G1800-100G
Name	Company	Catalog Number	Comments
p²⁴ ELISA reagents
Monoclonal anti-p²⁴ antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3537
HIV-1 standards	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP968F
Polyclonal rabbit anti-p²⁴ antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG	Sigma Aldrich	12-348	Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL	Equitech-Bio	SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL	Sigma	G9023	Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate	KPL	5120-0076	Working concentration 1:10,000
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
pRSV-Rev	Addgene	12253
lentiCRISPR v2	Addgene	52961
Name	Company	Catalog Number	Comments
Restriction enzymes
BsrGI	New England Biolabs	R0575S
BsmBI	New England Biolabs	R0580S
EcoRV	New England Biolabs	R0195S
KpnI	New England Biolabs	R0142S
PacI	New England Biolabs	R0547S
SphI	New England Biolabs	R0182S

References

Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).
Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
Bellec, J., et al. CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells. Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).
Kennedy, E. M., et al. Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease. Virology. 476, 196-205 (2015).
Roehm, P. C., et al. Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy. Sci Rep. 6, 23146 (2016).
Wang, W., et al. CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PLoS One. 9 (12), e115987 (2014).
Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Adv Genet. 87, 125-197 (2014).
Lebbink, R. J., et al. A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape. Sci Rep. 7, 41968 (2017).
Xu, L., et al. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. , (2017).
Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).
Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), e147 (2014).
Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).
Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
Schaefer, K. A., et al. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).
Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).
Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).
Nelson, C. E., Gersbach, C. A. Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing. Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).
Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors. Virol J. 3, 27 (2006).
Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
Hoban, M. D., et al. Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).
Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).
Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).
Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).
Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).
Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains. J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).
Gomez-Gonzalo, M., et al. The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter. J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).
Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).
Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength. J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).
Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).
Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).
Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors. Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).
. Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products – Revisiting Current FDA Recommendations Available from: https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf (2017)
. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2017)
Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).