Summary
מאמר זה מפרט את שיטות המשמשות כדי להרחיב את תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי תרבות, כמו גם כיצד להבדיל אותם לתוך תת עצביים שונים, האסטרוציטים, תוך שימת דגש על השימוש בתאי גזע עצביים ללמוד Zika בנגיף.
Abstract
תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי מהווים מערכת מודל ייחודי שאינו-מהונדסים לחקור את ההשפעה של גירויים שונים על האדם הנוירו-ביולוגיה התפתחותית. מעדיף מאשר להשתמש במודל חיה או תאים pluripotent המושרה מהונדסים, תאי גזע עצביים אנושי לספק מערכת יעילה במבחנה כדי לבחון את ההשפעה של טיפולים, תרופות מסך, או לבחון הבדלים אינדיבידואליים. כאן, אנו מספקים את הפרוטוקולים מפורט עבור שיטות המשמשות להרחבתן של תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי בתרבות עם מדיה ללא סרום, כדי להבדיל אותם לתוך תת עצביים שונים, האסטרוציטים באמצעות הליכים שונים לקרקע, כדי להקפיא ולשחזר תאים אלה. יתר על כן, אנו מתארים הליך של שימוש בתאי גזע עצביים במוח העובר האדם ללמוד Zika בנגיף.
Introduction
Zika וירוס (ZIKV) הוא flavivirus ששודרו או מינית, או על ידי יתוש וקטורים היתושים Aedes aegypti ו אדס מפוספס . ZIKV לאחרונה זוהה כאיום חמור לבריאות הציבור בשל הקלות של שידור, המזוהה עם סימפטומים נוירולוגיים1. ביותר לגבי תופעות נוירולוגיות היא התפתחות microcephaly ההתעסקות נולד האמהות נגועים בהריון2,3. Microcephaly היא הפרעה התפתחותיות איפה הראש הוא קטן יותר מהגודל טיפוסי במהלך התפתחות העובר, בלידה, עם ההיקף פחות מ- 2 סטיות תקן מתחת רשע4. היקף ראש קטן יותר מלווה בדרך כלל מגוון רחב של מחלות רקע כגון עיכובים התפתחותיים, התקפים, ראייה, אובדן שמיעה, האכלה קושי.
מחקרים שנעשו לאחרונה בשימוש בבעלי חיים או המושרה בתאי גזע pluripotent לחקור את ההשפעה של זיהום ZIKV neurodevelopment5,6,7,8. בעוד מחקרים אלה תרמו הידע שלנו על ZIKV, השימוש של מינים שונים או תאים מהונדסים עשויה לגזול זמן רב ו/או להוסיף משתנים נוספים אשר עשויים לבלבל את השפעת ZIKV על פיתוח עצבית תאים5, 6 , 7 , 8. עם זאת, הקושי עם תרבות hNSC, במיוחד את תרבות שאינם מחסידי neurosphere המתוארות פרוטוקול זה, היא כי התרבות היא רגישה מאוד שיטות השתמשו כדי לנהל את תרבות9. כל שינוי רכיבים בינונית, או אפילו את הטיפול הפיזי של כלי השיט תרבות, מספיקה כדי להפיק תגובה9תאים. כדי לטפל בבעיות אלה, פיתחנו תרבות אנושית עוברית המוח-derived עצבית תאי גזע (hNSCs) במבחנה mechanistically לחקור את השפעת ZIKV על תאי גזע עצביים בעובר. באמצעות השיטה שלנו, hNSCs היו נשמרים עבור מעל 80 קטעים ללא שינויים פנוטיפי לכאורה10. יתר על כן, שינויים כרומוזומלית כגון טריזומיה היו גם או מינימלי11. תרבות זו hNSC גדל כתרבות שאינו חסיד neurosphere. אחד היתרונות של neurospheres הוא הכדורים ליצור נישה סביבתית ייחודית בתרבות זו משקפת יותר ויוו נישות לעומת מימדי התרבויות9. יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא כי סוגי תאים מרובים הנגזרות התרבות hNSC, הפעלת חוקר לבחון את ההשפעה של משתנה נתון על הישרדות hNSC ובידול. פרוטוקול זה חל יחידים שמחפש תשובה מכניסטית שאלות לגבי התפתחות מערכת העצבים המרכזית או תפקוד לקוי. הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להרחיב את תרבות hNSC להדביק עם ZIKV ולאחר מכן להבדיל את hNSCs כדי לבחון את ההשפעה של זיהום על תהליך התמיינות. זה כולל גם שיטות לאחסון hNSCs לשימוש ארוך טווח, וכדי להבדיל hNSCs לתוך סוגים שונים של נוירונים זה לאפשר את המשך החקירה של גירעונות ZIKV-induced תורם להפרת זכויות המוח11. אנו מאמינים שפרוטוקול זה הוא גם עניין חוקרים המבקשים להכיר את ההשפעה של כל גירוי סביבתיים כגון זיהום או רעלים על תאי גזע עצביים הישרדות ובידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
תאי גזע עצביים האנושי היו במקור נגזר זרוקים cortexes העובר האנושי השליש הראשון12. כל ההליכים פרוטוקול לדבוק ההנחיות אתיקה באוניברסיטת טקסס הענף הרפואי בנוגע לשימוש של דגימות רקמה אנושית, הקווים תא אושרו על-ידי הוועדה המוסדית אבטחה.
1. הכנה בינונית מניות ושחזור תאי גזע
- להכין מלאי תרבות בינוני (DFHGPS) על-ידי שילוב של ריאגנטים, צעדים 1.1.1.-1.1.5.
- הוסף 210 מ ששינה נשר בינוני של Dulbecco עם גלוקוז גבוהה וגלוטמין (D). אחסן אותו ב 4 הלעפה תרוטרפמט.
- להוסיף 70 מ מזין F12 לערבב של חזיר עם תוספת-גלוטמין (F). אחסן אותו ב 4 הלעפה תרוטרפמט.
- להוסיף 4.2 מ ל 15 מ מ HEPES מאגר (H) ולאחסן אותה בטמפרטורת החדר.
- להוסיף מ 4.2 ל 10% הפתרון D-גלוקוז (G) ולאחסן אותה בטמפרטורת החדר.
- להוסיף mL 2.88 בפתרון פניצילין/סטרפטומיצין (PS). Aliquot הפתרון מניות לתוך 3 מ"ל aliquots ולאחסן את aliquots ב-20 ° C עד שהוא נדרש.
הערה: הריכוז הסופי של פניצילין במדיום יהיה 100 יחידות/mL, הריכוז של סטרפטומיצין יהיה 100 µg/mL. בינוני יטופלו כמו DFHGPS למשך שארית הפרוטוקול, יש לאחסנו ב 4 ° C לשימוש בתוך 1-2 שבועות. אם יש צורך, DFHGPS עשוי להיות יורה באופן פרופורציונלי.
- יום לפני תאים התאוששו מעיל בקבוקון T75 5 מ של מדיום ממוזגים, שהושג מתרבויות קודמות של הקו תא hNSC, להשאיר חממה 37 ° C עם 8.5% פחמן דו-חמצני (CO2) בין לילה.
הערה: אם כיום culturing hNSCs, לשמור את המדיום זה התאים יש כבר גדל במהלך שינוי בינוני. זהו מדיום ממוזגים כמו זה יש כבר "מיזוג" על ידי התאים. בינוני ממוזגים יכול תישמר בשפופרת פקקי בורג ולא המאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס במשך כ- 7 ימים. צור קשר עם המחבר המקביל לקבל hNSCs. בינוני ממוזגים היא עדיפה אבל לא חובה לחלוטין, במיוחד כאשר מתחילים את התרבות של hNSCs. - היום של התאוששות, לחמם 20 מ של DFHGPS בשפופרת פקקי בורג 50 מ ל אמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפחות 10 דקות ולשמור אותו באמבט מים עד מוכן לשימוש.
- בשפופרת בורג מכסה נפרד 15 מ"ל, חם 10 מ"ל של DFHGPS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפחות 10 דקות ולשמור אותו באמבט מים עד מוכן לשימוש בשלב 1.13.
- אחזר מכולה של קרח, כל הרכיבים בינונית (טבלה 1). הפשרת כל הרכיבים בינונית על הקרח ולהשאיר אותם על הקרח תוך הכנות לקראת השינוי בינוני.
- לקבל 5 מ של מניות בינוני ממוזגים (מאוחסן ב 4 ° C) ולשמור אותו באמבט מים 37 ° C עד מוכן לשימוש בשלב 1.14. ראה הערה לאחר שלב 1.2 אם אין תרבות ממוזגים בינוני או הנוכחי האנושי עוברית עצבית תאי גזע.
- לאחזר את הצינור בורג מכסה של 50 מ ל מ שלב 1.3 ולמקם אותו אבטחה cabinet (BSC). להעביר 10 מ"ל של DFHGPS לתוך צינור בורג מכסה 15 מ"ל, ולאחר מכן מקם את 50 מ ל שפופרת המכילה mL 10 הנותרים של מדיום DFHGPS חזרה באמבט מים 37 º C.
- לקבל הקפאה-בקבוקון hNSCs המאוחסן בחנקן נוזלי. ראה הערה לאחר שלב 1.2 אם אין תרבות אנושית תא גזע עוברי עצבית הנוכחי.
הערה: תאי גזע עצביים האנושי היו במקור נגזר ע י זרוקים מוח העובר האנושי12 ומתוחזק בתרבות ללא שינויים גנטיים10. צריך להיות הקרת, מצופה על בקבוקון T75 5 × 106 תאים. כל הקפאה-בקבוקון צריך להכיל 5 × 106 תאים; לכן, נדרשת בקבוקון אחד לכל את הבקבוק. - הפשרת בקבוקון של תאים ב- 37 מעלות צלזיוס המים הרותחים על-ידי היפוך המבחנה כל 10 s עבור-1 דקות, או עד הקרח נמס תכולת הבקבוקון הם נוזלי לגמרי. לא להטביע את בקבוקון שלם מתחת למים כדי למנוע זיהום אפשרי.
- BSC, להשתמש P1000 מיקרו-פיפטה וארוקן את הפתרון תא המופשרים ולהוסיף אותו drop-wise הצינור 15 מ"ל מהשלב 1.7, המכיל 10 מ"ל של DFHGPS. כדי להוסיף את הפתרון המופשרים תא drop-wise, לאט לחץ כלפי מטה על הבוכנה כך רק טיפה או שתיים משתחררת בבת-אחת. בינתיים, מערבולת הצינור 15 מ"ל להתיר תערובת מהירה.
- Centrifuge התליה תא ב g x 200 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע, מקפיד לשמור על בגדר התא.
- במהלך שלב 1.11, לאחזר את הצינור 50 מ ל המכיל 10 מ ל הנותרים מהשלב 1.7. לאחר צנטריפוגה, resuspend בגדר תא 10 מ"ל DFHGPS, צנטריפוגה שוב ב- g x 200 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- במהלך ספין הסופי, להכין את מדיום הגידול החדש על ידי הבאים טבלה 1 כדי להוסיף גורמי גדילה 10 מ"ל של מדיום DFHGPS מהשלב 1.4 (טבלה 1) ב- BSC. השאר המדיום החדש המכיל גורמי גדילה ב- BSC עד מוכן לשימוש.
- לאחזר את הבקבוקון T75 מהשלב 1.2 ולמחוק את המדיום ממוזגים ציפוי את הבקבוק על ידי השאיפה. לאחר מכן להוסיף את מ של מדיה ממוזגים מהשלב 1.6. כדי. הבקבוק באמצעות פיפטה סרולוגית יש להיזהר לא לגרד את תחתית הבקבוק.
- לאחזר את הצינורית של תאים לצנטריפוגה ולמחוק את תגובת שיקוע על ידי כ רפה בעברית, עוזב בגדר תא שלם.
- Resuspend תא גלולה ב 10 מ"ל של מדיה חדשה מהצעד 1.13 באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ ל ו pipetting לאורך מספר פעמים. להוסיף את הבולם הבקבוקון T75 מצופה מהשלב 1.14. להשתמש mL 5 הנותרים כדי לשטוף את הצינור שהכיל בגדר התא, ולאחר מכן להוסיף האלה מ ל. הבקבוק גם כן.
- סלע את הבקבוקון T75 הלוך ושוב 3 פעמים כדי להבטיח שהתאים מופצים באופן שווה על פני הבקבוקון. ודא שהפקק של הבקבוק הוא חופשי כדי לאפשר זרימת אוויר. תחת מיקרוסקופ אור לבחון את התאים שהפתקים, לקחת תמונות במידת האפשר.
הערה: התאים אמור להיראות שקוף, כדורית. רשמו אם ישנם תאים אטום כהה, את המבט, או הדיירים סימטרית כמו זה יכול להצביע על מוות של תאים. גם לצפות עבור כל זיהום פטרייתי או חיידקי, כגון התקשורת הופך צהוב בצבע. - מקם את הבקבוקון של תאים חממה 37 ° C עם 8.5% CO2.
הערה: השתמש 8.5% במקום 5.0% CO2 כדי לשמור על רמת החומציות של מדיה תרבות זו ללא סרום בטווח של 7.1-7.4.
2. hNSC שינוי בינוני
הערה: שינוי בינוני כל 3-4 ימים.
- להפעיל את BSC ולנקות ביסודיות עם 70% אתנול. להתבונן תאים במיקרוסקופ אור.
הערה: ליצור הערות על המראה של התאים, כדור גדלים. שלושה ימים לאחר השחזור או מעבר, התאים אשכול ביחד, להתחיל ליצור שאינו חסיד neurospheres.
התראה: אם תאים לדבוק התחתון של הבקבוק, יהיה עליך להיות מושלך תא הדבקות יגדל בידול מוקדמת, התאים לא תהיה אפשרות לשמור על מדינה גזע התרבות. אם יש תאים רבים מדי הבקבוק, התאים עשויים בצורת כדורים גדולים (גדול מ- 2 מ מ קוטר) ובמקרה, תאים במרכז הספרה יתחיל להבחין בשל חוסר גישה גורמי גדילה של המדיום. אם הספירות שגודלם 1 מ"מ קוטר שנצפו, תאים יכול להיות passaged (שלבים 3.1-3.22). - בצע את שלבים 1.4 ו 1.5 והכן 10 מ"ל בינוני טריים (ראה שלב 1.13).
- . הבקבוק הטיה לצד, ומאפשר הספירות לשקוע לתחתית הבקבוק
- הסר מ של מדיה ממוזגים מהחלק העליון של המדיום במאגר באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ ל, מטפל לא לרוקן כל neurospheres. מקם את מ של מדיה ממוזגים לתוך צינור נקי 15 מ"ל.
- אוטם 5 נוספים של מדיה ממוזגים להסיר הבקבוק, שוב בזהירות הימנעות את הספירות, ומניחים 5 mL לתוך הצינור 15 מ"ל זהה.
- להוסיף 10 מ של מדיה חדשה מהצעד 2.2 mL 5 הנותרים של מדיה ממוזגים תאים הבקבוקון. הגדר את הבקבוקון למטה שטוח ולצפות תאים במיקרוסקופ אור.
- אם זה מופיע תאים יש כבר aspirated במהלך האיסוף של מדיום ממוזגים, ספין המדיום ממוזגים ב g x 100 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מחדש להשעות כל התאים המצטברים בתחתית ב 1 מ"ל של מדיום ממוזגים, ולאחר מכן להוסיף אותם הבקבוקון תרבות.
- אחסן את 10 מ"ל של מדיה שאינה בשימוש ממוזגים מצעדי 2.5/2.6-4 הלעפה תרוטרפמט צינור בורג מכסה 15 מ"ל.
- חזור על שלבים 1.17/1.18.
3. hNSC מעבר
הערה: hNSCs צריך להיות מעבר כל 9-11 ימים אם התאים גדלים בדרך כלל, כמו האוכלוסייה הכפלת זמן הוא כ 3 ימים13.
- אם להרחיב את NSCs לתוך בקבוקון חדש, ודא כי כל צלוחיות החדש הם מצופה כמו שלב 1.2.
- לנקות את BSC כמו שלב 2.1, לבצע שלבים 1.4 ו- 1.5.
- להכין בינוני כמו שלב 1.13. כל הבקבוק T75 דורש 10 מ"ל של מדיום. עבור מבחנות T75 מרובים, הכפל 10 מ"ל של המדיה לפי מספר מבחנות.
- להכין 1 או 3 מ ל תמיסת מלח באגירה פוספט (dPBS) של Dulbecco, גלוקוז ומקום באמבט מים 37 ° C כדי לחמם 10 דקות (לפתרון טריפסין) לפי אמצעי האחסון בטבלה מס ' 2. אל תוסיף טריפסין או DNase בשלב זה. DNase ייתכן שיהיה צורך לשבור דנ שוחרר מן התאים המתים עקב תא כימי מכניים או דיסוציאציה.
הערה: עבור אחד T75 הבקבוק passaged אחרי 9-10 ימים של צמיחה יהיו כ 30 × 106 תאים, אם × 10 56 היו במקור נזרע על הבקבוק. בדרך כלל, 1 מ"ל של פתרון dPBS משמש עבור 10 × 106 תאים. לכן, 3 מ"ל של dPBS פתרון יש צורך בקבוקון T75 passaged אחרי 9-10 ימים. - המקום נקי קטן שוקל hemocytometer והים בשכונה. לנקות עם 70% אתנול ויאפשר לאוויר יבש בשכונה במשך כ 5 דקות.
הערה: הסירה שוקלים ישמש בשלבים 3.17.1. - אחזר את הבקבוקון של תאים כי passaged מן החממה ולהביא לתוך BSC. להטות את הבקבוק בעדינות ומאפשר תאים לשקוע לתחתית של התקשורת במאגר. יש בערך 15 מ"ל של התקשורת הבקבוקון.
- הסר כ- 10 מ"ל של מדיה 5 mL חלקים (כלומר 5 מ"ל + 5 מ"ל). המקום הזה 10 מ"ל של מדיה לתוך צינור נקי 15 מ"ל שכותרתו "ס" "ממוזגים בינוני". להיזהר לא לרוקן כל תא התיישבו mL 5 הנותרים של התקשורת הבקבוקון; אלה תאים, 5 מ של מדיה כרוך שלב 3.8.
- לקחת 3 מ"ל של מדיה ממוזגים מהצינור"ס"(מתוך שלב 3.7) ולמקם לתוך צינור 15 מ"ל שכותרתו "הפתרון מעכבי טריפסין". זה ישמש בשלב 3.12. לאחר הסרה של 3 mL, יש 7 מ של מדיה ממוזגים שמאל בצינור "ס". להפריש את הצינור "ס" עד שלב 3.9.
- הסר mL 5 תאים שנותרו הבקבוקון T75 ומדיה, למקם את צינור נקי 15 מ"ל שכותרתו"תאים".
- להשתמש ברכבת התחתית "ס" המכיל 7 מ של מדיה ממוזגים (מתוך שלב 3.7.1) ולשטוף את החלק התחתון של הבקבוק T75 פעמיים עם מנות 3.5 מ של מדיה ממוזגים, באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ. לאחר כל שטיפה, מקם את החלקים 3.5 מ לתוך הצינור "תאים". מטרת שלב זה היא להסיר את כל neurospheres (תאים) הבקבוקון T75.
- Centrifuge הצינור "תאים" ב- 100 גרם x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. בעוד התאים מתחילים להסתובב, להשיג פתרון dPBS/גלוקוז של 37 מעלות צלזיוס המים הרותחים ולהוסיף את הכמות המתאימה של טריפסין, DNase לפי טבלה 2.
- אחרי הצינור "תאים" עצר ספינינג, להסיר כל המדיום ממוזגים supernatant ולהעביר הצינור "ס".
- להשתמש ברכבת התחתית. תווית "הפתרון מעכבי טריפסין" מהשלב 3.7.1. ולהוסיף את עוצמת הקול של מעכבי טריפסין המצוין בטבלה3. השתמש באותו אמצעי אחסון של פתרון מעכבי טריפסין שימש עבור הפתרון טריפסין.
- במקום פתרון מעכבי טריפסין באמבט מים 37 ° C עד שהוא נדרש.
- להוסיף טריפסין פתרון בגדר תא בצינור 15 מ"ל, פיפטה למעלה ולמטה כ 5 - 10 פעמים עם פיפטה 5 מ. לסגור את הפקק של הצינור, דגירה באמבט מים 37 º C למשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, לאחזר את התאים, למעלה ולמטה פיפטה 5 - 10 פעמים. ואז תדגור באמבט מים 37 º C למשך דקות נוספות 10-15
- ב 5 דקות האחרונות, להעביר את הפתרון מעכבי טריפסין BSC.
- לאחזר את התאים לאחר השלמת שלב 2.14 זה, pipette את התאים למעלה ולמטה עד לחלוטין חלופה מועדפת הספירות (20 - 30 פעמים). לאחר מכן מיד להוסיף את הפתרון מעכבי טריפסין, פיפטה לאורך 10 פעמים. פתרון זה של תאים הפומבית מעכבי טריפסין יכונו בשם "התליה תא".
- לספור את מספר התאים ההשעיה תא על-ידי ביצוע שלבים.
- פיפטה 15 µL תערובת קדם Trypan Blue (מכיל 5 µL של 0.4% Trypan µL כחול ו- 10 של dPBS) על גבי סירה קטנה שוקלים, ולאחר מכן להוסיף 5 µL של התליה תא. פיפטה למעלה ולמטה 3 - 5 פעמים כדי לערבב. לאחר מכן, פיפטה 10 µL של התליה תא Trypan Blue אל צדי hemocytometer מכוסה coverslip זכוכית.
- לבחון את התאים במיקרוסקופ אור ולספור את המספר הכולל של תאים בכל פינה ארבע הרשתות. הוסף את המספרים האלה ביחד.
- חזור על ספירה עבור הצד השני, ממוצע של שני הצדדים יחד.
- הכפילו את המספר הזה ב- 10,000 לתת את המספר הכולל של תאי mL. להכפיל את המספר הזה על ידי המספר הכולל של מיליליטר כדי לחשב את המספר הכולל של תאים ההשעיה תא. לחשב כמה נפח תא השעיה, יהיה צורך זרע 5 מיליון תאים לכל T75 הבקבוק.
הערה: בדרך כלל, אחרי 9-10 ימים, T75 יהיו 25-30 × 106 תאים. לכן, אם passaging כל התאים לתוך מבחנות חדשות, סכום כולל של 5-6 מבחנות צורך. - הוסף את הנפח של תא ההשעיה שחושבו בצעד 3.19 את כל הבקבוק T75 להשיג 5 × 106תאים לכל הבקבוק. אם אמצעי האחסון הוא פחות מ 5 מ ל, להוסיף תנאי נוסף בינוני כדי לפצות לסך של 5 מ"ל. לאחר מכן להוסיף 10 מ של חדש DFHGFPS מדיה המכילה פרוטאינים (טבלה 1) הבקבוקון.
- חזור על שלבים 1.17 ו 1.18 ולהבטיח שהבקבוק מסומן עם הסוג של תאים, התאריכים, מספר התאים בתוך הבקבוק ומספר את המעבר (זהו מספר הפעמים שהתא יש כבר passaged). ואז לעבור שלבים 4-9.
- אם נוסף הצורך, הזרע תאים לתוך הבקבוק אחד T75-הצפיפות עד 30 × 106תאים לכל הבקבוק בן לילה ולא להקפיא למחרת על פי בשלב 4.
4. hNSC הקפאה ואחסון
- יום אחרי passaging, לאחזר את הבקבוקון החממה המכילות את התאים להקפאה (מתוך שלב 3.19 ו 3.22). להטות את הבקבוקון ולהסיר כל מדיום והתאים הבקבוקון והמקום בשפופרת 15 מ"ל. ואז centrifuge את הצינור ב g x 216 במשך 5 דקות.
- במהלך תהליך צנטריפוגה, להכין את ההקפאה בינוני (טבלה 4). כל 5 × 106 תאים להכין 1 מ"ל של מדיום מקפיא. מספר התאים נקבע בשלב 3.19 בעת החלטה על כמה תאים כדי להכניס את הבקבוק. כל אחד. המספר הזה לא השתנו בין לילה.
- להכין הקפאה-שימור צלוחיות עם תוויות של שם התא, מעבר מספר, מספר הטלפון הנייד, ראשי התיבות ותאריך. לאחר צנטריפוגה, להסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה והשהה מחדש תא צניפה קפואים בינונית כך שיהיו 5 × 106 תאים למ"ל. באמצעות פיפטה 5 מ"ל, aliquot 1 מ"ל לכל מבחנה וסיל בחוזקה (5 × 106 תאים לכל מבחנה).
- מניחים צלוחיות במיכל הקפאה-שימרו עליה עם 250 מ של אלכוהול איזופרופיל (מקסימום שימוש של 5 פעמים לכל החלפה של אלכוהול איזופרופיל). מאחסנים במקפיא-80 ° C בלילה, ולאחר מכן להעביר למערכת אחסון מיכל חנקן נוזלי.
5. ציפוי hNSC חסיד עבור אימות
- יום לפני passaging (צעדים 3.1-3.22), לנקות את BSC כמו שלב 2.2, להשיג על צלחת 24-ובכן coverslips זכוכית סטריליים 12 מ"מ דקה.
- באמצעות מלקחיים, במקום של coverslip יחיד על כל הבאר של הצלחת.
- מעיל הבארות המכיל שער גולשת עם 0.01% פולי-D-ליזין (PDL) במים סטריליים, תקופת דגירה של h 1 הלעפה תרוטרפמט 37. צלחת 24-ובכן, להשתמש μL 250 של PDL לכל טוב.
- הסר את PDL מן הבארות ולאחר מכן מעיל עם µg/ס מ 12 laminin/dPBS (250 μL לכל טוב). דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 º C. אם לא צריך ביום המחרת, לאטום את הצלחת עם מצלמות-מיקרוסקופים על ידי ליפוף של מצלמות-מיקרוסקופים בקצוות של הצלחת ולאחסן ב 4 º C.
הערה: צלחות מצופה laminin ניתן לאחסן 2 שבועות אם חתומים עם מצלמות-מיקרוסקופים כל עוד שער גולשת יבש. - מעבר תאים כמו שתואר בשלבים 3.1-3.22, ולאחר מכן לקבוע את מספר תאי זרע המשקולת 24-ובכן עם coverslips מצופה.
- להסיר כל פתרון laminin עודף מבארות דרך שאיפה, לשטוף פעם עם 0.5 מ של dPBS. ואז זרע תאים לתוך הבארות-צפיפות של 0.6-1 x 105 תאים/cm2 לכל טוב. השתמש בכל התאים הנותרים על פי שלבים 3.16-3.21.
- Atvarious פעמים במהלך התרבות צלחת 24-ובכן, לתקן, מכתים את התאים עבור סמני תאי גזע שונות בעקבות צעד 9.
6. הטרמה להשיג נוירונים גאבא, גלוטמט
- המעבר את התאים כפי שמתואר 3.1-3.22, ולאחר מכן לקבוע את מספר תאי זרע לתוך צלחת 24-טוב כמו שלב 5.6.
- יום לפני לקרקע, להכין את שער גולשת צלחת המעיל כמתואר בצעדים 5.1-5.4.
- ביום לקרקע, לאחזר המבחנות המכילות 2-3-יום התאים. למקם את צינור 15 מ"ל, גלולה התאים על ידי צריך שתוציאו ב g x 100 למשך 5 דקות.
- להכין את המדיום לקרקע פקטורי גדילה עוריות/לוקמיה מעכבות פקטור/laminin (ספר) על פי טבלה 5.
- Resuspend תאים עם ספר בינוני.
- זרע מושעה תאים לתוך צלחת 24-טוב (בצע שלב 5.6).
7. הטרמה להשיג מוטורי לגלוקוז
- בצע את שלבים 6.1-6.4.
- להכין את המדיום לקרקע (FHL) של גורם גדילה/הפארין/Laminin בסיסי פיברובלסט על פי המקורות.
- בצע את שלב 5.6.
8. Zika בנגיף
הערה: ZIKV הוא רגיש מאוד לטמפרטורה, אז זה ציווי ZIKV מניות המאוחסנות ב- 80 ° C והקפאת \ הפשרה מחזורים הם נמנעו. תמשיך לעבוד aliquots על הקרח.
- מעבר תאים כמתואר בצעדים 3.1-3.22. 3-4 מליון תאים סך הכל נדרשים כדי להפיץ צלחת 24-ובכן, לכן passaging, מציג את מספר התאים הדרושים להסרת זיהום, זריעה בבקבוקון בעת passaging.
- אם זריעה תאים לתוך צלחת 24-ובכן מכתים, להכין את coverslips ואת צלחת לפי השלבים 5.1-5.4.
- לאחר passaging, מקום 1 מ"ל של התא השעיה מ שלב 8.2 לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL, צנטריפוגה ב g x 200 בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. ואז להסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
- Resuspend צנפה מהשלב 8.3 במלאי ZIKV לרכוש ריבוי של זיהום (MOI) או מאחת עד עשר. עוצמת הקול של ZIKV פתרון לא יעלה על 0.5 mL. לטיפול מעושה (תאים שליטה), resuspend בתאים נפח וסוג זהים בינוני בשימוש במלאי ZIKV.
הערה: זיהום והכנה מניות ZIKV מפורטים של הפרסום הקודם11. זיהומים המדומה מתבצעת גם בינונית. - דגירה מעל התערובת תא/ZIKV ב 37 ° C עבור ה 1 להפוך את הצינור 2 - 3 פעמים, ואז צנטריפוגה התערובת במשך 5 דקות ב 216 x g בטמפרטורת החדר להשיג גלולה תא. Resuspend צנפה dPBS, צנטריפוגה שוב למשך 5 דקות ב g x 216 בטמפרטורת החדר.
- הסר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה, resuspend תאים עם המדיום המתאים, וטען תאים נגועים לתוך הבקבוק או צלחת לצורך הניסוי. אם זריעה התאים לתוך צלחת 24-ובכן resuspend בגדר ב 12 מ של המדיום המתאים, ולאחר מכן להוסיף 500 μL של השעיה מכל קידוח.
הערה: בשלב זה לשמור על תאי צמיחה מדיה כדי לבחון השפעת ZIKV על תאי גזע או ללכת צעדים 6 או 7 כדי לחקור את השפעת ZIKV על תהליך התמיינות.
9. צביעת הליך
- כדי לתקן את התאים, הסר בינוני, לשטוף פעם עם 0.5 מ לכל טוב (24-ובכן צלחת) של קרח קרות באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
- להסיר הציבורית, ולא לכסות תאים עם 0.5 מ של 4% paraformaldehyde ב- PBS ולהשאיר בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות.
- להסיר את paraformaldehyde ולשטוף תאים שלוש פעמים עם 0.5 מ"ל ל- PBS, עוזב על רינס PBS השלישי על 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- בשלב זה להשאיר את PBS על לילה, לאחסן את הצלחת הלעפה תרוטרפמט 4 או להתחיל מכתים לאחר שטיפה 10 דקות.
- לאחר השטיפה 10 דקות PBS, לחסום את התאים למשך 45-60 דקות במצב נייח עם פתרון 0.5 מ"ל של 5% עז נורמלית בסרום (הגדרות), 0.3% אלבומין שור (BSA), 0.25% טריטון X-100 בתוך תמיסת מלח באגירה טריס (TBS). לדוגמה, כדי לגרום 1 מ"ל של חסימת השימוש פתרון: 10 µL של 25% טריטון X-100, µL 50 של 100% המיתרים, 100 µL של 3% BSA מעורב µL 840 של TBS.
- במהלך השלב חסימה, להכין את הפתרון נוגדן ראשוני, מוודא שריאגנטים כל נשמרים בקירור. עבור אימות של hNSCs, חלבונים כגון Nestin ניתן לפלח באמצעות נוגדן המתאים נגדם. כדי לאמת את זיהום ZIKV, השתמש נוגדן כנגד חלבון המעיל ZIKV11. בידול, לשימוש סמנים כגון class III β-טובולין כדי לזהות אוכלוסיות עצביים בעת גליה חלבון חומצי fibrillary (GFAP) יכול לשמש כדי לזהות האסטרוציטים. הריכוזים של נוגדנים הראשי נקבעים מדעית בהתאם ספקים רבים. השתמשנו ברוב בנוגדנים בטחונות כדי דילול 1:2000.
- Centrifuge נוגדן ראשוני ב g x 12,000 למשך 2 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן בצע לדילול; למשל כדי לגרום לדילול 1:1000 נוגדנים, להוסיף 7.2 µL של הנוגדן הרצוי לתוך 7.2 מ של 0.25% טריטון X-100 ב TBS.
- להוסיף כ- 300 µL של נוגדן פתרון כל טוב של צלחת 24-ובכן, דגירה התאים עם נוגדן ראשוני במצב נייח עבור 2 h בטמפרטורת החדר או ב- 4 הלעפה תרוטרפמט בן לילה במצב נייח.
- לאחר הדגירה, לשטוף תאים עם 0.5 מ של TBS שלוש פעמים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כל אחד במצב נייח.
- Centrifuge הנוגדן משני ב g x 12,000 למשך 2 דקות ב 4 ° C, ואז לדלל בפתרון טריטון X-100/TBS 0.25%. להפוך את פתרון מספיק נוגדנים כדי להוסיף 300 µL כל טוב. . הנה, לדלל את שבערך נוגדנים משניים פלורסנט (איור 3).
- אחרי ה-TBS הסופי לשטוף, להוסיף µL 300 של הפתרון נוגדנים משניים מכל קידוח, דגירה בחושך לשעה בטמפרטורת החדר במצב נייח. מנקודה זו ואילך, כל הצעדים חייב להתבצע בחדר חשוך.
- לשטוף את התאים שלוש פעמים עם TBS למשך 10 דקות כל אחד במצב נייח.
- במהלך 10 דקות בכביסה האחרונה, לדלל את סמן גרעיני דאפי גרעיני כתם לריכוז המומלץ ב- TBS (בדרך כלל 1:1,000 - 1:5, 000). להפוך את פתרון מספיק כדי להוסיף 300 µL כל טוב.
- לאחר השטיפה הסופית להוסיף 300 µL של דאפי פתרון טוב לכל, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר במצב נייח. לאחר מכן לשטוף פעם עם 0.5 מ של TBS.
- השתמש בינוני אנטי-לדעוך הרכבה של קרינה פלואורסצנטית ושחרור 1 (10-15 µL) לכל coverslip שימוקמו בשקופית. השתמש בזהירות פינצטה כדי להסיר coverslips מן הבארות צלחת 24-ובכן ומניחים על פני התא למטה על הירידה הרכבה בינונית בשקופית.
- ברגע coverslips ממוקמים על השקופית, מקום השקופית בעל-שקופית שטוח. ודא כי תוויות שקופיות יהיה כל המידע הרלוונטי הדרוש כדי לזהות את התאים במצגת, ואז לכסות על בעל ברדיד אלומיניום כדי לשמור על שקופיות מוגן מפני אור.
- לאחסן את השקופיות הלעפה תרוטרפמט 4 ולאפשר המדיום הרכבה לגבש בין לילה. למחרת, לבחון את השקופית באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי עם מסנן UV-2E/C (340-380 nm), מסנן GFP HYQ BP (450-490 nm) או Y-2E/C טקסס מסנן אדום (540-580 nm), 20 X הגדלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HNSCs בתרבית בשלב המקדימות שלהם יגדל ככל שאינם מחסידי neurospheres (איור 1). מיד לאחר המעבר hNSC, יהיו הרבה תאים בודדים, אשר צבירה, להתחיל הספירות טופס בבימים הקרובים (איור 1A ו 1B). הספירות בריא צריך להיות כ 1-2 מ מ בקוטר של 9-10 ימים בעקבות מעבר (איור 1C). התחומים הצומחים הגדולים מ- 2 מ מ יכול לפתח מרכז כהה, גורמי צמיחה בטווח הבינוני לא יוכלו להגיע התאים במרכז הספרה, וכתוצאה מכך בידול לא רצויים. הספירות בריא מופיעים שקוף ולהציג cilia מדומה מסביב לקצוות של הספרה (איור 1C).
ציפוי neurospheres במשטח חסיד למטרות מכתימים יביא הצמיחה של חסיד הספירות (איור 2 א). ספירות אלו לעלות על פני השטח של כלי השיט תרבות ויש כמה תחזיות המשתרע על פני השטח של כלי השיט, תוך שמירה על כדור מרכזי (איור 2 א). הטרמה המבדילים את התאים דורשים את התאים לדבוק תגית כיסוי בתחתית צלחת התרבות תאים, כגון צלחת 24-. טוב. בעקבות צעדים מתאימים לקרקע תוספת של בידול בינוני, התאים להתפרס על פני השטח של כלי השיט תרבות ולגדול כמו טפט מחוברים של תאים (איור 2B).
כדי לאשר גם את תוקפו של התרבות hNSC או פנוטיפ תאים, ניתן להשתמש אימונוהיסטוכימיה פלורסנט. Nestin הוא פילמנט ביניים בדרך כלל לידי ביטוי NSCs והוא יכול לשמש כדי לוודא hNSC התרבות (איור 3 א). כדי לוודא הנוכחות של נוירונים בעקבות בידול, class III β-טובולין בדרך כלל ניתן להשתמש כדי תווית נוירונים (איור 3B). למרות הצעד לקרקע משמש להשגת אחוז גבוה יותר של נוירונים בעקבות בידול, עדיין יהיו האסטרוציטים בתרבות. גליה fibrillary חלבון חומצי (GFAP) יכול לשמש האסטרוציטים תווית על מנת לכמת איזה אחוז תאים הפכה האסטרוציטים או נוירונים.
מצאנו כי הקו K048 של NSCs היה נגוע על ידי אפריקה ואסיה זנים של ZIKV זוהה על ידי צביעת immunofluorescent עם נוגדן ספציפי ZIKV. נציג התמונות מוצגות באיור4. זיהום מדומה לא זכה שינוי hNSC מורפולוגיה או הישרדות (איור 4A, 4 C). ZIKV נוטה להישאר באזור הפריפריה למוצב יום אחד של תאים נגועים זיהום תוך שעה, אבל ממלאת את כל התא ב- 3-7 ימים (איור 4B4 D, 4E). באופן ניכר, עם אותו למשרד הפנים (0.1), שיעור 5% זיהום מוערך בתאים K048 הוא באופן משמעותי נמוך יותר מאשר אלה דיווח לאחרונה ZIKV זיהום לדרג (עד ל-80%) באנושי העור-induced NSCs7. מחקר זה, דיווח 80% infectivity, משמש את האבטיפוס זן אפריקני של ZIKV (MR766) זה אולי הסתגלו הפנוטיפ neurotropic במהלך מעברים מעל 140 בתאי מוח העכבר.
איור 1: שדה בהיר תמונות של תרבות hNSC. (א-ג) שדה בהיר נציג תמונות שצולמו 10 X הגדלה של hNSC תרבות 1, 4 ו- 9 ימים לאחר passaging, בהתאמה. גודל ברים: 60 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: שדה בהיר תמונות של תרבויות חסיד. (א) נציג שדה בהיר תמונות שצולמו 10 X הגדלה של תרבות hNSC חסיד, 7 ימים לאחר ציפוי. (ב) נציג שדה בהיר תמונות שצולמו 10 X הגדלה של חסיד הבדיל תאים בעקבות ELL לקרקע ו- 9 ימים של בידול. גודל ברים: 60 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תמונות פלורסנט hNSCs ותרבויות הבדיל. (א) פלורסנט להחליפן בתמונות שצולמו 20 X הגדלה של חסיד hNSCs צבעונית עם סמן גרעינית, דאפי (כחול), סמן תא גזע Nestin (אדום). סרגל קנה מידה: 60 מיקרומטר (B) נציג פלורסנט תמונות שצולמו 60 X הגדלה תאים צבעונית עם סמן עצבית βIII-טובולין (ירוק), אסטרוציט יוצר GFAP (אדום) גרעיני סמן דאפי (כחול). גודל ברים: 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: זיהום ZIKV-עוברי אנוש המוח נגזר NSCs. NSCs האנושי גם טופלו תלעג (A ו- C), מחוסן למשך שעה עם זן אפריקאי שושלת היוחסין של ZIKV-MOI של 0.1 (B ו- D), או עם זן אסייתי של ZIKV לאחרונה מבודד יתושים במקסיקו בשנת 2016 (E). צביעת immunofluorescent מזהה תיוג של נוגדנים ZIKV ב NSCs-חיסון פוסט אחד ועד שבעה ימים (dpi 1 ב', 7dpi ברה ו 3 dpi ב- E). סולם הברים מיקרומטר 10 מיקרומטר A-D, ו- 5 ב אי אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| DFHGPS מדיה עבור אחד T75 | 10 מ |
| TPPS * | 173 ΜL |
| מ מ 200 L-Glutamin | 50 ΜL |
| 10 מ"ג/מ"ל אינסולין * * | 25 ΜL |
| גורם הגדילה באפידרמיס µg 20/mL | 10 ΜL |
| µg 20/mL בסיסי פיברובלסט גורם גידול | 10 ΜL |
| µg 10/mL לוקמיה גורם מעכב | 10 ΜL |
| 5 מ"ג/מ"ל הפרין | 10 ΜL |
| * תערובת המכילה 100 µg/mL Transferrin, 100 מיקרומטר putresine, פרוגסטרון nM 20 ו 30 ננומטר סודיום סלניט. התערובת זני מניות מרוכז, aliquots הן המאוחסנים ב- 80 ° C ו- preferablly השתמש בתוך 6 שבועות הכנה. המניות מרוכזים הם transferrin 10 מ"ג/מ"ל, putrescine 30 מ מ, 10 מיקרומטר פרוגסטרון ו- 15 מיקרומטר סודיום סלניט המאוחסנים ב-80 הלעפה תרוטרפמט. | |
| * * אינסולין הוא מומס 0.01 N hydroen כלוריד, מסונן דרך 0.2 µM חלבון נמוכה איגוד מסנן ולאחר המאוחסנים הלעפה תרוטרפמט 4 עד 6 שבועות. | |
טבלה 1: גורמי גדילה החדש התפשטות בינוני.
| dPBS * | 1 מ"ל | 3 מ לb |
| גלוקוז 10% | 60 ΜL | 180 ΜL |
| 2.5% טריפסין | 10 ΜL | 30 ΜL |
| Dnase * * | 5 ΜL | 15 ΜL |
| * באגירה פוספט תמיסת מלח של Dulbecco | ||
| * * Deoxyribonuclease | ||
| עבור 10 מיליון תאים | ||
| b עבור 30 מיליון תאים | ||
טבלה 2: הכנת טריפסין.
| מדיה ממוזגים | 1 מ"ל | 3 מ לb |
| מעכבי טריפסין | 10 ΜL | 30 ΜL |
| עבור 10 מיליון תאים | ||
| b עבור 30 מיליון תאים |
טבלה 3: הכנת מעכבי טריפסין.
| DFHGPS * | 0.7 mL | 2.1 מ לb |
| FBS * * 20% | 0.2 מ | 0.6 מ"ל |
| דימתיל סולפוקסיד * * * 10% | 0.1 מ"ל | 0.3 mL |
| * DMEM, F12, HEPES, גלוקוז, פניצילין-סטרפטומיצין | ||
| * * סרום שור עוברית | ||
| דימתיל סולפוקסיד | ||
| עבור 5 מיליון תאים בקבוקון אחד | ||
| b עבור שלוש מבחנות, 5 מיליון תאים/בקבוקון... | ||
בטבלה 4: הכנת בינוני הקפואים.
| DFGHPS * עבור באר אחת לתוך צלחת 24-ובכן | 1 מ"ל |
| TPPS * * | 17.3 ΜL |
| 200 מ"מ-גלוטמין | 5 ΜL |
| 10 מ"ג/מ"ל אינסולין | 2.5 ΜL |
| גורם הגדילה באפידרמיס µg 20/mL | 1 ΜL |
| µg 10/mL לוקמיה מעכבות פקטור | 1 ΜL |
| 1 מ"ג/מ"ל Laminin | 1 ΜL |
| המכיל DMEM, F12, HEPES, גלוקוז, פניצילין-סטרפטומיצין | |
| * * המכיל 100 µg/mL Transferrin, putresine 100 מיקרומטר, | |
| פרוגסטרון nM 20 ו 30 ננומטר סודיום סלניט | |
טבלה 5: הכנת ELL לקרקע בינוני.
| DFGHPS * עבור באר אחת לתוך צלחת 24-ובכן | 1 מ"ל |
| TPPS * * | 17.3 ΜL |
| 200 מ"מ-גלוטמין | 5 ΜL |
| 10 מ"ג/מ"ל אינסולין | 2.5 ΜL |
| µg 20/mL בסיסי פיברובלסט גורם גידול | 0.5 ΜL |
| 5 מ"ג/מ"ל הפרין | 0.5 ΜL |
| 1 מ"ג/מ"ל Laminin | 1 ΜL |
| המכיל DMEM, F12, HEPES, גלוקוז, פניצילין-סטרפטומיצין | |
| * * המכיל 100 µg/mL Transferrin, putresine 100 מיקרומטר, | |
| פרוגסטרון nM 20 ו 30 ננומטר סודיום סלניט | |
טבלה 6: הכנת FHL לקרקע בינוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היכולת תרבות ולטפל hNSCs מספק כלי קריטי שיכול לשמש למגוון רחב של מטרות של מידול מחלות אנושיות לתרופה תפוקה גבוהה הקרנת10,11,12,14, 15,16,17. שאלות רבות נותרו יש לטפל כמו מוח עוברי אנוש NSCs או הצאצאים שלהם רגישים ZIKV זיהום בין זנים שונים של ZIKV להדביק NSCs עם יעילות שווה, איך זיהום במהלך התפתחות עצבית מתבטא microcephaly. השתמשנו תרבות זו hNSC לחקור Zika וירוס הקשורים neuropathology11,14. באמצעות שלושה זנים של תאים מבודדים מתורמים בודדים שלוש, אנחנו גם יכולים להשוות הבדלים אינדיבידואליים את הרגישות גרעונות שנצפה הבאים ZIKV זיהום11. אחת המגבלות של טכניקה זו היא הנגישות hNSC דגימות, המדיום ממוזגים חיוני עבור תרבות ראוי. כדי לעקוף מחסום זה, אנא צרו קשר עם המחבר המקביל לבצע העברה גשמי כמו התאים המשמשים פרוטוקול זה אינם זמינים מסחרית.
חוץ גופית בתוך מחקרים באמצעות hNSCs לא רק לספק תובנה ייחודית התנהגות בסיסיים תאי גזע, הם גם מספקים פלטפורמה מצוינת לערוך מחקר קליניים. עם זאת, האתגרים הטכניים של culturing hNSCs יכול לשמש מכשול בפני משתמש בהם בתור מודלים לשחזור ויעילים. ב פרוטוקול זה, אנחנו המחולקות השלבים החשובים ומתודולוגיות אשר יכול לשמש כדי להפחית את דרגות השונות culturing שיטות תשואות תרבות תאי גזע hNSC בריא ויציב. חיסרון של שימוש hNSC neurosphere תרבות היא כי התאים מאוד רגישות לגירויים מכל וכל. אפילו עם פרוטוקול מפורט לעיל, חשוב לשים לב עד כמה מטופלות של מבחנות או מנות של hNSCs, subtlest וריאציות על הפרוטוקול יכולים לגרום לשינויים בהתנהגות neurosphere.
החלק המכריע ביותר של שיטות העבודה הוא הקוקטייל של גורמי גדילה והכנה של התקשורת השונים. אם הזמן ההכפלה של התרבות hNSC הוא נמוך מאוד, או adherie תאים רבים לכלי השיט תרבות (כאשר הם צריכים להיות שאינו חסיד), הצעד הראשון כדי להבטיח כי גורמי צמיחה בשימוש הריכוז המתאים, לא פג. כל גורמי גדילה של פרוטוקול זה יש חיי מדף קצרים מאוד פעם הקרת (5-6 ימים). בנוסף, יש להשתמש גורמי גדילה של חברות מרובות ואנו לב הבדלים האיכות ואת ריכוז על מנת לתחזק את התרבות. לכן, מומלץ מאוד באמצעות גורמי גדילה המדויק מפורט בטבלה חומרים. השלב passaging (שלבים 3.1-3.22) הוא גם מקור נפוץ של שגיאה. אם יש הרבה תאים מתים בעקבות תהליך דיסוציאציה, להפחית את מספר הפעמים של pipetting למעלה ולמטה מביצועם התאים, כמו דיסוציאציה גופנית מדי יכול לגרום מוות של תאים. לחלופין, אם ישנם הרבה אשכולות של תאים בעקבות הצעד דיסוציאציה, להגדיל המרץ או מספר פעמים של pipetting למעלה ולמטה, כמו אלה אשכולות יהיה במהירות להפוך כדורים גדולים זה לא יישאר קיימא בתרבות. אם התרבות נשמר כראוי, זיהום עם ZIKV היא פשוטה יחסית.
בזמן זיהום ZIKV הוא הטיפול מפורט של פרוטוקול זה, אפשרי להשתמש במערכת התרבות hNSC עבור מגוון רחב של מחקרים. מערכת מודל זה יכול לשמש מסך סמים, לבדוק רגישות בודדים, ולחקור מנגנונים הבסיסית של מגוון מחלות, בעיות התפתחותיות14. מערכת זו הינו גם אידיאלי עבור גנומית מחקרים מאז התאים בתרבית לא הייתה מניפולציה גנטית ולהראות מעט ללא העיוותים כרומוזומלית, אפילו עד 80 קטעים10,11. אנו מאמינים שמערכת תרבות זו הוא אידיאלי עבור מידול במבחנה כמה גירויים סביבתיים כגון זיהום, סמים, אלכוהול, רעלים, וכו יכולים להשפיע על התפתחות מערכת העצבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים להכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי בכספי קרן ג'ון דאן ס ו המכון זיהומים האנושי חסינות של הענף הרפואי אוניברסיטת טקסס (פ. וו).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission - Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
